Summary
真核生物に見られるものとは異なり、主にそのサイズが小さいなどの細菌内の詳細膜の脱分極とイオン濃度の変化は、測定困難な従来の方法を作ることを研究の不足があります。ここでは、蛍光技術を利用して重要なグラム陽性病原体肺炎連鎖球菌におけるこのようなイベントを監視するための詳細なプロトコール。
Abstract
膜脱分極及びイオンフラックスはエネルギー論およびシグナル伝達を含む深く細胞機能に影響を与えるそれらの能力に起因する生物系において広範に研究されているイベントである。電極の使用法およびパッチクランプの両方を含む蛍光および電気生理学的方法は、周知の真核細胞におけるこれらの事象を測定するために開発されてきたが、微生物中で同様のイベントを測定するための方法はより複雑と組み合わせて、その小さなサイズが指定されて開発することがより困難なことが証明されている膜を遮蔽する細菌の外表面。 肺炎球菌 （肺炎球菌）における死の開始の我々の研究の中、当社は、極性の変更、整合性、および細胞内のイオン濃度を含む膜イベントの役割を解明したいと考えました。文献の検索、我々は非常に少数の研究が存在することがわかった。他の研究者らは、イオンインフルエンザを測定するための放射性同位元素の取り込みや平衡を監視していた主にグラム陰性生物におけるXESと膜電位との研究の限られた数は、膜電位を測定するためのカルボシアニン又はオキソノール蛍光色素を用いてある程度の成功を見て、またはイオン感受性の細胞透過性アセトキシメチル（AM）エステルバージョンで細菌をロードした蛍光指示薬色素。したがって、我々は、グラム陽性生物S.、膜電位、破裂、及びイオン輸送を測定するためのプロトコルを確立し、最適化肺炎連鎖我 々は、ビス-オキソノール色素DiBAC 4を使用してプロトコルを開発した（3）および細胞非透過性色素ヨウ化プロピジウムは、それぞれ、膜の脱分極および破裂を測定するための方法、ならびに最適レシオメトリック色素のAMエステルと肺炎をロードするフラ-2、PBFI、蛍光検出プレートリーダーを用いて、それぞれのCa 2 +、K +、およびH +の細胞内濃度の変化を検出するためのBCECF。これらのプロトコルは、肺炎球菌のための彼らの初のである及びこれらの染料の大部分は、他の細菌種に使用されていない。我々のプロトコルは、S.のために最適化されてきたが肺炎球菌は 、我々は、これらのアプローチは、他の細菌種における同様の研究のための優れた出発点を形成すべきであると信じています。
Introduction
我々の研究室では、腫瘍細胞においてアポトーシスを誘導する（腫瘍細胞に対して致死メイドヒトα-ラクトアルブミンの場合）HAMLETというヒト乳由来のタンパク質-脂質複合体を同定するだけでなく、細菌種の1,2種々を殺すことができるしている。特に敏感であることが判明した種は、最大の感度と死2,3のアポトーシス様表現型を示す肺炎球菌 （肺炎球菌）で、気道を標的とするものだった。膜脱分極および特定のイオン輸送イベントは、真核細胞におけるアポトーシスの間に十分に説明され、重要なイベントである、放射性TPP +イオンおよびJC-1とTMREを含む蛍光色素は、ミトコンドリア膜3の脱分極を示すために使用されてきたミトコンドリア、特に-5。そこで、我々は我々の努力を集中として肺炎球菌におけるこれらの膜関連機能に対するハムレットの影響についての詳細を学ぶために求められてプロセスにおける新規抗菌治療法やワクチン候補を識別するための大きな可能性を秘めた、細菌におけるアポトーシス様の表現型の機構部品のよりよい理解を開発しています。
我々の機構的研究のためのプロトコルを確立しようと、我々は、真核生物系において十分に記載された方法論とは対照的に、細菌膜6,7の電気生理学およびイオン輸送メカニズムを詳述した非常に少数の公開された研究があることを発見した。これは主に小さい微生物の大きさとその表面構造、巨大プロトプラストを用いたいくつかの研究は、混合成功を用いて実施したが、特に細胞壁の存在、すなわち、パッチクランプ法のような従来の真核生物の方法を使用するための膜のアクセスを制限することに起因する8,9。それは人間を必要とするため、これらの巨大プロトプラストとの仕事は、ほとんどの細菌種のための理想的な、あるいは現実的な方法ではないので、ipulated細菌は、非天然および非生物状態で、実行された細菌細胞膜の極性の制限された研究は、主に、フローサイトメトリーを採用しており、シアニン、オキソノール蛍光染料の使用は、10-16。
単一時点に一つの細菌から個々の蛍光測定値を収集する、フローサイトメトリーの代わりに、我々は、時間の経過、96ウェルプレート形式で細菌懸濁液の蛍光強度を検出する蛍光検出プレートリーダーを使用することを選択した。これは、はるかに大きく単純かつ容易に種々の時点での細菌の集団を処置するため、連続的フローサイトメトリーを用いて達成することは困難であり、長期間にわたって集団全体の蛍光動力学を監視することができた。 （ミトコンドリアと共に使用するための上記のものを含む）の電位感受性蛍光色素の様々なテストした後、我々は、使用した最高の技術的かつ実用的な成功を達成し極性の変化を監視するDiBAC 4と呼ばれるビス-オキソノール色素（3）（ビス- （1,3 -ジブチル酸）トリメチンオキソノール）。
我々はまた、貴重同時に、ヨウ化プロピジウム（PI）を用いて、膜の完全性の混乱を監視することを見出した。この色素は、核酸に結合すると蛍光を発するが、細菌細胞膜の完全性は、それ生死染色アッセイにおいて、死細胞を検出するために使用される一般的成分作り、危険にさらされたときにこれを行うことができるだけである。 PIに加えて、緑色およびTO-PRO-1、SYTOXアクションが類似していると以前にフローサイトメトリー検出法17を用いて、いくつかの研究中の細菌のために使用されている蛍光染料である。私たちは、私たちは与えられたサンプル中DiBACと同時にその蛍光をモニタリングすることができ、その励起波長にPIを使用することにしました。
我々の研究では、我々は、ハムレットのほか、殺菌作用を持つ別の関連タンパク質 - 脂質複合体を観察している肺炎球菌3,18,26の処理時の両方の色素の蛍光の増加によって示されるように、細菌の膜の脱分極や破裂を誘発さELOA、として知られている。両方の複合体のために、我々はDiBAC 4の蛍光強度（3）脱分極が破裂する前に発生したことを示す、前のPIの強度の増加に増加し、であることが観察され、したがって、我々の殺菌性タンパク質-脂質複合体により誘導される特定のイベントインタレスト。この区別は、膜の破裂などの自体が非特異的な脱分極を引き起こす可能性があり、確認することが重要です。測定及び分析の両方DiBAC 4（3）及びPI蛍光動態同時にボランティア蛍光法の代わりに、フローサイトメトリーを使用することのさらなる利点である二つの膜事象との間のこの関係を調べることができた。
細菌イオン流出を監視するには、の取り込みを測定するなど、放射性同位元素を使用して以前のいくつかの成功があった45 Caの我々はまた、我々の最近の研究18、21で使用した肺炎球菌19,20、2 +。しかしながら、これらの放射性イオンでの作業は、いくつかの欠点を有する。彼らは、高価な時間がかかり、厄介であることができ、また、目的の同位体に依存して、危害を加える実験を行う個体を露出させることができる。さらに、それは経時的に急激な変化を監視することは困難である。したがって、我々は、イオン感受性蛍光指示薬色素のアセトキシメチル（AM）エステルのバージョンを採用して測定する別の方法の方を向いて。単独で、指示色素が充電され、容易に膜を通過しないが、親油性のエステル基を加えて、今非荷電分子は細菌の膜を通過することができる。内部に入ると、細菌エステラーゼは有意に細胞を終了する能力を遅らせ、染料tを可能にする、細胞内の遊離し、再荷電染料を残して、エステル基を開裂Oは、時間の経過とともに内部に蓄積されます。しかしながら、これらのエステル色素の使用は、負荷検出、および成功種々の方法を用いて、細胞内Ca 2 + H + 22-24と16の変化を検出するために、いくつかの細菌種に記載されている。
細胞内Ca 2 +の変化やS.においても、K +及びH +レベルを監視したいという要望とハムレットおよび他の化合物で処理すると、肺炎は 、我々が正常に効率的に細菌細胞に蛍光指示薬色素をロードするためのプロトコルを作成しました。陰イオントランスポーターとPowerLoad、積載効率を高めライフ·テクノロジーズからの独自の化合物をブロックすることにより、色素の保持を増加させ、両方のプロベネシドを必要とした細菌に効果的なローディング。 （K +を検出）のFura-2/AM（Ca 2 +の検出 ）、PBFI / AM、およびBCECF / AM（のH +を検出）が成功裏にカプセル化されていないと、カプセル化の両方肺炎球菌STにロードされた蛍光検出プレートリーダー18、21を用いて（K +脱共役剤）およびCCCP（H +共役剤）をバリノマイシン、例えばイオノマイシン（Ca 2 +の脱共役剤）などのイオノフォア、添加後に得られた蛍光パターンの測定を可能にする雨。
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Protocol
1。細菌培養の準備
- 実験に使用するための培養物を増殖させる
- 37℃の加熱ブロック中、Sの凍結ストックバイアルを解凍する肺炎球菌と新鮮なの9ミリリットルに、そのコンテンツを追加するには、ガラス培養管中の10ミリリットルの全容量0.5％酵母エキス（THY）とトッド·ヒューイットブロスを予め温め。
- 文化が対数中期（ABSの600nmの ≈0.5-0.6）に達するまで37℃で静的にインキュベートする。
2。膜脱分極および破裂を検出する
- 試薬の調製
- DiBAC 450μMの株式（3）100％のDMSO中、および蒸留H 2 O中のPIの2 mg / mlのストックを調製DiBAC 4（3）ストックは少なくとも6ヶ月間、-20℃で安定である。 PIストックは、少なくとも6ヶ月間、4℃で安定である。
- 光から保護するために、ホイルに株式を包む。
- 荷重細菌
- 2,400×gで再度室温で10分間2,400×gで遠心分離することによって、ステップ1.2.2からの細菌細胞をペレットにし、上清を除去することによって二回洗浄し、1×リン酸緩衝生理食塩水（PBS）10mlにペレットを再懸濁し、遠心10分間。
- 上清を除去し、元のボリュームになるようにPBSでペレットを再懸濁します。これは、1mlあたりの細菌の約10 8コロニー形成単位を提供します。洗浄した細胞の（5サンプルのための十分な）1ミリリットルを取り外し、マイクロ遠心チューブに入れる。
- これらの細胞を、25 mMグルコースの最終濃度（のddH 2 Oで調製し、0.45μmのフィルターで濾過したもの）のグルコース、1Mフィルター滅菌ストック溶液25μlを追加し、37℃のヒートブロックでインキュベート15分間。注：これは、すべてのATP依存性膜チャネルと細胞成分のためのエネルギーを提供します。このステップの必要性は実験に応じて、変化し得る。
- 50μMのDiBAC 4（3）株式の5μLおよび2 mg / mlのPI株式の10μlを加える。これは、それぞれ、250nMの最終濃度および20μg/ml/ mlで提供する。上下にピペッティング数倍よく混ぜる。透明な96ウェルプレートの各サンプルウェルにこの細胞懸濁液200μlを加える。
- 蛍光を検出する
- 予め温めた（37℃）の蛍光検出プレートリーダーに置き板。
- 適切なフィルタがDiBAC 4（3）（490nmの励起、516 nmの発光）とPI（535 nm励起、617 nmの発光）検出のための所定の位置にあることを確認してください。
- 測定値が安定するまで（3）膜の上に、約30〜40分ごとに分蛍光測定値を取るためにリーダーを設定するか、DiBAC 4の平衡を（そして同時にモニタ）を可能にするために、これは「前処理」読書として機能します。
- プレートを取り出し、選択とIMMEDの実験エージェントを追加iately DiBAC 4時間の所望の長さのための（3）とPI蛍光の監視を継続するためにリーダーにバックプレートを配置。一度に複数のサンプルを処理する場合は、マルチチャンネルピペットを使用すると、すべてのウェルに同時にエージェントを追加すると便利です。
- Microsoft Excelなどのデータ解析プログラムに測定値をエクスポートします。膜の脱分極や破裂を評価するための時間をかけてプロット蛍光。 DiBACとPIの増加蛍光が脱分極し、破断が発生していることを示しています。
3。細胞内Ca 2 +又はK +濃度の変化で検出
- 準備試薬およびローディングバッファー
- 以下の試薬を準備し、イオン感受性蛍光色素の5 mMストック（Fura-2/AMをまたはPBFI / AM、染料の50μgの入ったチューブをDMSOの適切な量を追加します）、「100X」プロベネシド（1を追加77 mgのバイアルへのPBS）。可溶化染料は、-20°Cで凍結し、一度プロベネシドは6ヶ月間、-20℃で溶液中で安定であるのに対し、3ヶ月間、溶液中で安定であることができる。
- 以下のように2倍がバッファをロードする1ミリリットルを準備します。15ミリリットルのプラスチックコニカルチューブの底では、5 mMのイオンの2μLが続く（6ヶ月2〜8℃で安定）100X PowerLoad濃縮物の20μLを分注直接PowerLoadへの感受性色素。渦を簡単に混合する。 100Xプロベネシド20μlの続くのPBS 960μLを加える。混合物を最後に1回ボルテックスする。光から保護するために、ホイルで包みます。
- 色素で細菌をロード
- ペレットと2.2.1で説明したように中間対数期の細菌培養を洗う。 「2X」細胞懸濁液を作るために5mlのPBSで上清とペレットを再懸濁して削除します。
- 2Xロードバッファへの2倍の細胞懸濁液の1ミリリットルを追加します。これを2mlの最終容量、および最終concentrのために提供する1X PowerLoad、5μMの蛍光色素、及び1Xプロベネシドの管理ポイント。注：各測定用試料ウェル200μLを含むことになるので、この懸濁液を10サンプルのための十分な音量を提供します。
- 遮光して75分間37℃の水浴でインキュベートする。注：染料は、任意の解糖基質の非存在下で染料の流出を最小限にするプロベネシドの存在下で細菌細胞にロードされる。
- 洗浄1：ペレット10分間2400×gの遠心分離により細胞、上清を除去し、2ミリリットル1Xプロベネシドを含むPBS中に再懸濁します。洗浄2、3：リピートステップ3.2.4 2倍。さらに30分間37℃でインキュベートする。これは、細菌のエステラーゼのための時間が離れて内面化蛍光性色素の中から、AMエステル基を加水分解することができます。
- WASH 4：、10分間2400×gの遠心分離により細胞をペレット上清を除去し、再懸濁1Xプロベネシドを含有するPBS 2ml中。注：experimeによってはNT、グルコースは、細菌を再活性するためにここに戻って追加することができます。
- 蛍光を検出する
- 37℃まで蛍光検出プレートリーダープレートリーダーを予熱し
- 所望の各サンプルについて、96ウェルプレートのウェルに（ステップ3.2.8）からロードされた細胞を200μlを加える。 （一度に1ウェル/サンプルの完了には、次の手順を実行します）。
- 少なくとも（「値1」と「値2」のために380 nmの励起/ 510nmの発光340 nmの励起/ 510nmの発光）、蛍光を測定する蛍光検出プレートリーダーでよく、場所プレートの読みのベースラインを確立する1分ごとに秒。
- プレートを取り出し、（約5μLの少量の）だけでなくそれに最適な治療法を追加し、すぐにピペットを数回上下混合し、すぐに目的のためにあらゆる秒の読み取りに蛍光検出プレートリーダーに戻し置く時間の長さ。 （Ifにおいて、プレートリーダーに関連付けjectors）は、これらはまた、シームレス読み出しを停止し、プレートを吐出する必要がなくなり、所望の処理を追加するために使用することができ、利用可能である。
- Microsoft Excelなどのデータ解析プログラムに測定値をエクスポートします。値2で値1を分割して、各時点についての蛍光値の比を計算し、グラフ上の比の値をプロットする。
4。細胞内pHの変化を検出する
- 調製試薬およびキャリブレーション·バッファ
- 以下の試薬を準備します。BCECF / AM（この株は3ヶ月間-20℃で安定している色素の50μgの入ったチューブにDMSOを適切な量を追加します。）の5 mMストック、100Xプロベネシド（の1ミリリットルを追加77 mgのバイアルに、PBS）を、エタノール中ナイジェリシンの1 mM保存準備周囲の緩衝液のpHに対する細胞の（細胞内pH（pHが私を平衡に必要）このストックはS6ヶ月間-20℃）での表、。、DMSO（プロトン駆動力を切り離すプロトノフォアにおけるカルボニルシアニド3 - クロロフェニル（CCCP）の0.5 mMストックはこのストックは、6ヶ月間、-20℃で安定している）
- 135のKH 2 PO 4月 20 日のNaOH（一塩基）および110 mMのK 2 HPO 4月 20 日のNaOH（塩基）：以下の高カリウムバッファの10ミリリットルを用意します。フィルターは、0.45μmのフィルターを用いて滅菌する。 （これらのバッファは、使用するまで4℃で保存することができる）。
- 6.5から8.0の範囲の、少なくとも5〜6のpH値で高カリウム緩衝液を作成するために必要な割合で高カリウム緩衝液を混合する。
- 次のようにバッファをロード2Xの1ミリリットルを準備します。15ミリリットルのプラスチックコニカルチューブの底では、100X PowerLoad40μlのを分配、直接PowerLoadに5 mMのイオン感受性色素を20μl続く。渦を簡単に混合する。 100Xプロベネシド40μlの続くのPBS 900μLを加える。 VORT元の混合物を最後に1回。光から保護するために、ホイルで包みます。
- 色素で細菌をロード
- ペレットとは、2.2.1で説明したように中間対数期の細菌培養の8ミリリットルを洗う。上清、「4X」細胞懸濁液を作るために2mlのPBSに再懸濁ペレットを削除します。
- 2Xロードバッファへの4倍の細胞懸濁液の1ミリリットルを追加します。これは2ミリリットルの最終容量、および2X細胞の最終濃度は、2倍PowerLoad、50μMの蛍光色素、及び2Xプロベネシドを提供します。
- 遮光して40分間30℃の水浴でインキュベートする。 NOTE：染料は30℃より低い温度で、染料の流出を最小限にする任意の解糖基質の非存在下で細菌細胞中にロードされる。
- 洗浄1：ペレット10分間2400×gでの遠心分離により細胞が、過剰な色素を取り除くために上清を除去し、4ミリリットルのPBSに再懸濁2XプロベネシドAを含むND 1 mMグルコース（細菌をreenergizeため）。 WASH 2、3:4 mlのPBS（1×細胞の最終濃度のため）中の最終的な再懸濁を2×プロベネシドおよび10mMグルコースを含有するで2回繰り返して、ステップ4.2.7。
- 5分間37℃でインキュベートする。これは、細胞が完全に活性化し、離れて内面化BCECF出身エステル基を切断するために、細菌のエステラーゼのための時間を確保することができます。
- バックグラウンド蛍光を確立し、 インビボ較正曲線で
- 37℃まで蛍光検出プレートリーダープレートリーダーを予熱し
- バックグラウンド蛍光を決定するために、細菌を除去し、96ウェルプレートのウェルにろ液を200μlを追加する（ステップ4.2.7）からロードされたと通電細菌懸濁液を約500μlのフィルター滅菌する。
- （490 nmの励起/ 530 nmの発光が蛍光を測定するための蛍光検出プレートリーダーにプレートを置き1分間の「値1」と「値2」のために440 nmの励起/ 530nmの発光）。このバックグラウンド蛍光は、較正曲線と実験サンプルの両方の比率の計算の前に減算されるべきである。
- in vivoでの検量線を得るためには、（6.5から8.0の範囲）に異なるpH値で、一度、高カリウム緩衝液中で再懸濁ステップ4.2.7からロードされ、通電細胞の500μlのアリコートを洗う。
- 周囲の緩衝液のpHに対する細胞の細胞内pHを平衡化し、5分間37℃でインキュベートした試料を20μMのナイジェリシンを追加します。 96ウェルプレートのウェルに200μlの細菌の/ pH緩衝液の組合せを追加します。
- 各ウェルのための安定した読み取りを確立するために数分間の蛍光を測定する蛍光検出プレートリーダーにプレートを置きます。 Microsoft Excelなどのデータ解析プログラムに測定値をエクスポートします。
- BAを差し引いckground蛍光値、値2で値1を分割して蛍光値の比を計算する。検量線を作成し、各pH緩衝用の比の値をプロットする。 （細菌にロードされた蛍光色素の量が毎回変化するように較正曲線は、ロードされたセルのすべての新しいバッチのために生成されるべきである）。
- 細胞内pHの変化を測定する
- 所望の各サンプルについて、96ウェルプレートのウェルに（ステップ4.2.7）からロードされたと通電細胞を200μlを加える。
- 蛍光検出プレートリーダーにプレートを置き、5分間ごとに5秒のサンプルの蛍光を測定する。
- プレートを取り出し、他のウェルへの関心の1つのウェル（細胞内pHを低下させるためのポジティブコントロールとして機能）と実験の薬剤を10μMのCCCPを追加します。正確に時間をかけてその効果を比較するために、AMを使用して、同時に選択のCCCPとエージェントを追加ultichannelピペット。
- 直ちにプレートリーダーにプレートを戻し、10分間蛍光ごとに5秒を計測し続ける。追加の対照として、プレートを取り出して、周囲の緩衝液のpHに細菌のpH Iを平衡化するためにすべてのサンプルに、20μMニゲリシンを追加し、5分間読み取っ。
- バックグラウンド蛍光値を差し引いた後、各サンプルの蛍光の比率を計算する。較正曲線から、各読み取りのためのpH iを補間する。
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Representative Results
すべての実験のために、1サンプル、各ウェルに存在する条件のセットがあります。このように、各トレースが経時細菌の全集団の蛍光強度を表す。結果は、処理されたサンプルと未処理の対照のそれの蛍光を明確に区別して、容易に解釈すべきである。動態および蛍光の観察された変化の程度は、監視される事象の可能なメカニズムと程度に関する情報を提供することができる。
膜極性を探索すると、細菌は、治療前の安定した減少と、図1Aにおける蛍光のその後のレベリングによって示されるように、膜上の色素の平衡化を可能にするために、約40分間DiBACと共にインキュベートされる必要がある。 図1Bに示されているように、その蛍光シグナルが最初の40分間のインキュベーション、BUを通じて安定しているように、PIは、平衡化を必要としないDiBACとともに、その存在が極性と同時に破水を監視すると便利ですトン。脱分極および細菌の破裂は、両方の色素の蛍光強度の上昇によって示されます。このような界面活性剤（デオキシコール酸ナトリウム18）、脱共役剤、又はイオノフォア（CCCP）のような脱分極および破裂可能な他の薬剤もまた、この方法論を使用してこれらのイベントを実証するために添加され得る。
K +（ 図3、Fura-2/AMを、PBFI / AM、およびBCECF / AMについては、二つの蛍光シグナルの比を算出し、この比率の増加または減少は、細胞内Ca 2 +（ 図2）に対応）と、H +（ 図4）の濃度であった。カルシウムイオノフォアイオノマイシンを添加すると、のCa 2 +は、蛍光比（ 図2）の増加を引き起こす細胞内に流入する。バリノマイシンの添加は、Kを引き起こし、逆の効果を有する+細胞から流出し、蛍光比（ 図3）の減少によって示される細胞内濃度を減少させる。 BCECFは、第既知のpHの種々の緩衝液の存在下での検量線（ 図4A）を作成することによって、細胞内pHの測定を可能にする。プロトン勾配（ 図4B）を崩壊プロトノホアのCCCPまたはナイジェリシンの添加後に見られるように、色素の蛍光比の低下は、pHの低下に相当する。
図1。膜摂動を監視する。S. 肺炎連鎖球菌は、m個の上DiBACの平衡化を可能にするために40分間同時に（A）DiBACおよび（B）PIと共にインキュベートしたembrane。このインキュベーションの最後に（ 矢印 ）で、PBS（未処理）、またはハムレット（処置）を添加し、サンプルをさらに1時間読み取った。 拡大画像を表示するにはここをクリックしてください。
図2。細胞内カルシウムレベルの変化を検出する。肺炎球菌は、Fura-2/AMを用いてロードされ、（未処理）PBSまたはカルシウムイオノフォアイオノマイシン（陽性対照）（ 矢印 ） で処理した。蛍光値の比が提示されます。 拡大画像を表示するにはここをクリックしてください。
図3細胞内カリウムレベルの変化を検出する。肺炎球菌は、PBFI / AMを負荷し、PBS（未処理）またはカリウムイオノフォアのバリノマイシン（陽性対照）（ 矢印 ） で処理した。蛍光値の比が提示されます。 拡大画像を表示するにはここをクリックしてください。
図4。細胞内のプロトン濃度の変化を検出する 。細胞内pH校正の（A）標準曲線（B）肺炎球菌は、pH感受性色素BCECF-AMを負荷し、そしてあった洗浄し、PBS +のグルコース中で再懸濁した。ベースラインの読みを記録した後、最初の矢印で、PBS（黒）、プロトノフォアのCCCP（100μM）、又はHAMLET（100μg/ mlの又は6μM）は、細菌に添加し、蛍光を経時的に測定した。第矢印ナイジェリシン（20μM）で完全にすべてのサンプルの膜貫通プロトン勾配を消散させるために追加されました。 拡大画像を表示するにはここをクリックしてください。
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Discussion
極性およびサイズが、膜および細菌内のイオン濃度の変化の整合性の変化を検出するために古典的な電気生理学的方法を用いて提示するための制限にかかわらず、我々は、S.、これらの事象を測定する方法を記載している肺炎連鎖球菌は、蛍光色素を用いた。私たちのプロトコルは、肺炎球菌、一般的に細菌種について記載したいくつかの一つのために記載し、その種の最初のです。蛍光検出プレートリーダーを用いて、これらのイベントは、経時的に細菌の個体集団から検出された蛍光と、細菌の小さい、200μlの体積の試料中で測定することができる。蛍光強度の変化速度及び定性的膜極性又は完全性、または細菌内でのCa 2 +、K +、またはH +のレベルに何が起こっているかを決定するために使用することができる。定量的に言えば、蛍光強度値も依存度を計算するために使用することができるolarization、破裂、カルシウム取り込み、カリウム流出、又はpHの変化は、目的の機構に関する重要な情報を提供し、別のものに比較して1つの試料において観察。さらに、我々のプロトコルは、細菌種の様々な他の細胞事象の様々な研究を可能にし、他のAM蛍光色素をロードするための出発点として有用である必要があります。我々はすでに、黄色ブドウ球菌 21でこれらのプロトコルのいくつかを適用することに成功している。
AM色素を使用する場合は、十分なインキュベーション時間は、色素負荷および細菌内の標的イオンに対応し、対応する蛍光の変化を得るために必要な染料その後の加水分解を達成するために重要である。ローディング速度は、細菌の表面構造の違い（排出ポンプのカプセルの存在下、膜流動性、存在、 等 ）を含むいくつかの要因及び化学構造oを内細菌株の間で変化し得るF染料。インキュベーション時間、インキュベーション温度、栄養素利用、PowerLoad濃度、およびプロベネシド濃度の細菌株および目的の染料のための最大限の負荷を達成するために、などの変調を必要とすることが我々のプロトコルのいくつかのパラメータがあります。成功したローディングを得るために、蛍光シグナル強度は、このようなイオノフォアの添加陽性対照は、正しい方向に信号を提供することを示す、および/または較正曲線の直線性を示すよりも重要である。染料の押し出しを避けるために温度の低下に続いてPowerLoadの増加やProbenicide濃度を最適化するためにロードすると、信号を混乱させるであろう細胞外染色をもたらし得る色素濃度を増加させることが好ましい。私たちのプロトコルの開発時には、我々が正常に野生型カプセル化された肺炎球菌菌株D39とカプセル化されていない株のR36A 25の両方に興味のある私たちの染料をロードすることができました。しかし、我々はより高いPowerLoadとプロベネシド濃度と相まって低いインキュベーション温度がよりよいのために働いている間、増加のFura-2のためにR36Aを使用して比率および37℃のインキュベーション温度を使用してPBFI実験につながる蛍光測定値によって示されるように、我々は、最適な負荷を達成できることを見出したD39へのBCECFのロード。特定の信号強度は実験間で変化し得るが、測定値のレシオメトリックな性質は、高い再現性と小さな広がりを有する結果が得られた。
サンプルの蛍光測定のために、最先端のプレートリーダーのソフトウエアの使用は、いくつか例を挙げると、検出速度などの検出パラメータ、検出感度の種々の調整を可能にし、継続時間を読み出す。これは研究者が監視されている特定のイベントを検出するための最適な感度を見つけることができます。結果の最適な解釈のためには、フッ素の安定したベースラインが重要ですescenceおよび線形標準曲線は、膜上に存在する平衡化した染料の量でアッセイ間の変動があり得るように、確立された、または細菌にロードされ、加水分解される。 （3）治療前に安定化蛍光レベルを可能にするためにDiBAC 4を使用するときに前にどのような種類の治療に細菌膜上の色素平衡化のための時間を許可することは特に重大である。試験される細菌懸濁液中に導入する実験的な添加剤はそれ自体が検出の特定の波長でもよく、自家蛍光の非特異的蛍光を変更することができるように、また、それぞれの個々の分析における適切なコントロールをすべて含めて、正確なデータ分析のために必須であるインジケータは、直接相互作用を介して染める。
我々は、ここで説明している方法に関連する懸念のいくつかの潜在的な分野を認識しています。カルボ色素DIOC 2（3）、DiBAC 4（とは異なり、（3）できないDiBAC 4、カルボ色素が細胞容積の変化を考慮することはできますが、3）、レシオメトリックではないビスオキソノール色素である。従って、細胞体積の変化に対応する蛍光のレベルの変化があってもよい。肺炎球菌は、細菌を破裂させることなく、ボリュームの大幅な変更が許可されていない硬質の細胞壁を持っているように、我々は、しかし、これは重大な問題であると気付かなかった。細菌のイオンフラックスを調べるため、イオン感受性色素の感度は、目的のイオンおよびその濃度の変化の度合いに応じて変えることができる。さらに、蛍光染料の使用は、放射性同位体の使用のような直接法として実験的にではない。放射性同位元素の使用に関係する両方の財政と安全関連の制限を考慮した場合しかし、目的のイオンに応じて、蛍光を調べると、はるかに現実的な選択肢である。そこで、本稿で説明した方法論は、新規で一貫性のあるアプローチを提供より良い勉強膜極性、整合性、およびトランスポートイベントおよび細菌系でES。
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Disclosures
著者らは、宣言する競合する金融利害関係はありません。
Acknowledgments
この作品は、ビル＆メリンダ·ゲイツ財団（助成53085）、JR Oishei財団、米国肺協会（助成金のRG-123721-N）APHにし、EACにNIH（NIDCD）フェローシップF31DC011218によってサポートされていました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Todd-Hewitt broth | Bacto, BD Diagnostics | 249240 | |
| Yeast Extract | Bacto, BD Diagnostics | 212750 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS; pH 7.2) | Invitrogen (GIBCO) | ||
| Dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | D5879 | DMSO |
| DiBAC4(3) (bis-(1,3-dibutylbarbituric acid) trimethine oxonol) | Molecular Probes | B-438 | |
| Propidium Iodide | Sigma-Aldrich | P4170 | Make up in deionized water |
| D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | ||
| PowerLoad | Molecular Probes | P10020 | 100x concentrate |
| Probenecid | Molecular Probes | P36400 | Make 100x stock by adding 1 ml of PBS to one 77 mg vial |
| Fura-2/AM | Molecular Probes | F1221 | Special packaging (50 µg aliquots) |
| PBFI/AM | Molecular Probes | P1267 | Special packaging (50 µg aliquots) |
| Nigericin | Sigma-Aldrich | N7143 | |
| KH2PO4 | JT Baker | 3246-01 | monobasic |
| NaOH | JT Baker | 5565-01 | |
| K2HPO4 | JT Baker | 4012-01 | dibasic |
| BCECF/AM | Molecular Probes | B1170 | Special packaging (50 µg aliquots) |
| CCCP | Sigma-Aldrich | Protonophore that causes an influx of H+ into the cytoplasm, dissipating the electrical potential and the H+ gradient. | |
| Culture tube | VWR | 53283-802 | Fits the Spectronic spectrophotometer; borosilicate glass |
| Spectrophotometer | Thermo Scientific | Spectronic 20D+ | |
| 15 ml Plastic conical tube | Corning | 430790 | |
| Clear 96-well polystyrene microtiter plate | Fisher Scientific | 12-565-501 | |
| Plate reader | BioTek | Synergy 2 Multi-Mode | |
| Gen5 software | BioTek | Gen5™ Software |
References
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