Summary
진핵 생물에 본 것과 달리, 주로 작은 크기로 박테리아의 세부 막 탈분극 및 이온 농도 변화 측정 어려운 종래의 방법을 만드는 것이 연구의 소수가있다. 여기, 우리 형광 기술을 이용하여 중요한 그람 양성 병원균 폐렴 구균에 이러한 이벤트를 모니터링하기위한 세부 프로토콜.
Abstract
막 탈분극과 이온 플럭스로 인해 깊이 지학 및 신호 transductions 등의 세포 기능을 영향을 미칠 수있는 능력을 생물학적 시스템에서 광범위하게 연구 된 이벤트입니다. 전극 사용량 및 패치 클램프 등 모두 형광 및 전기 생리 방법은, 잘 진핵 세포에서 이러한 이벤트를 측정하기 위해 개발되었지만, 미생물의 유사 이벤트를 측정하기위한 방법은 더 복잡와 함께 그들의 작은 크기 관련 개발하기 위하여 도전 입증 멤브레인을 차폐 박테리아의 외면. 폐렴 구균 (폐렴 구균)의 죽음을 시작으로 우리의 연구 기간 동안, 우리는 극성의 변화, 무결성, 세포 내 이온 농도 등의 막 이벤트의 역할을 명료하게하고 싶었다. 문헌 검색, 우리는 거의 연구가 존재하는 것으로 나타났습니다. 다른 연구자들은 이온 독감을 측정하는 방사성 동위 원소의 흡수 또는 평형을 모니터링했다XES과 막 잠재력과 주로 그람 음성균에있는 연구의 제한된 수의, 막 전위를 측정하는 carbocyanine 또는 옥소 놀 형광 염료를 사용, 또는 (AM) 에스테르 버전 세포 투과 아세와 박테리아를로드하는 일부 성공을 볼 수 없었다 이온 성 형광 표시기 염료. 따라서 우리는 그람 양성 유기체 S.에서 막 전위, 파열, 이온 수송을 측정하기위한 프로토콜을 설립 최적화 폐렴. 우리의 방법이 최적의 비율 적 염료 AM 에스테르와 폐렴 구균을로드로 각각 막 탈분극 및 파열을 측정뿐만하는 비스 - 옥소 놀 염료 DiBAC 사 (3) 및 휴대 impermeant 염료 프로피 듐 요오다 이드를 사용하는 프로토콜을 개발 의 Fura-2, PBFI 및 BCECF은 형광 검출 플레이트 리더를 사용하여, 칼슘 2 +, K +, H +를 각각의 세포 내 농도의 변화를 검출한다. 이러한 프로토콜은 폐렴 구균에 대한 자신의 종류의 첫번째입니다이들 염료의 대부분은 다른 세균 종에 사용되지 않았다. 우리의 프로토콜은 S.에 최적화되어 있지만 폐렴, 우리는 이러한 접근 방식이 다른 종의 박테리아에서 유사한 연구를위한 훌륭한 출발점을 형성해야한다 생각합니다.
Introduction
우리 연구실은 종양 세포의 세포 사멸을 유도 (종양 세포에 치명적인 만든 인간의 알파 - 락트 알부민을위한) 햄릿이라는 인간의 우유에서 단백질 지질 복합체를 확인뿐만 아니라, 세균 종 1,2의 다양한 죽일 수있다. 특히 민감한 것으로 발견 된 종은 최대 감도와 죽음 2,3의 세포 사멸과 같은 표현형을 표시하는 폐렴 구균 (폐렴 구균)와 호흡 기관을 대상으로 그들이었다. 막 탈분극과 특정 이온 전송 이벤트는 잘 설명하고 방사성 TPP + 이온과 JC-1과 TMRE 등의 형광 염료는 미토콘드리아 막 3의 탈분극을 설명하는 데 사용 된 미토콘드리아, 특히 진핵 세포에서 세포 사멸 중에 중요한 이벤트 -5. 따라서, 우리는 우리가 우리의 노력을 집중으로 폐렴 구균 이러한 막 관련 기능에 햄릿의 효과에 대한 자세한 내용을 보려면 모색그 과정에서 새로운 항균 치료 또는 백신 후보를 식별하기위한 큰 잠재력을 가진 박테리아의 세포 사멸과 같은 표현형의 기계적 구성 요소의 더 나은 이해를 개발할 수 있습니다.
우리 역학적 연구를위한 프로토콜을 확립하고자, 우리는 진핵 시스템에서 잘 설명 된 방법론 달리 박테리아 막 6,7의 전기 생리학 및 이온 수송 메커니즘을 상세히 거의 발표 된 연구가 있다는 것을 발견했다. 이것은 주로 작은 미생물의 크기와 그 표면 구조, 거 원형질체를 사용하여 일부 연구는 혼합 성공적으로 수행되었지만 특히 칸막이 벽의 존재, 즉, 패치 클램프 같은 종래 진핵 방법의 사용을위한 멤브레인의 접근성을 제한에 기인 8,9. 그것은 사람을 필요로하기 때문에 이러한 거대한 원형질체와 작업은 대부분의 세균 종을위한 이상적인 또는 실용적인 방법이 아니므로ipulated 박테리아 부자연 및 비 생물 적 상태에서 수행 된 박테리아 막 극성의 한정된 연구는 주로 유세포 분석기를 사용하고 형광 시아닌 및 옥소 놀 염료의 사용은 10-16.
하나의 시점에 하나의 박테리아에서 개별 형광 판독 값을 수집하는, 유동 세포 계측법 대신에, 우리는 시간이 지남에 따라 96 - 웰 플레이트 형식으로 세균 현탁액의 형광 강도를 검출하는 형광 검출 플레이트 판독기를 사용하여 선택 하였다. 이것은 훨씬 더 단순 다양한 시점에서 박테리아의 인구를 치료하고 완화, 지속적으로 유동 세포 계측법 사용하여 달성하기 어려운 시간의 연장 기간에 전체 인구의 형광 반응 속도를 모니터링 할 수있었습니다. (미토콘드리아와 함께 사용하기 위해 상기 언급 된 것 등) 전위에 민감한 형광 염료의 다양한 테스트 후에, 우리가 사용하는 최상의 기술 및 실제 성공을 달성DiBAC 4라는 비스 - 옥소 놀 염료 (3) (비스 - (1,3 - dibutylbarbituric 산) trimethine의 옥소 놀) 극성의 변화를 모니터링 할 수 있습니다.
우리는 또한 귀중한 동시에 요오드화 프로피 듐 (PI)을 사용하여 멤브레인의 무결성을 모니터링하기 위해 중단되었다고. 이 염료는 핵산에 결합에 형광하지만, 세균 세포막의 무결성이 그 라이브 죽은 염색 분석에 죽은 세포를 감지하는 데 사용되는 인기있는 구성 요소 만들기, 손상되었을 때 그렇게 만 할 수 있습니다. PI 이외에, SYTOX 녹색과 TO-PRO-1 액션 유사하며, 이전에 검출 방법 17 유동 세포 계측법을 사용하여 몇 가지 연구에서 박테리아에 사용 된 형광 염료이다. 우리는 때문에 우리는 주어진 샘플에서 DiBAC과 동시에 자사의 형광을 모니터링 할 수는 여기 파장에 PI를 사용하기로 결정했습니다.
우리의 연구에서, 우리는 햄릿뿐만 아니라 살균 작용을 가진 다른 관련 단백질 - 지질 복합체를 관찰폐렴 구균 3,18,26의 치료시 두 염료의 형광의 증가로 표시된 바와 같이 세균 막 ELOA 유도 탈분극과 파열로 알려져 있습니다. 두 착물을 위해, 우리는 DiBAC (4)의 형광 강도 (3) 탈분극 파열 이전에 발생했음을 나타내는 전에 PI의 강도 증가로 증가하고 있음을 관찰 그러므로, 우리의 살균성 단백질 - 지질 복합체에 의해 유도 된 특정 이벤트 관심. 이 구별은 막의 파열 자체가 특이 탈분극을 일으킬 수 있도록하는 것이 중요합니다. DiBAC 4를 모두 측정 및 분석 (3) 및 PI 형광 반응 속도는 동시에 우리는 형광 측정을 사용하는 대신에 유동 세포 계측법의 추가 이점이 두 개의 막 이벤트 사이의 관계를 조사 할 수 있었다.
세균 이온 플럭스를 모니터링하기 위해,의 이해를 측정하는 등의 방사성 동위 원소를 사용하여 몇 가지 이전의 성공이 있었다45 카 우리는 또한 우리의 최근의 연구 (18), (21)에 사용한 폐렴 구균 19, 20, 2 +. 그러나 이러한 방사성 이온으로 작업하는 몇 가지 단점이 있습니다. 그들은 비용이 많이들 수 있습니다, 시간이 많이 소요하고, 지저분한, 또한 관심의 동위 원소에 따라, 해를 실험을 수행하는 개인을 노출 할 수 있습니다. 또한, 시간이 지남에 급격한 변화를 모니터하는 것은 곤란하다. 따라서, 우리는 이온 성 형광 표시기 염료의 아세 (AM) 에스테르 버전을 사용 측정하는 다른 방법을 향하고. 그 자체로, 지시 염료가 충전되어 쉽게 막을 통과하지 않지만, 친 유성 에스테르 기의 추가와 함께, 현재 대전 된 분자는 세균의 세포막을 통과 할 수있다. 내부에 들어 서면, 세균 에스 테라 제는 충전을 다시 크게 셀을 종료 할 수있는 능력을 둔화 및 허용 염료 T 세포 내부 무료 염료를 떠나, 에스테르 그룹을 절단하고O는 시간이 지남에 따라 내부에 축적된다. 그러나 이러한 에스테르 염료의 사용은로드, 감지, 성공의 다양한 방법으로, 세포 내 칼슘 2 + 22 ~ 24과 H + 16의 변화를 감지하는 몇 종의 박테리아에 설명되어 있습니다.
세포 내 칼슘의 변화를 모니터하는 욕망 2 +와 S.에도 K +와 H + 레벨 폐렴은 햄릿과 다른 화합물과 치료에, 우리는 성공적으로 효율적으로 박테리아 세포에 형광 표시기 염료를로드하는 프로토콜을 만들었습니다. 음이온 수송 및 PowerLoad, 적재 효율을 증가 생명 기술의 독점적 인 화합물을 차단하여 색소 보존을 증가 모두 프로 베네 시드를 요구 박테리아에 효과적인로드. (K +을 검출)은 fura-2/AM 중 (Ca 2 +을 검출), PBFI / AM, 및 BCECF / AM (H의 +를 검출)을 성공적으로 캡슐화 및 캡슐화 모두 폐렴 구균 성으로로드 된형광 검출 플레이트 리더 18, 21을 사용하여 (K + uncoupler)와 CCCP (H + uncoupler을) 발리 노마 이신 (Valinomycin) 등 이오 노마 이신 (칼슘 2 + uncoupler) 등 ionophores, 첨가 한 후, 그 결과 형광 패턴의 측정을 가능하게 비.
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Protocol
1. 세균 배양을 준비
- 실험에 사용하기 위해 문화를 성장
- 37 ° C에서 가열 블록에서 S.의 고정 된 주식 병을 녹여 폐렴과 신선한 9 ml의 내용을 추가, 유리 문화 튜브에 10 ㎖의 총 볼륨의 0.5 % 효모 추출물 (THY)와 토드 휴이트 국물을 데워진.
- 문화가 중반 로그 단계 (상승률의 600 ㎚ ≈ 0.5 ~ 0.6)에 도달 할 때까지 37 ° C에서 정적으로 품어.
2. 막 탈분극과 파열을 검출
- 준비 시약
- DiBAC 4의 50 μm의 주식 (3) 100 % DMSO에서, 그리고 DDH 2 O.에서 PI의 2 ㎎ / ㎖ 재고를 준비 DiBAC 4 (3) 주식은 6 개월 이상 -20 ° C에서 안정적이다. PI의 주식은 6 개월 이상 4 ° C에서 안정적이다.
- 빛으로부터 보호하기 위해 호일 주식을 감싸십시오.
- 로딩박테리아
- 실온에서 10 분 동안 2,400 XG에서 원심 분리 단계 1.2.2에서 박테리아 세포 펠렛 및 2400 XG에서 다시 1X 인산 완충 생리 식염수 (PBS), 및 원심 분리기 10ml에 펠렛을 재현 탁, 상청액을 제거하여 두 번 씻어 10 분.
- 원래 볼륨에 PBS에 뜨는에 resuspend 펠렛을 제거합니다. 이 밀리리터 당 세균의 약 10 8 집락 형성 단위에 제공 할 것입니다. 세척 세포 (5 샘플에 대한 충분한) 1 ㎖를 제거하고 microcentrifuge 관에 배치합니다.
- 이 세포에 25 mM의 포도당의 최종 농도 포도당의 1 M 필터 살균 원액 (DDH 2 O에서 제조 및 0.45 μm의 필터를 통해 여과)의 25 μl를 추가하고 37 ° C 가열 블록에 품어 십오 분. 참고 :이 모든 ATP 의존 막 채널과 세포 성분을위한 에너지를 제공합니다. 이 단계에 대한 필요성은 실험에 따라 다를 수 있습니다.
- 50 μM DiBAC 4 (3) 주식의 5 μL 및 2 ㎎ / ㎖ PI 주식의 10 μl를 추가합니다. 이 각각 250 nM의 최종 농도 20 ㎍ / ㎖를 제공한다. 피펫 팅에 의해 여러 번 아래 철저하게 섞는다. 분명 96 - 웰 플레이트의 각 샘플 아니라이 세포 현탁액 200 μl를 추가합니다.
- 형광 검출
- 예비 가온 (37 ℃) 형광 검출 플레이트 리더의 장소 접시.
- 적절한 필터 DiBAC 4 (3) (490 nm의 여기, 516 nm의 방출)와 PI (535 nm의 여기, 617 nm의 방출) 검출 위치에 있는지 확인합니다.
- 독서가 안정 될 때까지 (3) 막에 약 30 ~ 40 분 동안 모든 분 형광 측정을 수행 할 수있는 리더를 설정하거나 DiBAC 4의 평형을 (그리고 동시에 모니터링)을 허용하기 위해,이는 "전처리"독서 역할을합니다.
- 접시를 꺼내 선택의 실험 에이전트를 추가하고 IMMEDiately DiBAC 4 원하는 시간에 대한 (3) 및 PI 형광 모니터링을 계속 독자에 다시 접시를 놓습니다. 멀티 채널 피펫을 사용하여 한 번에 여러 개의 샘플을 처리하는 것은 모든 우물에 동시에 에이전트를 추가하는 것이 도움이 될 수 있다면.
- Microsoft Excel과 같은 데이터 분석 프로그램으로 측정 값을 내 보냅니다. 막 탈분극과 파열을 평가하는 시간에 플롯 형광. DiBAC와 PI의 증가 형광 탈분극과 파열이 발생하고 있음을 나타냅니다.
3. 세포 내 칼슘 2 + 또는 K + 농도의 변화를 감지
- 준비 시약 및 로딩 버퍼
- 다음과 같은 시약을 준비 이온에 민감한 형광 염료의 5 mM의 재고 (fura-2/AM을 또는 PBFI / AM는, 염료의 50 μg을 포함하는 튜브에 DMSO의 적절한 금액을 추가), "100 배는"프로 베네 시드 (추가 1 77 mg을 유리 병에 PBS의 ML). 가용화염료는 -20 ° C 한 번에 냉동과 프로 베네 시드 6 개월 -20 ° C에서 용액에 안정되어있는 반면, 3 개월, 솔루션에 안정 될 수있다.
- 다음과 같이 2 배는 버퍼로드 1 ㎖를 준비 : 15 ML 플라스틱 원뿔 관의 바닥에, 5 mM의 이온 2 μL 다음 (6 개월 2-8 ° C에서 안정적) 100X PowerLoad 농축의 20 μl를, 분배 직접 PowerLoad에 민감한 염료. 소용돌이 간략하게 혼합한다. 100 배 프로 베네 시드 20 ㎕ 다음 PBS 960 μl를 추가합니다. 혼합 한 마지막 시간을 소용돌이. 빛으로부터 보호하기 위해 호일에 싸.
- 염료와 박테리아를로드
- 펠렛 및 2.2.1에 설명 된대로 중반 로그 단계 박테리아 문화를 씻는다. "2 배"세포 현탁액을 만들기 위해 PBS 5ml에 뜨는에 resuspend 펠렛을 제거합니다.
- 배 로딩 버퍼에 2 배의 세포 현탁액 1 ML을 추가합니다. 이는 2 ㎖의 최종 부피, 최종 concentr을 제공합니다1X PowerLoad, 5 μm의 형광 염료 및 1X의 프로 베네 시드의 관리 포인트. 참고 : 측정을 위해 각 샘플도 200 μl를 포함하는 것이기 때문에이 정지 10 샘플에 대한 충분한 음량을 제공합니다.
- 빛으로부터 보호 75 분 동안 37 ° C의 물을 욕조에 품어. 주 : 염료가 임의의 당분 해 기판 부재와 염료의 유출을 최소화하는 프로 베네 시드의 존재 하에서 박테리아 세포에로드된다.
- WASH 1 : 10 분 2,400 XG에서 원심 분리하여 펠렛은 세포 상층 액을 제거하고, 2 ㎖의 PBS에 재현 탁은 1X 프로 베네 시드를 포함. WASH 2, 3 단계를 반복 3.2.4 배. 또 다른 30 분 동안 37 ° C에서 알을 품다. 이 세균 에스 테라 제 시간 거리에 내면화 형광 염료의 AM 에스테르 그룹을 가수 분해 할 수 있습니다.
- WASH 4 : 10 분 2,400 XG에서 원심 분리하여 펠렛은 세포 상층 액을 제거하고에 resuspend 1X 프로 베네 시드를 포함하는 PBS 2 ㎖에. 참고 : experime에 따라NT, 포도당은 다시 활력을 불어 박테리아에 여기에 다시 추가 할 수 있습니다.
- 형광 검출
- 37 ° C.에 형광 검출 플레이트 리더 플레이트 리더를 Prewarm
- 원하는 각 샘플의 경우, 96 - 웰 플레이트의 우물 (단계 3.2.8에서)로드 셀 200 μl를 추가합니다. (한 번에 하나의 잘 / 샘플 완료 다음 단계를 수행).
- 의 ( "값 1"과 "값 2"에 대한 380 nm의 여기 / 510 nm의 방출을 위해 340 nm의 여기 / 510 nm의 방출) 형광을 측정하는 형광 검출 플레이트 리더에 잘 장소 접시 독서 기준을 설정하려면 1 분간 모든 초.
- 접시를 꺼냅니다 (약 5 μL의 작은 볼륨)이 아니라에 선택의 처리를 추가, 신속하게 피펫 몇 번 아래로 혼합하고, 즉시 원하는마다 초를 읽을 형광 검출 플레이트 리더에 다시 배치 시간의 길이. (만약에플레이트 리더와 관련된 젝터)이도 완벽하게 읽기를 중지하고 판을 배출 할 필요없이, 원하는 치료를 추가하는 데 사용할 수있는, 사용할 수 있습니다.
- Microsoft Excel과 같은 데이터 분석 프로그램으로 측정 값을 내 보냅니다. 값이 값 1로 분할하여 각각의 시간 지점에 대한 형광 값의 비율을 계산하고, 그래프의 비율 값을 플롯.
4. 세포 내 pH의 변화 감지
- 준비 시약 및 교정 버퍼
- 다음과 같은 시약을 준비 BCECF / AM의 5 mM의 주식은 (. 염료의 50 μg을 포함하는 튜브에 DMSO의 적절한 금액을 추가이 재고 3 개월 -20 ° C에서 안정), 100 배 프로 베네 시드 (1 ㎖의 추가 PBS 77 mg을 유리 병에). 에탄올 nigericin의 1 ㎜ 주식 준비는 주변 버퍼의 pH의 세포 (세포의 pH (산도 나는 평형 필수)이 주식들입니다6 개월 -20 ° C)에서 테이블;. DMSO (양성자 동기가되는 힘을 풀다하는 protonophore 카보 닐 시안화 3 chlorophenylhydrazone (CCCP)의 0.5 mM의 주식이 주식은 6 개월 -20 ° C에서 안정)
- 135 밀리 KH 2 PO 4 / 20 밀리미터의 NaOH (염기), 110 mM의 K 2 HPO 4 / 20 밀리미터의 NaOH (이염) : 다음과 같은 높은 칼륨 버퍼 10 ㎖를 준비합니다. 필터는 0.45 μm의 필터를 사용하여 멸균. (이 버퍼를 사용할 때까지 4 ° C에 저장할 수 있습니다.)
- 6.5-8.0까지 적어도 5-6 pH 값과 높은 칼륨 버퍼를 생성하기 위해 필요한 비율에 높은 칼륨 버퍼를 섞는다.
- 다음과 같이 2 배는 버퍼로드 1 ㎖를 준비 : 15 ML 플라스틱 원뿔 관의 바닥에 직접 PowerLoad에 5 mM의 이온 성 염료 20 ㎕ 다음에 100 배 PowerLoad의 40 μl를, 분배. 소용돌이 간략하게 혼합한다. 100 배 프로 베네 시드의 40 μL 다음 PBS 900 μl를 추가합니다. Vort예 혼합 한 마지막 시간. 빛으로부터 보호하기 위해 호일에 싸.
- 염료와 박테리아를로드
- 펠렛 및 2.2.1에 설명 된대로 중반 로그 단계 세균성 문화의 8 ㎖를 씻어. "배"세포 현탁액을 만들기 위해 PBS 2 ml의 상층 액에 resuspend 펠렛을 제거합니다.
- 배 로딩 버퍼에 4 배의 세포 현탁액 1 ML을 추가합니다. 이는 2 ㎖의 최종 부피, 배 세포의 최종 농도 2 배 PowerLoad, 50 μM 형광 염료 및 배 프로 베네 시드에 제공 할 것입니다.
- 빛으로부터 보호 40 분 동안 30 ° C의 물을 욕조에 품어. NOTE : 염료가 30 ° C의 낮은 온도에서 염료의 유출을 최소화 할 수있는 당분 해 기판의 부재하에 세균 세포에로드된다.
- WASH 1 : 펠렛 10 분 2,400 XG에 원심 분리하여 세포가 과잉 색소를 제거하는 상층 액을 제거하고, 4 ㎖의 PBS에 재현 탁 2 배 프로 베네 시드의를 포함차 1 mM의 포도당 (박테리아를 재 활성화하기 위해). WASH 2, 3 배 프로 베네 시드와 10 mM의 포도당을 함유하는 (1X 세포의 최종 농도) 4 ㎖의 PBS의 최종 재 부상과 두 단계를 반복합니다 4.2.7.
- 5 분 동안 37 ° C에서 알을 품다. 이것은 세포가 완전히 재충전 멀리 내재화 BCECF에서 AM 에스테르기를 절단하는 세균 에스 테라위한 시간을 허용하는 것을 허용 할 것이다.
- 배경 형광을 수립하고 생체 내 보정 곡선
- 37 ° C.에 형광 검출 플레이트 리더 플레이트 리더를 Prewarm
- 배경 형광을 확인하려면, 박테리아를 제거한다 (단계 4.2.7에서)로드 및 통전 세균 현탁액 500 μl를 필터 소독, 및 96 - 웰 플레이트의 웰에 여과 액을 200 μl를 추가합니다.
- (490 nm의 여기 / 530 nm의 방출 형광을 측정하는 형광 검출 플레이트 리더의 판을 놓습니다"값 1"1 분 "값 2")에 대한 440 nm의 여기 / 530 nm의 방출. 이 배경 형광이 검량선 및 실험 샘플 모두에 대한 비율을 계산하기 전에 감산한다.
- 생체 내 보정 곡선을 얻으려면 (6.5-8.0까지) 다른 pH 값에서 높은 칼륨 버퍼에서 한 번에 resuspend 단계 4.2.7에서로드 및 통전 세포를 500 ㎕의 분취 액을 씻어.
- 주변의 버퍼의 pH에 세포의 세포 내 pH가 평형을 5 분 동안 37 ° C에서 배양 샘플에 20 μM의 nigericin를 추가합니다. 96 - 웰 플레이트의 우물에 세균 / pH 완충 조합의 200 μl를 추가합니다.
- 각 웰에 대한 꾸준한 독서를 확립하기 위해 몇 분 동안 형광을 측정하는 형광 검출 플레이트 리더 접시를 놓습니다. Microsoft Excel과 같은 데이터 분석 프로그램으로 측정 값을 내 보냅니다.
- 학사 학위를 뺀 후ckground 형광 값,이 값에 의해 값 1을 분할하여 형광 값의 비율을 계산한다. 검량선을 작성하기 위해 각각의 pH 완충액에 대한 비율 값을 플롯. (박테리아에로드되는 형광 염료의 양마다 다를 수 검량선은,로드 셀의 각 새로운 배치에 대해 생성되어야한다.)
- 세포 내 pH의 변화 측정
- 원하는 각 샘플의 경우, 96 - 웰 플레이트의 우물 (단계 4.2.7에서)로드와 활력 세포를 200 μl를 추가합니다.
- 형광 검출 플레이트 리더 접시를 놓고 5 분 동안 매 5 초마다 샘플의 형광을 측정합니다.
- 접시를 꺼내서 잘 하나 (세포 내 산도를 감소시키는 긍정적 인 제어 역할을) 다른 우물에 관심있는 실험 에이전트 (들)에 10 μM의 CCCP를 추가합니다. 정확하게, 시간이 지남에 따라 자신의 효과를 비교 오전를 사용하여 동시에 CCCP 선택의 에이전트를 추가하려면ultichannel 피펫.
- 즉시 플레이트 리더로 판을 반환하고 형광 10 분 동안 매 5 초마다 측정을 계속합니다. 추가 컨트롤과 같은 접시를 꺼내 주변의 버퍼의 pH에 박테리아의 pH 나는 평형을 모든 샘플에 20 μM Nigericin을 추가하고 5 분 동안 읽습니다.
- 배경 형광 값을 뺀 후, 각 샘플에 대한 형광의 비율을 계산합니다. 검정 곡선의 각 읽기의 pH 나 보간.
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Representative Results
모든 실험의 경우, 하나의 샘플과 각각의 웰에 존재하는 조건의 집합이 있습니다. 따라서, 각각의 추적은 시간이 지남에 박테리아의 전체 인구의 형광 강도를 나타냅니다. 결과는 처리 샘플 및 치료 컨트롤의의 형광 사이에 명확한 구분으로, 쉽게 해석 할 수 있어야합니다. 형광의 관찰 된 변화의 속도론 및 정도는 모니터되는 이벤트의 가능한 메커니즘과 범위에 대한 정보를 제공 할 수 있었다.
멤브레인의 극성을 탐색 할 때, 박테리아는 치료 전 꾸준한 감소 및도 1a에 형광 후속 수평으로 나타낸 바와 같이, 멤브레인 위에 염료의 평형을 허용하기 위해 약 40 분 동안 DiBAC 함께 배양 할 필요가있다. 그림 1B에서와 같이 자사의 형광 신호가 처음 40 분 배양, BU에 걸쳐 꾸준로, PI는 평형을 필요로하지 않습니다DiBAC과 함께 자신의 존재를 톤은 극성과 동시에 막 파열을 모니터링하는 것이 도움이된다. 탈분극 및 박테리아의 파열은 두 염료의 형광 강도의 증가에 의해 표시된다. 이러한 세제 (소듐 데 옥시 콜레이트 (18)), uncouplers 또는 ionophores (CCCP) 등의 탈분극 및 파열 가능한 다른 에이전트는 또한이 방법을 사용하여 이러한 이벤트를 보여주기 위해 첨가 될 수있다.
fura-2/AM을, PBFI / AM 및 BCECF / AM의 경우,이 형광 신호의 비율을 산출하고,이 비율에서 증가 또는 감소가 내 Ca 2 + (도 2)에 대응하고, K +는 (도 3 ), 및 H +는 각각 (그림 4)의 농도. 칼슘 이온 운반체의 이오 노마 이신의 첨가시, 캘리포니아 2 +는 형광 비율로 증가 (도 2)을 일으키는 세포로 유입된다. 발리 노마 이신 (Valinomycin)의 추가는 K의 원인이 반대의 효과가+ 세포 밖으로 흘러 형광 비율의 감소 (그림 3)으로 표시됩니다 세포 내 농도를 감소시킵니다. BCECF 먼저 공지 산도의 각종 버퍼의 존재 검량선 (도 4A)를 생성하여, 세포 내 pH를 측정한다. 양성자 구배 (도 4b)를 축소 protonophores의 CCCP 또는 nigericin, 첨가 한 다음에 보이는 염료의 형광 비의 감소는 pH의 감소에 대응한다.
그림 1. 막 교란 모니터링. S. 40 분은 m 이상의 DiBAC의 평형을 허용하는 폐렴 동시에 (A) DiBAC 및 (B)와 함께 배양 하였다 PIembrane. 이 배양 (화살표)의 끝에서, PBS는 (치료) 또는 HAMLET (처리)를 첨가하고, 샘플은 추가 시간에 읽을 수 있었다. 더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2. 세포 내 칼슘 농도의 변화를 감지. 폐렴 구균은 fura-2/AM을로드하고 (치료) PBS 또는 칼슘 이온 운반체의 이오 노마 이신 (양성 대조군)으로 (화살표)를 처리 하였다. 형광 값의 비율이 표시됩니다. 더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3. 세포 내 칼륨 수준의 변화를 감지. 폐렴 구균은 PBFI / AM로드 및 PBS (치료) 또는 칼륨 이온 운반체의 발리 노마 이신 (Valinomycin) (양성 대조군)으로 (화살표)를 처리 하였다. 형광 값의 비율이 표시됩니다. 더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4. 세포 내 수소 이온 농도의 변화를 감지. 세포 내 pH 보정에 대한 (A) 표준 곡선. (B) 폐렴 구균이 산도에 민감한 염료 BCECF-AM로드하고 있었다되었다세척하고 PBS의 + 포도당에 재현 탁. 기준 판독 값을 기록한 후, 제 화살표에서, PBS (흑), protonophore의 CCCP (100 μM) 또는 HAMLET (100 ㎍ / ㎖를 6 μM)는, 세균에 첨가하고, 형광은 시간이 지남에 따라 측정 하였다. 두 번째 화살표 nigericin에서 (20 μM)을 완전히 모든 샘플의 횡단 양성자 구배를 분산시켰다. 더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
크기 및 극성 막 및 박테리아 내 이온 농도의 변화의 무결성의 변화를 감지하는 전기 생리학 고전적인 방법을 사용하기 위해 제시 제한에도 불구하고, 우리는 S. 이러한 이벤트를 측정하는 방법을 설명했다 폐렴은 형광 염료를 사용. 우리의 프로토콜은 폐렴 구균 및 일반 세균 종에 대해 설명 된 몇 가지 중 하나에 대해 설명 자신의 종류의 첫번째이다. 형광 검출 플레이트 판독기를 사용하여 이러한 이벤트들은 시간이 지남에 박테리아의 개별 모집단으로부터 검출 형광성 박테리아의 소형, 200 μL 부피의 샘플을 측정 할 수있다. 형광 강도의 반응 속도와 변화는 질적으로 극성 또는 무결성을 막에 무슨 일이 일어나고 있는지를 결정하는 데 사용 될 수있다, 또는 칼슘 2 +, K +, 또는 박테리아 내에서 H +의 수준. 정량적으로 말하면, 형광 강도 값도 DEP의 정도를 계산하는데 사용될 수있다olarization, 파열, 칼슘 흡수, 칼륨 유출, 또는 pH 변화는 그 메커니즘에 대한 중요한 정보를 제공하고, 다른에 비해 하나의 샘플에서 관찰. 또한, 우리는 프로토콜 세균 종의 다양한 다른 셀룰러 이벤트의 다양한 연구를 허용 AM 다른 형광 염료를로드하기위한 시작점으로서 유용해야한다. 우리는 이미 황색 포도상 구균 (21)이 프로토콜을 적용에 성공했다.
AM 염료를 사용하는 경우, 충분한 배양 시간은 염료 로딩 및 박테리아 내 표적 이온에 응답하여 대응하는 형광의 변화를 수득 염료 필요한 후속 가수 분해를 달성하는데 중요하다. 로딩 반응 속도로 인해 세균의 표면 구조의 차이 (유출 펌프의 캡슐의 존재, 막 유동성, 존재, 등.) 등 여러 가지 요인과 화학적 구조의 O를 균주 사이에 차이가있을 수 있습니다F 염료. 배양 기간, 배양 온도, 양분 가용성, PowerLoad 농도 및 프로 베네 시드 농도 균주 및 그 염료에 대한 최대한의 부하를 달성하기 위해, 등의 변조가 필요할 수 있습니다 우리의 프로토콜의 여러 매개 변수가 있습니다. 성공적으로로드를 얻으려면, 형광 신호 강도는 ionophores의 또한 긍정적 인 컨트롤, 올바른 방향 및 / 또는 교정 곡선의 선형성을 나타내는에 신호를 제공하는 것을 보여주는보다 중요합니다. 염료의 돌출을 방지하기 위해 온도가 저하 하였다 PowerLoad 증가 및 Probenicide 농도로드를 최적화하는 것은 신호를 혼동한다 세포 염색을 초래할 수 염료 농도가 증가하는 것이 바람직하다. 우리의 프로토콜을 개발하는 동안, 우리는 성공적으로 야생형 캡슐화 된 폐렴 구균 균주 D39과 캡슐화 변형 R36A (25) 모두에 대한 관심이 우리의 염료를로드 할 수 있었다.그러나, 우리는 37 ° C의 배양 온도를 사용의 Fura-2와 PBFI 실험 R36A를 사용하여 증가 비율로 이어지는 형광 수치로 나타낸 바와 같이 높은 PowerLoad과 프로 베네 시드 농도와 결합 된 낮은 배양 온도는 더 나은 일 동안 우리는 최적의 부하를 얻을 수있는 것으로 나타났습니다 D39에 BCECF로드. 특정 신호 강도 실험 사이에 차이가있을 수 있지만, 측정의 비율 적 특성은 높은 재현성과 약간의 확산 결과를 제공했다.
가장 진보 된 플레이트 리더와 함께 제공되는 소프트웨어의 사용은 몇 가지 이름을, 감지 속도, 검출 감도 및 기간을 읽기 등의 검색 매개 변수의 다양한 조정을 허용 샘플의 형광 측정. 이 연구원은 모니터링중인 특정 이벤트의 검출을위한 최적의 감도를 찾을 수 있습니다. 결과의 최적 해석을 위해, 중요하다 불소 안정된 기준선escence 선형 표준 곡선은 막 위에 평형화 존재하는 염료의 양에 분석 간 변동이있을 수 있으므로, 구축, 또는 박테리아에로드 및 가수 분해된다. (3) 이전의 치료에 안정화 형광 수준을 허용 DiBAC 4를 사용하는 경우 이전에 어떤 종류의 치료에 세균 막에 염료의 평형 시간을 허용하는 것은 특히 중요하다. 테스트 될 세균 현탁액에 도입 실험 첨가제 자체가 검출의 특정 파장에서 autofluoresce하거나 비특이적의 형광을 수정할 수 있으므로 별도로, 각 분석에 적절한 제어를 모두 포함하여, 정확한 데이터 분석을위한 필수적인 표시는 직접 상호 작용을 통해 염색.
우리는 우리가 여기에서 기술 한 방법과 관련된 문제의 몇 가지 잠재적 인 영역을 인식하고 있습니다. carbocyanine 염료 DiOC 2 (3), DiBAC 4 (달리3) carbocyanine 염료 세포 부피의 변화, DiBAC 4 (3) 할 수 없습니다 설명 할 수 있도록하면서, 비율 계량하지 bisoxonol 염료입니다. 따라서, 세포 부피의 변화에 대응하는 형광의 수준의 변화가있을 수 있습니다. 폐렴은 세균을 파열하지 않고 볼륨에 큰 변화를 허용하지 않는 견고한 세포벽을 가지고 우리는, 그러나,이 중요한 문제로 인식하지 않았다. 세균성 이온 플럭스를 조사하기위한 이온 성 염료의 감도는 또한 이온 농도의 변화의 정도에 따라 달라질 수있다. 또한, 형광 염료의 사용은 직접 실험적으로 방사성 동위 원소를 사용하는 등의 방법이 아니다. 방사성 동위 원소의 사용과 관련된 모두 금융 및 안전 관련 제한 사항을 고려할 때 그러나, 그 이온에 따라, 형광을 검사하는 것은 훨씬 더 실용적인 옵션입니다. 따라서,이 논문에 설명 된 방법론은 신규하고 일관된 방식을 제공한다더 나은 연구 막 극성, 무결성 및 전송 이벤트에 박테리아 시스템에서 에스.
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Disclosures
저자는 선언 할 경쟁 금전적 이해 관계가 없습니다.
Acknowledgments
이 작품은 빌과 멜린다 게이츠 재단 (보조금 53,085), JR Oishei 재단과 미국 폐 협회 (부여 RG-123721-N) APH, 그리고 EAC에 NIH (NIDCD) 화목 F31DC011218에 의해 지원되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Todd-Hewitt broth | Bacto, BD Diagnostics | 249240 | |
| Yeast Extract | Bacto, BD Diagnostics | 212750 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS; pH 7.2) | Invitrogen (GIBCO) | ||
| Dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | D5879 | DMSO |
| DiBAC4(3) (bis-(1,3-dibutylbarbituric acid) trimethine oxonol) | Molecular Probes | B-438 | |
| Propidium Iodide | Sigma-Aldrich | P4170 | Make up in deionized water |
| D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | ||
| PowerLoad | Molecular Probes | P10020 | 100x concentrate |
| Probenecid | Molecular Probes | P36400 | Make 100x stock by adding 1 ml of PBS to one 77 mg vial |
| Fura-2/AM | Molecular Probes | F1221 | Special packaging (50 µg aliquots) |
| PBFI/AM | Molecular Probes | P1267 | Special packaging (50 µg aliquots) |
| Nigericin | Sigma-Aldrich | N7143 | |
| KH2PO4 | JT Baker | 3246-01 | monobasic |
| NaOH | JT Baker | 5565-01 | |
| K2HPO4 | JT Baker | 4012-01 | dibasic |
| BCECF/AM | Molecular Probes | B1170 | Special packaging (50 µg aliquots) |
| CCCP | Sigma-Aldrich | Protonophore that causes an influx of H+ into the cytoplasm, dissipating the electrical potential and the H+ gradient. | |
| Culture tube | VWR | 53283-802 | Fits the Spectronic spectrophotometer; borosilicate glass |
| Spectrophotometer | Thermo Scientific | Spectronic 20D+ | |
| 15 ml Plastic conical tube | Corning | 430790 | |
| Clear 96-well polystyrene microtiter plate | Fisher Scientific | 12-565-501 | |
| Plate reader | BioTek | Synergy 2 Multi-Mode | |
| Gen5 software | BioTek | Gen5™ Software |
References
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