Summary
على عكس ما تشهده لحقيقيات النوى، وهناك ندرة في الدراسات التي الاستقطاب الغشاء التفاصيل وتركيز أيون التغييرات في البكتيريا، في المقام الأول وصغر حجمها يجعل الأساليب التقليدية لقياس صعوبة. هنا، ونحن البروتوكولات التفاصيل لرصد مثل هذه الأحداث في الغرام إيجابية هامة الممرض العقدية الرئوية باستخدام تقنيات مضان.
Abstract
الاستقطاب الغشاء والأيونات تدفقات هي الأحداث التي تمت دراستها على نطاق واسع في النظم البيولوجية بسبب قدرتها على التأثير بعمق الوظائف الخلوية، بما في ذلك علم الطاقة وtransductions الإشارة. في حين أن كلا أساليب الفلورسنت والكهربية، بما في ذلك استخدام القطب والتصحيح، لقط، تم متطورة لقياس هذه الأحداث في الخلايا حقيقية النواة، ومنهجية لقياس أحداث مماثلة في الكائنات الحية الدقيقة أثبتت أكثر تحديا لتطوير نظرا لحجمها الصغير في تركيبة مع أكثر تعقيدا السطح الخارجي للبكتيريا يحمي الغشاء. خلال دراساتنا من الموت الشروع في العقدية الرئوية (المكورات الرئوية)، أردنا توضيح دور الأحداث الغشاء، بما في ذلك التغيرات في قطبية، والنزاهة، وتركيزات أيون بين الخلايا. البحث في الأدب، وجدنا أن عدد قليل جدا من الدراسات وجود لها. وكان المحققون أخرى رصدها امتصاص النظائر المشعة أو التوازن لقياس انفلونزا أيونXES وغشاء المحتملة وعدد محدود من الدراسات، ومعظمها في الكائنات سالبة الجرام، قد شهدت بعض النجاح باستخدام carbocyanine أو oxonol الأصباغ الفلورية لقياس غشاء المحتملة، أو تحميل البكتيريا مع خلايا acetoxymethyl نفيذ (AM) إصدارات استر حساسة ليثيوم مؤشر الأصباغ الفلورية. لذا أنشأنا والبروتوكولات الأمثل لقياس غشاء المحتملة، وتمزق، وايون النقل في الحي إيجابية الجرام S. الرئوية. طورنا البروتوكولات باستخدام الصبغة مكرر oxonol DiBAC 4 (3) وخلايا الصبغة impermeant يوديد propidium لقياس الاستقطاب الغشاء وتمزق، على التوالي، فضلا عن أساليب لتحميل أمثل المكورات الرئوية مع استرات AM من الأصباغ ratiometric FURA-2، PBFI، وBCECF للكشف عن تغيرات في تركيزات داخل الخلايا كا 2 +، K +، وH +، على التوالي، وذلك باستخدام لوحة قارئ مضان الكشف. هذه البروتوكولات هي الأولى من نوعها لالمكورة الرئويةوغالبية هذه الأصباغ لم يتم استخدامها في أي نوع من الأنواع البكتيرية الأخرى. على الرغم وقد تم تحسين بروتوكولات لدينا S. الرئوية، ونحن نعتقد أن هذه الأساليب تشكل نقطة انطلاق ممتازة لدراسات مماثلة في الأنواع البكتيرية الأخرى.
Introduction
وقد حددت لدينا مختبر مجمع البروتين الدهني من الحليب البشري اسمه هاملت (لالإنسان ألفا ألبومين اللبن مصنوعة قاتلة للخلايا السرطانية) أن يستحث موت الخلايا المبرمج في الخلايا السرطانية، ولكن هي أيضا قادرة على قتل مجموعة متنوعة من الأنواع البكتيرية 1،2. وكانت الأنواع التي وجدت لتكون حساسة بشكل خاص تلك التي تستهدف الجهاز التنفسي، مع العقدية الرئوية (المكورة الرئوية و) عرض أعظم حساسية والنمط الظاهري مثل موت الخلايا المبرمج وفاة 2،3. الأحداث النقل الاستقطاب الغشاء والأيونات محددة هي موصوفة وصفا جيدا والأحداث الحاسمة خلال موت الخلايا المبرمج في الخلايا حقيقية النواة، خاصة في الميتوكوندريا، حيث استخدمت TPP المشعة + الأيونات والأصباغ الفلورية بما JC-1 وTMRE لإثبات الاستقطاب للغشاء الميتوكوندريا 3 -5. وبالتالي، سعينا لمعرفة المزيد حول تأثير هاملت على هذه الميزات ذات الصلة في غشاء الرئوية كما ركزنا جهودنا لتطوير فهم أفضل للمكونات الميكانيكية من النمط الظاهري مثل موت الخلايا المبرمج في البكتيريا، مع إمكانات كبيرة للعلاجات المضادة للبكتيريا تحديد رواية أو اللقاحات المرشحة في هذه العملية.
في السعي لوضع بروتوكولات للدراسات الآلية لدينا، اكتشفنا أنه خلافا للمنهجية موصوفة وصفا جيدا في أنظمة حقيقية النواة، وهناك عدد قليل جدا من الدراسات التي نشرت تفاصيل آليات الكهربية والنقل ايون من 6،7 غشاء البكتيريا. ويعزى هذا أساسا إلى حجم أصغر من الكائنات الحية الدقيقة والهندسة المعمارية سطحها، وخصوصا وجود جدار الخلية، والتي تقيد الوصول للغشاء لاستخدام الأساليب التقليدية مثل حقيقية النواة لقط التصحيح، على الرغم من أن بعض الدراسات باستخدام protoplasts العملاقة وقد أجريت بدرجات متفاوتة من النجاح 8،9. كما عمل مع هذه protoplasts العملاقة ليست طريقة مثالية أو حتى العملية لمعظم الأنواع البكتيرية لأنه يتطلب رجلالبكتيريا ipulated في حالة غير طبيعية وغير الحيوية، ودراسات محدودة من بكتيريا قطبية غشاء التي تم تنفيذها قد استخدمت في المقام الأول التدفق الخلوي واستخدام cyanine وoxonol الأصباغ الفلورية 10-16.
بدلا من التدفق الخلوي، التي تجمع قراءات مضان الفردية من بكتيريا واحدة في كل نقطة زمنية واحدة، واخترنا لاستخدام قارئ لوحة مضان الكشف للكشف عن كثافة مضان من تعليق البكتيرية في شكل لوحة 96 جيدا مع مرور الوقت. هذا مكننا لعلاج السكان من البكتيريا في نقاط زمنية مختلفة مع أكبر بكثير البساطة وسهولة، وبشكل مستمر رصد حركية مضان من السكان لفترات طويلة من الزمن، وهو أمر صعب تحقيقه من خلال استخدام التدفق الخلوي. بعد اختبار مجموعة واسعة من الأصباغ الفلورية المحتملة تراعي (بما في ذلك تلك المذكورة أعلاه للاستخدام مع الميتوكوندريا)، حققنا أفضل نجاح التقنية والعملية باستخداممكرر oxonol صبغة تسمى DiBAC 4 (3) (مكرر (حمض 1،3-dibutylbarbituric) trimethine oxonol) لرصد التغيرات في قطبية.
وجدنا أيضا أنه قيمة لرصد الاضطرابات في نفس الوقت على سلامة الغشاء باستخدام يوديد propidium (PI). هذه الصبغة تتفلور عليها ملزمة لالحمض النووي، ولكن هو فقط قادرة على القيام بذلك عندما يتم المساس سلامة غشاء البكتيريا، مما يجعلها عنصرا شعبية تستخدم للكشف عن الخلايا الميتة في المقايسات تلطيخ الحية ميتة. بالإضافة إلى PI، SYTOX الخضراء وTO-PRO-1 هي الأصباغ الفلورية التي تشبه في العمل، وقد سبق استخدامها للبكتيريا في عدد قليل من الدراسات التي تستخدم التدفق الخلوي طرق الكشف 17. اخترنا لاستخدام PI بسبب الطول الموجي الإثارة لأنه سمح لنا لرصد مضان لها بالتزامن مع DiBAC في عينة معينة.
في دراستنا، لاحظنا أن هاملت، فضلا عن مجمع آخر البروتين الدهني ذات الصلة مع النشاط جراثيمالمعروفة باسم ELOA، الاستقطاب الناجم عن وتمزق الغشاء الجرثومي كما يتبين من زيادات في مضان من كل من الأصباغ على علاج المكورات الرئوية 3،18،26. لكل من المجمعات، لاحظنا أن كثافة مضان من DiBAC 4 (3) زيادة قبل الزيادة في كثافة PI، مشيرا إلى أن الاستقطاب وقعت قبل تمزق، وبالتالي، حدث معين الناجمة عن لدينا المجمعات البروتين الدهني جراثيم من الفائدة. هذا التمييز مهم لجعل، وتمزق الغشاء يمكن أن يسبب الاستقطاب نفسها غير محددة. يسمح حركية قياس وتحليل كل DiBAC 4 (3) وPI مضان في وقت واحد منا لدراسة هذه العلاقة بين الحدثين الغشاء، وهي ميزة إضافية لاستخدام التألق بدلا من التدفق الخلوي.
لرصد بكتيريا تدفق أيون، كان هناك بعض النجاح السابق مع استخدام النظائر المشعة، بما في ذلك قياس امتصاص45 كا 2 + في المكورة الرئوية 19،20، ونحن قد استخدمت أيضا في دراساتنا الأخيرة 18 و 21. ومع ذلك، والعمل مع هذه الأيونات المشعة لديها العديد من السلبيات. يمكن أن يكون مكلفا، وتستغرق وقتا طويلا، والفوضى، ويمكن أيضا أن تعرض الأفراد الذين يؤدون هذه التجربة لإلحاق الضرر، اعتمادا على النظائر من الفائدة. بالإضافة إلى ذلك، فإنه من الصعب رصد التغيرات السريعة مع مرور الوقت. وبالتالي، لجأنا نحو طريقة بديلة القياس التي تستخدم إصدارات acetoxymethyl (AM) استر من الأصباغ الفلورية مؤشر الحساسة ليثيوم. في حد ذاته، وجهت للصبغ ومؤشر لا تمر عبر الغشاء بسهولة، ولكن مع إضافة مجموعة استر محبة للدهون، يمكن للجزيء الآن بدون تهمة تمر عبر غشاء البكتيريا. عند دخول المناطق الداخلية، والاسترات البكتيرية يلتصق مجموعة استر، وترك الصبغة حرة داخل الخلية واتهم مرة أخرى، وتباطؤ كبير قدرته على الخروج من الخلية والسماح للر صبغس تتراكم داخل بمرور الوقت. ومع ذلك، فقد وصفت فقط استخدام هذه الأصباغ استر في عدد قليل من الأنواع البكتيرية للكشف عن تغيرات في الخلايا كا 2 + H + 22-24 و16، مع أساليب مختلفة من التحميل، والكشف، والنجاح.
مع الرغبة في رصد التغيرات في الخلايا كا 2 +، وكذلك + K + H والمستويات في S. الرئوية عند العلاج مع هاملت وغيرها من المركبات، أنشأنا بنجاح بروتوكولات لتحميل الأصباغ الفلورية مؤشر بكفاءة في الخلايا البكتيرية. التحميل فعالة في البكتيريا المطلوبة سواء البروبينسيد الذي يزيد احتباس الصبغة عن طريق منع أنيون النقل وPowerLoad، وهو مركب الملكية من تقنيات الحياة تؤدي إلى زيادة الكفاءة التحميل. Fura-2/AM (كشف كا 2 +)، PBFI / AM (كشف K +)، وBCECF / AM (H + كشف) تم تحميلها بنجاح في كل من unencapsulated ومغلفة المكورات الرئوية الحادي والامطار تمكين قياس أنماط مضان الناتج بعد إضافة ionophores، مثل ionomycin (كا 2 + uncoupler)، valinomycin (K + uncoupler) وCCCP (H + uncoupler) باستخدام قارئ لوحة مضان كشف 18 و 21.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. إعداد الثقافات البكتيرية
- تنامي ثقافة للاستخدام في التجارب
- في 37 ° C كتلة التدفئة، ذوبان الجليد المجمدة الأسهم قارورة من S. الرئوية وإضافة محتواه إلى 9 مل من الطازجة، prewarmed تود هيويت مرق مع 0.5٪ مستخلص الخميرة (THY) لمجموع حجم 10 مل في أنبوب الثقافة الزجاج.
- احتضان ثابت عند 37 درجة مئوية حتى تصل إلى مرحلة ثقافة سجل منتصف (عبس ل 600Nm ≈ 0.5-0.6).
2. الكشف عن غشاء الاستقطاب وتمزق
- الكواشف إعداد
- إعداد المخزون 50 ميكرومتر من DiBAC 4 (3) في 100٪ DMSO، و 2 ملغ / مل من الأسهم PI في DDH 2 O. وDiBAC 4 (3) السهم مستقرا عند -20 درجة مئوية لمدة 6 أشهر على الأقل. الأسهم PI مستقرة عند 4 درجة مئوية لمدة 6 أشهر على الأقل.
- التفاف أسهم في احباط للحماية من ضوء.
- تحميلبكتيريا
- بيليه الخلايا البكتيرية من الخطوة 1.2.2 بواسطة الطرد المركزي في 2400 x ج لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة، ويغسل مرتين عن طريق إزالة طاف، إعادة التعليق على بيليه في 10 مل من 1X الفوسفات مخزنة المالحة (PBS)، وأجهزة الطرد المركزي مرة أخرى في 2400 x ج لمدة 10 دقيقة.
- إزالة طاف و resuspend بيليه في برنامج تلفزيوني لحجم الأصلي. هذا وسوف توفر ما يقرب من 10 8 وحدات تشكيل مستعمرة من البكتيريا لكل مل. إزالة 1 مل (ما يكفي لمدة 5 عينات) من خلايا غسلها ووضعها في أنبوب microcentrifuge.
- لهذه الخلايا، إضافة 25 ميكرولتر من فلتر تعقيم محلول المخزون 1 M من الجلوكوز (أعدت في DDH 2 O وتصفيتها من خلال مرشح 0.45 ميكرون) لتركيز النهائي من 25 ملي الجلوكوز، واحتضان في كتلة التدفئة 37 ° C لمدة خمس عشرة دقيقة. ملاحظة: هذا يوفر الطاقة لجميع القنوات غشاء ATP التي تعتمد على والمكونات الخلوية. قد تختلف الحاجة لهذه الخطوة، اعتمادا على التجربة.
- إضافة 5 ميكرولتر من (3) 50 ميكرومتر الأسهم DiBAC 4 و 10 ميكرولتر من الأوراق المالية 2 ملغ / مل PI. وهذا يوفر لتركيزات النهائي من 250 نانومتر و 20 ميكروغرام / لتر، على التوالي. مزيج دقيق من قبل pipetting صعودا وهبوطا عدة مرات. إضافة 200 ميكرولتر من هذا التعليق الخلية لكل عينة بئر من لوحة واضحة 96 جيدا.
- الكشف عن مضان
- المكان في لوحة prewarmed (37 درجة مئوية) لوحة الكشف مضان القارئ.
- تأكد من أن الفلاتر المناسبة في المكان المناسب DiBAC 4 (3) (490 نانومتر الإثارة، 516 الانبعاثات نانومتر) وPI (535 نانومتر الإثارة، 617 الانبعاثات نانومتر) الكشف.
- للسماح ل(ومراقبة في نفس الوقت) من موازنة DiBAC 4 (3) على الغشاء، تعيين القارئ لأخذ القياسات مضان كل دقيقة لمدة 30-40 دقيقة، أو حتى تستقر القراءة، وهذا بمثابة القراءة "المعالجة".
- إخراج لوحة وإضافة عامل التجريبية الاختيار وimmedوضع iately لوحة مرة أخرى في القارئ إلى مواصلة رصد DiBAC 4 (3) ومضان PI لمدة من الوقت المطلوب. إذا علاج العديد من العينات في وقت واحد، وذلك باستخدام ماصة الأقنية يمكن أن تكون مفيدة لإضافة عامل في وقت واحد لجميع الآبار.
- تصدير قراءات لبرنامج تحليل البيانات مثل Microsoft Excel. مؤامرة مضان بمرور الوقت لتقييم الاستقطاب الغشاء وتمزق. زيادة مضان من PI DiBAC ويشير إلى أن الاستقطاب والتمزق التي تحدث.
3. الكشف عن التغييرات في داخل الخلايا كا 2 + K + أو تركيزات
- إعداد الكواشف والعازلة تحميل
- إعداد الكواشف التالية: 5 ملي الأسهم الصبغة الحساسة ليثيوم الفلورسنت (Fura-2/AM أو PBFI / AM، إضافة كمية مناسبة من DMSO إلى أنبوب يحتوي على 50 ميكروغرام من الصبغة)، "100X" البروبينسيد (إضافة 1 مل من برنامج تلفزيوني لقارورة 77 ملغ). وsolubilizedالأصباغ يمكن تجميد في -20 درجة مئوية مرة واحدة ومستقرة في حل لمدة 3 أشهر، في حين أن البروبينسيد هو مستقر في الحل في -20 درجة مئوية لمدة 6 أشهر.
- إعداد 1 مل من 2X تحميل العازلة كما يلي: في الجزء السفلي من البلاستيك 15 مل أنبوب مخروطي الشكل، تستغني 20 ميكرولتر من 100X PowerLoad التركيز (مستقرة عند 2-8 درجة مئوية لمدة 6 أشهر)، تليها 2 ميكرولتر من أيون 5 ملي تراعي صبغة مباشرة في PowerLoad. دوامة لفترة وجيزة إلى المزيج. إضافة 960 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني تليها 20 ميكرولتر من 100X البروبينسيد. دوامة الخليط مرة واحدة نهائية. التفاف في احباط للحماية من ضوء.
- تحميل البكتيريا مع صبغة
- بيليه ويغسل ثقافة مرحلة منتصف سجل للبكتيريا كما هو موضح في 2.2.1. إزالة طاف و resuspend بيليه في 5 مل من برنامج تلفزيوني لتقديم "2X" التعليق الخلية.
- إضافة 1 مل من تعليق خلية 2X إلى 2X تحميل العازلة. هذا وسوف توفر عن الحجم النهائي من 2 مل، وconcentr النهائيations من 1X PowerLoad، 5 ميكرومتر صبغة الفلورسنت، و 1X البروبينسيد. ملاحظة: يقدم هذا التعليق ما يكفي من حجم العينات لمدة 10 لأن كل عينة بشكل جيد لقياس سيحتوي 200 ميكرولتر.
- احتضان في 37 درجة مئوية حمام الماء لمدة 75 دقيقة، ومحمية من الضوء. ملاحظة: يتم تحميل الصبغة في الخلايا البكتيرية في غياب أي ركائز حال السكر وبحضور البروبينسيد للحد من هروب رأس المال من الصبغة.
- المياه والصرف الصحي 1: بيليه الخلايا بواسطة الطرد المركزي في 2400 x ج لمدة 10 دقيقة، وإزالة طاف، و resuspend في برنامج تلفزيوني يحتوي على 2 مل 1X البروبينسيد. المياه والصرف الصحي 2، 3: كرر الخطوة 3.2.4 2X. احتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة أخرى. وهذا سوف يسمح الوقت لالاسترات البكتيرية ليتحلل وAM استر مجموعة بعيدا عن الأصباغ الفلورية المنضوية.
- المياه والصرف الصحي 4: بيليه الخلايا بواسطة الطرد المركزي في 2400 x ج لمدة 10 دقيقة، وإزالة طاف، و resuspend في 2 مل من برنامج تلفزيوني يحتوي على 1X البروبينسيد. ملاحظة: اعتمادا على experimeالإقليم الشمالي، والجلوكوز يمكن أن تضاف إلى هنا لإعادة تنشيط البكتيريا.
- الكشف عن مضان
- Prewarm كشف مضان لوحة قارئ لوحة القارئ إلى 37 درجة مئوية.
- لكل عينة المطلوب، إضافة 200 ميكرولتر من الخلايا تحميل (من الخطوة 3.2.8) إلى آبار لوحة 96 جيدا. (نفذ الخطوات التالية لإنجاز واحد بشكل جيد / عينة في وقت واحد).
- لإنشاء خط الأساس القراءة للبئر، لوحة مكان في الكشف عن مضان لوحة قارئ لقياس مضان (340 نانومتر الإثارة / الانبعاثات نانومتر 510 ل "القيمة 1" و 380 نانومتر الإثارة / الانبعاثات نانومتر 510 ل "القيمة 2") في كل ثانية لمدة دقيقة.
- إخراج لوحة، إضافة العلاج الأمثل لذلك جيدا (في حجم صغير من حوالي 5 ميكرولتر)، ماصة بسرعة صعودا وهبوطا عدة مرات لخلط، ووضع على الفور مرة أخرى في الكشف عن مضان لوحة القارئ لقراءة كل ثانية لالمرجوة طول الوقت. (إذا كان فيهي jectors المرتبطة قارئ لوحة المتاحة، ويمكن أيضا أن تستخدم هذه لإضافة بسلاسة العلاج المطلوب، مما يلغي الحاجة لوقف القراءة وإخراج لوحة).
- تصدير قراءات لبرنامج تحليل البيانات مثل Microsoft Excel. حساب نسبة القيم مضان لكل نقطة في الوقت بقسمة القيمة 1 بالقيمة 2، ورسم القيم نسبة على الرسم البياني.
4. الكشف عن التغيرات في درجة الحموضة بين الخلايا
- إعداد الكواشف ومخازن المعايرة
- إعداد الكواشف التالية: 5 ملي الأسهم من BCECF / AM (. إضافة كمية مناسبة من DMSO إلى أنبوب يحتوي على 50 ميكروغرام من الصبغة هذا المخزون هو مستقر في -20 درجة مئوية لمدة 3 أشهر)؛ 100X البروبينسيد (إضافة 1 مل من PBS إلى قارورة 77 ملغ)، 1 ملم من إعداد الأسهم nigericin في الإيثانول (مطلوب للتوازن درجة الحموضة داخل الخلايا (درجة الحموضة ط) من الخلايا إلى الرقم الهيدروجيني للالعازلة المحيطة هذا المخزون هو قالجدول في -20 درجة مئوية لمدة 6 أشهر)؛ 0.5 ملي الأسهم من الكربونيل سيانيد 3 chlorophenylhydrazone (CCCP) في DMSO (protonophore إلى فك الارتباط بين قوة الدافع بروتون هذا المخزون هو مستقر في -20 درجة مئوية لمدة 6 أشهر)
- تحضير 10 مل من مخازن البوتاسيوم عالية التالية: 135 ملي KH 2 PO 4/20 ملي هيدروكسيد الصوديوم (أحادى) و 110 ملي K 2 هبو 4/20 ملي هيدروكسيد الصوديوم (ثنائي القاعدة). فلتر تعقيم باستخدام فلتر 0.45 ميكرون. (هذه المخازن المؤقتة يمكن تخزينها في 4 درجات مئوية حتى الاستخدام).
- مزيج من مخازن البوتاسيوم عالية في نسب اللازمة لإنشاء مخازن البوتاسيوم عالية مع ما لا يقل عن 5-6 قيم درجة الحموضة تتراوح 6،5-8،0.
- إعداد 1 مل من 2X تحميل العازلة كما يلي: في الجزء السفلي من البلاستيك 15 مل أنبوب مخروطي الشكل، تستغني 40 ميكرولتر من 100X PowerLoad، تليها 20 ميكرولتر من 5 ملم الحساسة ليثيوم صبغة مباشرة في PowerLoad. دوامة لفترة وجيزة إلى المزيج. إضافة 900 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني تليها 40 ميكرولتر من 100X البروبينسيد. Vortبحكم الخليط مرة واحدة نهائية. التفاف في احباط للحماية من ضوء.
- تحميل البكتيريا مع صبغة
- بيليه ويغسل 8 مل من ثقافة مرحلة منتصف سجل للبكتيريا كما هو موضح في 2.2.1. إزالة طاف، بيليه resuspend في 2 مل من برنامج تلفزيوني لتقديم "4x و" التعليق الخلية.
- إضافة 1 مل من تعليق خلية 4X 2X إلى تحميل العازلة. هذا وسوف توفر عن الحجم النهائي من 2 مل، وتركيزات النهائي من الخلايا 2X، 2X PowerLoad، 50 ميكرومتر صبغة الفلورسنت، و 2x البروبينسيد.
- احتضان في 30 ° C حمام الماء لمدة 40 دقيقة، محمية من الضوء. ملاحظة: يتم تحميل الصبغة في الخلايا البكتيرية في درجة حرارة أقل من 30 درجة مئوية و في غياب أي ركائز حال السكر للحد من هروب رأس المال من الصبغة.
- المياه والصرف الصحي 1: بيليه الخلايا بواسطة الطرد المركزي في 2400 x ج لمدة 10 دقيقة، وإزالة طاف للتخلص من الصبغة الزائدة، وresuspend في برنامج تلفزيوني يحتوي على 4 مل 2X البروبينسيد لالثاني 1 ملي الجلوكوز (لإعادة تنشيط البكتيريا). المياه والصرف الصحي 2، 3: كرر الخطوة 4.2.7 مرتين، مع إعادة تعليق النهائية في 4 مل PBS (لتركيز النهائي من الخلايا 1X) التي تحتوي على البروبينسيد 2X و 10 ملي الجلوكوز.
- احتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق. وسوف تسمح هذه الخلايا لتنشيط بالكامل وإتاحة الوقت لالاسترات البكتيرية ليلتصق AM استر مجموعة بعيدا عن BCECF المنضوية.
- إنشاء مضان الخلفية والجسم الحي في منحنى المعايرة
- Prewarm كشف مضان لوحة قارئ لوحة القارئ إلى 37 درجة مئوية.
- لتحديد مضان الخلفية، فلتر تعقيم حوالي 500 ميكرولتر من تعليق البكتيرية تحميل وتنشيط (من الخطوة 4.2.7) لإزالة البكتيريا، وإضافة 200 ميكرولتر من الترشيح للبئر من لوحة 96 جيدا.
- وضع لوحة في الكشف عن مضان لوحة قارئ لقياس مضان (490 نانومتر الإثارة / الانبعاثات 530 نانومتر ل"القيمة 1" و 440 نانومتر الإثارة / الانبعاثات نانومتر 530 ل "القيمة 2") لمدة 1 دقيقة. ينبغي طرح هذا مضان الخلفية قبل احتساب النسب لكل من منحنى المعايرة والعينات التجريبية.
- للحصول على منحنى المعايرة في الجسم الحي، وغسل 500 ميكرولتر مأخوذة من خلايا محملة وتنشيط 4.2.7 من الخطوة مرة واحدة وresuspend في مخازن البوتاسيوم عالية في قيم درجة الحموضة مختلفة (تتراوح 6،5-8،0).
- إضافة 20 ميكرومتر nigericin للعينات للتوازن درجة الحموضة داخل الخلايا من الخلايا إلى الرقم الهيدروجيني للالعازلة المحيطة بها، واحتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق. إضافة 200 ميكرولتر من العازلة مجموعات البكتيريا / درجة الحموضة إلى آبار لوحة 96 جيدا.
- وضع لوحة في الكشف عن مضان لوحة قارئ لقياس مضان لبضع دقائق لتأسيس القراءة ثابتة لكل بئر. تصدير قراءات لبرنامج تحليل البيانات مثل Microsoft Excel.
- بعد طرح باالقيم مضان ckground، وحساب نسبة القيم مضان بقسمة القيمة 1 التي كتبها القيمة 2. رسم القيم نسبة لكل درجة الحموضة عازلة لإنشاء منحنى المعايرة. (يجب أن يتم إنشاء منحنى المعايرة لكل دفعة جديدة من الخلايا تحميل، وكمية من صبغة الفلورسنت التي يتم تحميلها إلى البكتيريا يمكن أن تختلف في كل مرة).
- قياس التغيرات في درجة الحموضة داخل الخلايا
- لكل عينة المطلوب، إضافة 200 ميكرولتر من الخلايا وتنشيط تحميلها (من الخطوة 4.2.7) إلى آبار لوحة 96 جيدا.
- وضع لوحة في الكشف عن مضان لوحة قارئ وقياس مضان من العينات كل 5 ثانية لمدة 5 دقائق.
- إخراج لوحة وإضافة 10 ميكرومتر CCCP لبئر واحدة (بمثابة مراقبة إيجابية لخفض درجة الحموضة داخل الخلايا) وكيل التجريبية (ق) من الفائدة إلى الآبار الأخرى. لمقارنة بدقة آثارها بمرور الوقت، إضافة CCCP وكلاء من خيار في نفس الوقت باستخدام صباحاultichannel ماصة.
- العودة فورا لوحة إلى لوحة قارئ ومواصلة قياس مضان كل 5 ثانية لمدة 10 دقيقة. كعنصر تحكم إضافية، إخراج لوحة وإضافة 20 ميكرومتر Nigericin لجميع العينات للتوازن درجة الحموضة ط من البكتيريا إلى الرقم الهيدروجيني للالعازلة المحيطة بها، وقراءة لمدة 5 دقائق.
- بعد طرح القيم مضان الخلفية، وحساب نسب مضان لكل عينة. أقحم ط الأس الهيدروجيني لكل القراءة من منحنى المعايرة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
لجميع التجارب، وهناك عينة واحدة ومجموعة من الشروط موجودة في كل بئر. وبالتالي، يمثل كل تتبع كثافة مضان من السكان من البكتيريا مع مرور الوقت. ينبغي أن تكون النتائج للتفسير بسهولة، مع تمييز واضح بين مضان من العينات المعالجة وذلك من ضوابط غير المعالجة. يمكن أن حركية ودرجة تغير لوحظ في مضان تقديم معلومات عن آلية محتملة ومدى الحدث يجري رصدها.
عند استكشاف قطبية الغشاء، تحتاج البكتيريا إلى أن حضنت مع DiBAC لمدة 40 دقيقة للسماح للموازنة من الصبغة على الغشاء، كما يدل على ذلك انخفاض مطرد والتسوية اللاحقة من مضان في الشكل 1A قبل العلاج. كما هو موضح في الشكل 1B، PI لا يتطلب موازنة، كما إشارة الفلورسنت لها هو ثابت في جميع أنحاء أول 40 دقيقة الحضانة، بور وجودها جنبا إلى جنب مع DiBAC مفيد لرصد تمزق غشاء بالتزامن مع قطبية. يشار الاستقطاب وتمزق البكتيريا عن طريق زيادة في كثافة مضان كل من الأصباغ. العوامل الأخرى قادرة على الاستقطاب وتمزق، مثل المنظفات (deoxycholate الصوديوم 18)، uncouplers، أو ionophores (CCCP)، ويمكن أيضا أن تضاف إلى إثبات هذه الأحداث باستخدام هذه المنهجية.
لFura-2/AM، PBFI / AM، وBCECF / AM، يتم حساب نسبة إشارتين الفلورسنت، وزيادة أو نقصان في هذه النسبة يتوافق مع الكالسيوم داخل الخلايا 2 + (الشكل 2)، K + (الشكل 3 )، وH + (الشكل 4) تركيزات على التوالي. عند اضافة ionomycin حامل الأيون الكالسيوم، كا 2 + يصب في الخلية مما يسبب زيادة في نسبة مضان (الشكل 2). إضافة valinomycin له تأثير معاكس، مما تسبب K+ بالتدفق خارج الخلية وتقليل التركيز داخل الخلايا، والتي دلت على انخفاض في نسبة مضان (الشكل 3). BCECF يسمح لقياس درجة الحموضة داخل الخلايا عن طريق إنشاء أول منحنى المعايرة (الشكل 4A) في وجود مخازن مختلفة من درجة الحموضة المعروفة. وحدث انخفاض في نسبة مضان من صبغ يتوافق مع انخفاض في درجة الحموضة، كما رأينا التالية بالإضافة لااحد protonophores أو nigericin، الذي ينهار التدرج بروتون (الشكل 4B).
الشكل 1. ورصد اضطرابات الغشاء. S. وقد حضنت الرئوية مع (A) DiBAC و (ب) PI في وقت واحد لمدة 40 دقيقة للسماح للموازنة من خلال DiBAC مembrane. في نهاية هذه الحضانة (السهم)، PBS (غير المعالجة) أو هاملت (المعالجة) وأضيف وتليت العينات لمدة ساعة إضافية. اضغط هنا لمشاهدة صورة أكبر.
الشكل 2. اكتشاف التغيرات في مستويات الكالسيوم داخل الخلايا. تم تحميل الرئوية مع Fura-2/AM وعلاجها (السهم) مع برنامج تلفزيوني (غير المعالجة) أو ionomycin حامل الأيون الكالسيوم (مراقبة إيجابية). يتم تقديم نسبة من القيم مضان. اضغط هنا لمشاهدة صورة أكبر.
الرقم 3. الكشف عن التغييرات في مستويات البوتاسيوم داخل الخلايا. تم تحميل الرئوية مع PBFI / AM وعلاجها (السهم) مع برنامج تلفزيوني (غير المعالجة) أو valinomycin حامل الأيون البوتاسيوم (مراقبة إيجابية). يتم تقديم نسبة من القيم مضان. اضغط هنا لمشاهدة صورة أكبر.
الشكل 4. الكشف عن التغييرات في مستويات البروتون داخل الخلايا. (A) منحنى القياسية لدرجة الحموضة داخل الخلايا المعايرة. (B) تم تحميل الرئوية مع درجة الحموضة حساسة صبغة BCECF-AM، وكانتغسلها ومعلق في برنامج تلفزيوني + الجلوكوز. بعد تسجيل قراءات أساسية، في السهم الأول، PBS (أسود)، وCCCP protonophore (100 ميكرومتر)، أو هاملت (100 ميكروغرام / مل أو 6 ميكرومتر)، تمت إضافتها إلى البكتيريا وتم قياس مضان بمرور الوقت. في nigericin السهم الثانية تمت إضافة (20 ميكرومتر) لتبدد تماما التدرج عبر الغشاء البروتوني من كل من العينات. اضغط هنا لمشاهدة صورة أكبر.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
على الرغم من القيد الذي يطرح حجم واستخدام أساليب الكهربية الكلاسيكية للكشف عن تغيرات في الاستقطاب وسلامة الغشاء والتغيرات في تركيز أيون داخل البكتيريا، التي وصفناها وسيلة لقياس هذه الأحداث في S. الرئوية باستخدام الأصباغ الفلورية. بروتوكولات لدينا هي الأولى من نوعها وصفها لالمكورة الرئوية واحدة من الدول القليلة وصف الأنواع البكتيرية بشكل عام. باستخدام قارئ لوحة مضان الكشف، ويمكن قياس هذه الأحداث في الصغيرة، وعينات حجم 200 ميكرولتر من البكتيريا، مع الكشف عن مضان من السكان الفرد من البكتيريا مع مرور الوقت. حركية والتغيرات في كثافة مضان يمكن استخدامها لتحديد نوعيا ما يحدث للغشاء قطبية أو النزاهة، أو مستويات كا 2 +، K +، أو H + داخل البكتيريا. يتحدث من الناحية الكمية، ويمكن أيضا أن تستخدم القيم كثافة مضان لحساب درجة إقلاعolarization، وتمزق، امتصاص الكالسيوم، البوتاسيوم هروب رأس المال، أو تغيير درجة الحموضة لوحظ في عينة واحدة مقابل أخرى، وتوفير المعلومات الهامة حول آلية من الفائدة. بالإضافة إلى ذلك، يجب أن يكون لدينا بروتوكول مفيدة كنقطة انطلاق لتحميل أخرى AM الفلورسنت الأصباغ، مما يسمح لدراسة مجموعة متنوعة من الأحداث الخلوية الأخرى في مجموعة متنوعة من الأنواع البكتيرية. كنا بالفعل نجاحا في تطبيق بعض من هذه البروتوكولات في المكورات العنقودية الذهبية 21.
عند استخدام الأصباغ صباحا، وافرة فترة حضانة مهمة لصبغ التحميل وتحقيق التحلل اللاحقة اللازمة لصبغ للرد على أيونات الهدف داخل البكتيريا وتسفر التغييرات مضان المقابلة. قد تختلف حركية التحميل بين سلالات بكتيرية بسبب العديد من العوامل بما في ذلك الاختلافات في بنية السطح البكتيرية (وجود كبسولة، سيولة الغشاء، وجود مضخات هروب رأس المال، الخ.) وفي التركيب الكيميائي سو الصبغة. لتحقيق أقصى قدر من التحميل للسلالة البكتيرية وصبغ من الفائدة، وهناك العديد من المعلمات من بروتوكول لدينا التي قد تتطلب تعديل بما في ذلك: مدة الحضانة، ودرجة حرارة الحضانة، وتوافر المواد الغذائية، والتركيز PowerLoad، والتركيز البروبينسيد. للحصول على التحميل ناجحة، كثافة إشارة مضان أقل أهمية من تبين أن الضوابط الإيجابية، مثل إضافة ionophores، وتوفير إشارة في الاتجاه الصحيح و / أو إظهار الخطي في منحنى المعايرة. لتحسين تحميل زيادة في PowerLoad والتركيز Probenicide تليها خفض درجة الحرارة إلى تجنب قذف الصبغة هو الأفضل لزيادة تركيز الصبغة التي قد تؤدي إلى تلطيخ خارج الخلية التي من شأنها إرباك الإشارة. خلال وضع بروتوكولات لدينا، كنا قادرين على تحميل الأصباغ لدينا مصلحة في كل من النوع البري مغلفة المكورات الرئوية D39 سلالة وسلالة unencapsulated R36A 25 بنجاح.ومع ذلك، وجدنا أننا يمكن أن تحقق التحميل الأمثل كما يتبين من قراءات الفلورسنت مما يؤدي إلى زيادة نسب استخدام R36A لFURA-2 وPBFI التجارب باستخدام 37 ° C درجة حرارة الحضانة، بينما قرءات اقل درجة حرارة الحضانة إلى جانب ارتفاع PowerLoad وتركيزات البروبينسيد عمل أفضل لل تحميل BCECF في D39. على الرغم من كثافة إشارة محددة قد تختلف بين التجارب، وفرت الطبيعة ratiometric القياسات النتائج مع استنساخ عالية وانتشار قليلا.
لقياسات مضان من العينات، واستخدام البرامج المصاحبة القراء لوحة الأكثر تقدما يسمح للتعديلات من مجموعة متنوعة من المعلمات الكشف، بما في ذلك سرعة الكشف وحساسية الكشف، وقراءة والمدة، وعلى سبيل المثال لا الحصر. وهذا يسمح للباحث العثور على حساسية الأمثل للكشف عن حدث معين الذي تتم مراقبته. لتفسير الأمثل للنتائج، فمن الأهمية بمكان أن خطوط الأساس مستقرة من فلوريوضعت escence ومعيار الخطية منحنيات، كما يمكن أن تكون هناك اختلافات بين مقايسة في كمية الصبغة التي هو الحاضر، معايرتها خلال الغشاء، أو تحميلها في البكتيريا وتحلل. إتاحة الوقت للصبغة موازنة على الغشاء البكتيري قبل العلاج من أي نوع أمر بالغ الأهمية ولا سيما عند استخدام DiBAC 4 (3) للسماح لمستوى مضان استقرت قبل العلاج. بالإضافة إلى ذلك، بما في ذلك كافة عناصر التحكم المناسبة في كل تحليل الفرد هو ضروري لتحليل بيانات دقيقة، والإضافات التجريبية التي يتم تقديمها في تعليق البكتيرية لفحصها قد autofluoresce أنفسهم في موجات معينة من كشف أو تعديل unspecifically مضان من مؤشر صبغ من خلال التفاعل المباشر.
نحن ندرك عدد قليل من المجالات المحتملة للقلق المرتبطة الأساليب التي وصفناها هنا. على عكس الصبغة carbocyanine DiOC 2 (3)، DiBAC 4 (3) هو صبغ bisoxonol أن ليس ratiometric، وذلك في حين الصبغة carbocyanine يمكن حساب التغيرات في حجم الخلية، DiBAC 4 (3) لا يمكن. وبالتالي، قد تكون هناك تغييرات في مستوى مضان التي تتوافق مع التغيرات في حجم الخلية. نحن، ومع ذلك، لم يلاحظوا هذا وجود مشكلة كبيرة، حيث أن المكورات الرئوية لديه جدار الخلية الصارمة التي لا تسمح تغييرات كبيرة في حجم دون تمزق البكتيريا. لدراسة تدفقات أيون البكتيرية، يمكن للحساسية من الأصباغ الحساسة أيون تختلف تبعا لايون من الفائدة ودرجة التغير في تركيزه. بالإضافة إلى ذلك، فإن استخدام الأصباغ الفلورية هو تجريبيا وليس كما المباشرة طريقة مثل استخدام النظائر المشعة. ومع ذلك، اعتمادا على أيون ذات الاهتمام، ودراسة مضان هو خيار عملي أكثر بكثير عندما تفكر في كل من القيود المالية والمتعلقة بالسلامة تشارك مع استخدام النظائر المشعة. وبالتالي، فإن المنهجيات وصفها في هذه المخطوطة تقديم نهج جديد وثابتوفاق لأفضل قطبية غشاء الدراسة، والنزاهة، والأحداث في أنظمة النقل والبكتيرية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
والكتاب ليس لديهم مصالح مالية المتنافسة إلى إعلان.
Acknowledgments
وأيد هذا العمل من قبل مؤسسة بيل وميليندا غيتس (المنحة 53085)، ومؤسسة JR Oishei، وجمعية الرئة الأمريكية (المنحة RG-123721-N) لAPH، والمعاهد الوطنية للصحة (NIDCD) الزمالات F31DC011218 لEAC.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Todd-Hewitt broth | Bacto, BD Diagnostics | 249240 | |
| Yeast Extract | Bacto, BD Diagnostics | 212750 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS; pH 7.2) | Invitrogen (GIBCO) | ||
| Dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | D5879 | DMSO |
| DiBAC4(3) (bis-(1,3-dibutylbarbituric acid) trimethine oxonol) | Molecular Probes | B-438 | |
| Propidium Iodide | Sigma-Aldrich | P4170 | Make up in deionized water |
| D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | ||
| PowerLoad | Molecular Probes | P10020 | 100x concentrate |
| Probenecid | Molecular Probes | P36400 | Make 100x stock by adding 1 ml of PBS to one 77 mg vial |
| Fura-2/AM | Molecular Probes | F1221 | Special packaging (50 µg aliquots) |
| PBFI/AM | Molecular Probes | P1267 | Special packaging (50 µg aliquots) |
| Nigericin | Sigma-Aldrich | N7143 | |
| KH2PO4 | JT Baker | 3246-01 | monobasic |
| NaOH | JT Baker | 5565-01 | |
| K2HPO4 | JT Baker | 4012-01 | dibasic |
| BCECF/AM | Molecular Probes | B1170 | Special packaging (50 µg aliquots) |
| CCCP | Sigma-Aldrich | Protonophore that causes an influx of H+ into the cytoplasm, dissipating the electrical potential and the H+ gradient. | |
| Culture tube | VWR | 53283-802 | Fits the Spectronic spectrophotometer; borosilicate glass |
| Spectrophotometer | Thermo Scientific | Spectronic 20D+ | |
| 15 ml Plastic conical tube | Corning | 430790 | |
| Clear 96-well polystyrene microtiter plate | Fisher Scientific | 12-565-501 | |
| Plate reader | BioTek | Synergy 2 Multi-Mode | |
| Gen5 software | BioTek | Gen5™ Software |
References
- Hakansson, A., Zhivotovsky, B., Orrenius, S., Sabharwal, H., Svanborg, C. Apoptosis induced by a human milk protein. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92 (17), 8064-8068 (1995).
- Hakansson, A., et al. A folding variant of alpha-lactalbumin with bactericidal activity against Streptococcus pneumoniae. Mol. Microbiol. 35 (3), 589-600 (2000).
- Hakansson, A. P., Roche-Hakansson, H., Mossberg, A. K., Svanborg, C. Apoptosis-Like Death in Bacteria Induced by HAMLET, a Human Milk Lipid-Protein Complex. PLoS One. 6 (3), (2011).
- Kohler, C., Gogvadze, V., Hakansson, A., Svanborg, C., Orrenius, S., Zhivotovsky, B. A folding variant of human alpha-lactalbumin induces mitochondrial permeability transition in isolated mitochondria. Eur. J. Biochem. 268 (1), 186-191 (2001).
- Ly, J. D., Grubb, D. R., Lawen, A. The mitochondrial membrane potential (Δψ m) in apoptosis; an update. Apoptosis. 8 (2), 115-128 (2003).
- Dominguez, D. C. Calcium signalling in bacteria. Mol. Microbiol. 54 (2), 291-297 (2004).
- Corratge-Faillie, C., Jabnoune, M., Zimmermann, S., Very, A. A., Fizames, C., Sentenac, H. Potassium and sodium transport in non-animal cells: the Trk/Ktr/HKT transporter family. Cell Mol. Life Sci. 67 (15), 2511-2532 (2010).
- Szabo, I., Petronilli, V., Zoratti, M. A patch-clamp study of Bacillus subtilis. Biochim. Biophys. Acta. 1112 (1), 29-38 (1992).
- Zoratti, M., Petronilli, V., Szabo, I. Stretch-activated composite ion channels in Bacillus subtilis. Biochem. Biophys. Res. Commun. 168 (2), 443-450 (1990).
- Novo, D., Perlmutter, N. G., Hunt, R. H., Shapiro, H. M. Accurate flow cytometric membrane potential measurement in bacteria using diethyloxacarbocyanine and a ratiometric technique. Cytometry. 35 (1), 55-63 (1999).
- Novo, D. J., Perlmutter, N. G., Hunt, R. H., Shapiro, H. M. Multiparameter flow cytometric analysis of antibiotic effects on membrane potential, membrane permeability, and bacterial counts of Staphylococcus aureus and Micrococcus luteus. Antimicrob. Agents Chemother. 44 (4), 827-834 (2000).
- Shapiro, H. M. Membrane potential estimation by flow cytometry. Methods. 21 (3), 271-279 (2000).
- Shapiro, H. M. Microbial analysis at the single-cell level: tasks and techniques. J. Microbiol. Methods. 42 (1), 3-16 (2000).
- Bashford, C. L., Chance, B., Smith, J. C., Yoshida, T. The behavior of oxonol dyes in phospholipid dispersions. Biophys. J. 25 (1), 63-85 (1979).
- Suzuki, H., Wang, Z. -Y., Yamakoshi, M., Kobayashi, M., Nozawa, T. Probing the transmembrane potential of bacterial cells by voltage-sensitive dyes. Anal. Sci. 19 (9), 1239-1242 (2003).
- Breeuwer, P., Abee, T. Assessment of the membrane potential, intracellular pH and respiration of bacteria employing fluorescence techniques. Mol. Microb. Ecol. Manual. 8, 1563-1580 (2004).
- Mortimer, F. C., Mason, D. J., Gant, V. A. Flow cytometric monitoring of antibiotic-induced injury in Escherichia coli using cell-impermeant fluorescent probes. Antimicrob. Agents Chemother. 44 (3), 676-681 (2000).
- Clementi, E. A., Marks, L. R., Duffey, M. E., Hakansson, A. P. A Novel Initiation Mechanism of Death in Streptococcus pneumoniae Induced by the Human Milk Protein-Lipid Complex HAMLET and Activated during Physiological Death. J. Biol. Chem. 287 (32), 27168-27182 (2012).
- Trombe, M. C., Laneelle, G., Sicard, A. M. Characterization of a Streptococcus pneumoniae mutant with altered electric transmembrane potential. J. Bacteriol. 158 (3), 1109-1114 (1984).
- Trombe, M. C. Characterization of a calcium porter of Streptococcus pneumoniae involved in calcium regulation of growth and competence. J. Gen. Microbiol. 139 (3), 433-439 (1993).
- Marks, L. R., Clementi, E. A., Hakansson, A. P. Sensitization of Staphylococcus aureus to Methicillin and Other Antibiotics In Vitro and In Vivo in the Presence of HAMLET. PLoS ONE. 8 (5), (2013).
- Futsaether, C. M., Johnsson, A. Using fura-2 to measure intracellular free calcium in Propionibacterium acnes. Can. J. Microbiol. 40 (6), 439-445 (1994).
- Tisa, L. S., Adler, J. Chemotactic properties of Escherichia coli mutants having abnormal Ca2+ content. J. Bacteriol. 177 (24), 7112-7118 (1995).
- Werthen, M., Lundgren, T. Intracellular Ca2+ mobilization and kinase activity during acylated homoserine lactone-dependent quorum sensing in Serratia liquefaciens. J. Biol. Chem. 276 (9), 6468-6472 (2001).
- Avery, O. T., MacLeod, C. M., McCarty, M. Studies on the chemical nature of the substance inducing transformation of pneumococcal types. Induction of transformation by a dexoxyribonuceic acid fraction isolated from pneumococcus type III. J. Exp. Med. 79, 137-158 (1944).
- Clementi, E. A., Wilhelm, K. R., Schleucher, J., Morozova-Roche, L. A., Hakansson, A. P. A Complex of Equine Lysozyme and Oleic Acid with Bactericidal Activity against. PLoS One. . 8, (2013).
