The Proboscis Extension Response (PER) conditioning protocol, developed for the honey bee (Apis mellifera), provides an ecologically-relevant and easily quantifiable means for studying several different mechanisms of learning in many insect species.
Насекомые изменить свои ответы на раздражители через опыт их сопоставления стимулов с событий, важных для выживания (например, продукты питания, товарищей, угроз). Есть несколько поведенческие механизмы, посредством которых насекомое учится существенные ассоциации и относит их к этим событиям. Важно понять эту поведенческую пластичность для программ, направленных на оказание помощи насекомых, которые являются выгодными для сельского хозяйства. Это понимание также может быть использован для обнаружения решения для биомедицинских и сельскохозяйственных проблем, создаваемых насекомых, которые выступают в качестве переносчиков болезней и вредителей. Протокол кондиционирования Хоботок Расширение отклика (PER) была разработана для медоносных пчел (Apis MELLIFERA) более 50 лет назад, чтобы изучить, как они воспринимают и узнать о цветочных запахов, которые сигнализируют нектар и пыльцу ресурсов, выделяемых для колонии потребности для выживания. Процедура PER обеспечивает надежную и удобную в службе основу для изучения несколько различных экологически соответствующую механизмы поведенческой пластичности. Это можно легко адаптировать для использования с несколькими других видов насекомых и других поведенческих рефлексов. Эти протоколы могут быть легко использованы в сочетании с различными средствами для контроля нейронной активности в центральной нервной системе с помощью электрофизиологических или биоимиджинга, или для манипулирования целевых нейромодуляторного пути. Это надежный тест для быстрого выявления сублетальный воздействие на поведение, вызванное экологического стресса, токсинов и пестицидов.
Мы покажем, как протокол PER является просто реализовать с помощью двух процедур. Один подходит в качестве лабораторного упражнения для студентов или для быстрых анализов влияния экспериментального лечения. Другой предоставляет больше тщательный контроль переменных, что очень важно для изучения поведенческих кондиционирования. Мы покажем, как несколько мер по поведенческой реакции, начиная от бинарных да / нет, чтобы более непрерывной переменной, как задержки и длительности расширения хоботка может быть использован для тестирования hypotheseс. И мы обсудим некоторые подводные камни, которые исследователи обычно сталкиваются, когда они используют процедуру в первый раз.
Многие насекомые узнать о экологически соответствующих стимулов, и они затем изменить их поведенческие ответы на эти раздражители, чтобы адаптироваться к новым прогнозных отношений в своей среде. Несколько различных механизмов может лежать в основе этого поведения пластичность (например, неассоциативная, ассоциативная / Павлова и оперантного / инструментальный 1). Эти типы пластичности отличаются тем, как стимулы или поведения, связанные с важными событиями, такими как возникновения пищи, мат, или опасности. Понимание этих форм пластичности является очень важным для фундаментальных исследований в том, как нервная система изменяет кодировать новые воспоминания 2. Это также важно для понимания адаптивных поведения насекомых, которые являются важными переносчиками заболеваний (например, мухи цеце и комаров) и насекомых, которые в сельском хозяйстве важно, либо в растениеводстве (медоносных пчел) или как вредителей.
Изучение поведения пластичность в любом Анималь требуется уровень экспериментального контроля над числом переменных, что не достижимо в области 1. Это требует разработки надежной протокола кондиционирования, которые могут быть использованы в более контролируемых условиях, но которые все еще актуален для поведения в естественных условиях. Мед пчелы (Apis MELLIFERA) является прекрасной моделью для как разработать протокол для выполнения контролируемых анализы поведенческой пластичности 3,4. Хоботок Расширение отклика (PER) в медоносных пчел является естественной поведенческой рефлекс, в котором пчела расширяет свой хоботок в ответ на усиков стимуляции с раствором сахара. Во время нормального кормления поведения, PER происходит, когда пчела находит нектар в цветке. К счастью, пчелы охотно демонстрируют эту простую и легко поддающиеся количественному поведение в лаборатории. Это дает возможность учиться, в контролируемых условиях, механизмы, влияющие на этот экологически соответствующую поведение 5. PER чан также использоваться в рамках протокола кондиционирования для расследования стимула восприятие и обучения и памяти в различных условиях лечения, которые предназначены для выявления поведенческих и нервных механизмов, лежащих в основе пластичности 6.
С первых исследованиях Кувабара 7, PER кондиционирования широко используется для выявления неассоциативное, ассоциативную и оперантного механизмы, лежащие в основе поведения пластичность в медоносных пчел 8. Эти механизмы идентичны тем, которые показали в исследованиях свободно летающих пчел 9. В отличие от исследований свободно летающих пчел, протоколы НА кондиционирования могут быть связаны с электрофизиологии 10,11 или живых клеток флуоресценции изображений 12-14 мозга. Кроме того, протоколы НА позволяют экспериментальной манипуляции нервных путей через фармакологических или молекулярно-генетических методов лечения для проверки гипотез о роли конкретных компонентов сети, таких как Neuromodulators 15,16. Протоколы НА также предоставили важную способ оценить сублетальные последствия изменений экологических условий, а также токсинов на здоровье и нагула эффективности медоносных пчел 17.
Эта процедура описывает два способа доставки запах параллельно. Способ 1 является версия запаха и безусловный раздражитель (сахароза) поставки, который обеспечивает недорогой и технически простой метод для представления запах и сахарозы награду. Этот метод хорош для базовой подготовки и при автоматизации не представляется возможным. Это отличный способ представить эту технику к классе или преподавательской лаборатории. Во время кондиционирования для экспериментов с участием более сложные задачи и в сочетании физиологические оценки запаха восприятия, обучения, или памяти, это очень важно, чтобы аккуратно и точно регулировать начало, доставки продолжительность сроков раздражители. Для наиболее надежной доставки стимула, использовать средства автоматизации доставки запах Aй точный метод доставки вознаграждения. Способ 2 применяет автоматизированные доставку запаха и более точное сахарозы доставку. Это технически более сложным и требует более для первоначальной настройки, чем метод 1, но это значительно увеличивает согласованность сроков и количества стимулов, используемых для кондиционирования и должны быть использованы, когда это возможно.
Этот протокол представила две надежные методы для кондиционирования, используя процедуру PER. Это два из нескольких методов, которые были успешно использованы 27, 21. У нас работают Способ 2 для всех экспериментальных исследований с использованием PER как это последовательно надежный, даже в разных экспериментаторов.
Та же базовая процедура была адаптирована для различных видов исследований с медоносных пчел, в том числе использования различных стимулов для кондиционирования и различных поведенческих рефлексов. Он также был связан с исследований генетической основе различий в обучении 28,29, физиологические корреляты обонятельной восприятия и памяти в мозге 13,14,30, и модулирующие и молекулярно-генетические основы поведения 15,16,31 . В связи с передовыми знаниями экологической значимости обонятельной обучения в медоносных пчел, который начался с первых исследованиях Карла фон Фриша более 100 лет назад <suр> 31, результаты PER может быть легко связаны с потребностями выживания колонии. Совсем недавно, она была адаптирована для сельскохозяйственного исследования для расследования сублетальные поведенческих эффектов пестицидов и токсинов окружающей среды 17.
Основная процедура является мощным в том, что он может быть применен, чтобы исследовать проблемы в других видов, а также. Два вида моли, Мандука Секста и Spodoptera littoralis, были использованы в исследованиях ЗА исследовать нейронную основу идентификации запаха и обонятельных способностей 32,33 обучения каждого вида. НА эксперименты с плодовыми мушками предоставили много интересных идей в каскады молекулярных сигнальных участвующих в chemosensation и обучения 34. И PER недавно был использован для изучения привыкания в блошиный (Rhodnius prolixus) 35, важную с переносчиками болезней.
В целом, процедура является устойчивым к изменениям в способе; Использование Dметоды ifferent, скорее всего, производят такую же относительную разницу между группами лечения. Несмотря на относительно простой процедурой, несколько проблем может иногда предотвратить медоносных пчел от обучения запаха-сахароза ассоциацию. Следующие темы возможные изменения к протоколу и некоторые из наиболее распространенных проблем, которые могут возникнуть во время PER кондиционирования.
Соображения по количеству и типу испытаний в Протоколе кондиционирования
Любой протокол обучения потребует воздействие на пчел к ряду испытаний на этапе сбора данных. Это число во многом зависит от сложности задачи. Медоносные пчелы можете узнать простую задачу после одного судебного разбирательства, но они должны, по крайней мере три испытания, чтобы индуцировать образование долгосрочный накопительный. Как и ожидалось, медоносные пчелы потребует значительно больше испытаний, чтобы адекватно изучать сложную задачу. Как правило, существует максимальное число испытаний, за которым пчелы больше не существенно не улучшитьИК производительность. Этот максимум зависит от конкретной задачи, типы запахов и концентрациях, и концентрации сахарозы.
При использовании более одного типа проб с различных запахов, представить различные типы пробные в псевдослучайной последовательности держать пчел от запоминания простой последовательности запаха презентаций вместо того чтобы учиться различия между запахов 36. В этих псевдослучайных последовательностей, должно быть равное количество испытаний для каждого из типов запаха. Кроме того, вероятность того, что суда одного типа запаха предшествуют и следуют той же запахом, или любой из других запахов, должны быть равны для всех запахов. В течение двух запахов – А и В – использовать следующую последовательность: ABBABAAB. За восемь испытаний каждый запах представлена четыре раза. Объединить идентичные последовательности, чтобы достичь желаемого количества испытаний для каждого запаха.
Независимо от эксперимента, есть несколько параметров, которые должны оставатьсяКонстанта с целью оптимизации обучения. Перекрытие между CS и США имеет решающее значение для эффективного кондиционирования. Между пробная интервал (рисунок 1, таблица 1) должна быть постоянной и оптимизировать, потому что неправильность или слишком короткий или слишком длинный между пробная интервал может значительно влиять на эффективность протокола кондиционирования 1.
Соображения о важности и дизайна поведенческих испытаний тестирования
Ответы, записанные во время «этапа приобретения" эксперимента, когда CS и США представлены вместе, может быть полезно. Тем не менее, нужно учитывать, что условия запах презентаций может отличаться от одного типа суда в другой. Во время усиленных исследований, запах после чего сахарозы представлена в сочетании с визуального стимула (перемещение устройства для доставки сахарозы капли), которые могут влиять на реакцию пчелы. И пчелы имеют только три вторыхс, чтобы показать ответ (четыре секунды из запаха стимуляции минус один сек перекрытия сахарозой презентации; Рисунок 1). Если эксперимент предполагает пчел учатся различать два запахи (например, усиленный и неармированные), неармированные запах представлены на альтернативных испытаний происходит без зрительного стимула презентации награды и пчелы имеют полные четыре секунды, чтобы ответить. Таким образом, ответы на двух запахов не являются полностью сопоставимыми во время сбора. С любого протокола кондиционирования, не следует полностью полагаться на кривых приобретения 1. Чтобы лучше выяснить, что пчелы научились, ввести серию неармированных испытаний тестовых, в течение которого ни запах усиленную, которая гарантирует, что тестирование всех раздражителей происходит в одинаковых условиях.
В зависимости от конкретной цели эксперимента, тестирование может состоять из отдельных испытаний, условного запаха или серии испытаний с условной одили или сочетание условного и новых запахов. Один тест испытание условного запахом обеспечивает простой количественный анализ, помните ли пчелы 'условный запах. Тем не менее, ответ на первый тестовый суда может отражать уровень мотивации пчел, а также их отзыве условного запахом. Серии испытаний, либо серию испытаний экстинкции условного запаха или серии отдельных тестов условного и одного или нескольких новых запахов, также может быть использован для оценки памяти. Серия вымирания испытаний может оценить, насколько сильно помню пчелы 'условный ассоциацию. Чем сильнее напомним тем больше число испытаний, необходимых для тушения условного рефлекса. Серия одиночных испытаний условных и новых запахов может также оценить специфику память пчел условного запахом.
Кроме того, необходимо, чтобы состояние и проверить как контроль и обработанные группы в тех же временных точках. Comparчисле производительность пчел вскоре после кондиционирования для пчел, предназначенных для более длительных периодов времени является проблематичным вследствие воздействия сахарозы США путем подачи пчел насыщения. Например, снижение производительности после длительных интервалах может быть связано с распадом памяти или это может быть связано с изменениями в мотивационной государства и / или обучения, вызванных неармированном воздействия США, что делает результаты неоднозначны. Поэтому выступление группы лечения всегда должна оцениваться по отношению к контрольной группе условного и испытанной в тех же точках времени.
Запах Концентрация и Integrity
Есть несколько способов, в которых концентрация и целостность запахом (CS) может быть нарушена. Наиболее распространенной проблемой с доставкой запаха является истощение запаха картриджей от чрезмерного (Рисунок 2). Замена картриджей 10-12 использования (каждые 2 или 3 испытания с группами 5 медоносных пчел), чтобы избежать этой ловушки. Важно также использоватьсвежие картриджи для испытаний,, так как использованные картриджи можно по-разному, истощенные и, таким образом, представляют неравные запах раздражители. Другой распространенной проблемой является запах загрязнения картридж в связи с использованием этого картриджа в течение более одного запаха без полного его очистки. Грязный или загрязненных воздушный поток может также непреднамеренно занести дополнительную обонятельный стимул (активированный уголь фильтры могут предотвратить фонового загрязнения). Это особенно проблематично, когда муфта НА кондиционирования с измерениями физиологических ответов на запах. Дырявый запах картриджи представляют собой проблему, так как пчелы подвергаются запах до начала судебного разбирательства, что снижает важность заботы о запаха стимула. Свободной одежде подачу воздуха для доставки запаха может привести к небольшим или никаким доставки запаха, когда клапан открывается, искусственно уменьшая реакцию пчел к предполагаемому запахом.
Раствор сахарозы и безусловного раздражителя (Награда)
крепление, концентрация, и целостность раствора сахарозы, используемой как США имеют жизненно важное значение для успеха эксперимента. Кондиционер является функцией от количества и концентрации раствора сахарозы и воды, используемой в США 37. Микрометра шприцы, используемые в способе 2 позволяют очень точно (до 0,2 мкл) контролем США поставки, и мы рекомендуем использовать их для обоих методов, описанных. Использование зубочистки (метод 1) является достаточным для обстоятельств, в которых не могут быть использованы дорогие шприцы, например, в обучении больших групп студентов, работа в поле, или с более низкими бюджетами. Тщательное выполнение Способ 1 прекрасно до тех пор, как выбор времени поддерживается с регулярной замены зубочистки, чтобы избежать накопления сахарозы (и концентрацию доставлено). Тем не менее, с помощью зубочистки это более трудно точно контролировать и оценивать количество и величину США доставлено, что очень важно для кондиционирования исследований 1. Концентрация сахарозы необходимообеспечить достаточное вознаграждение, чтобы сохранить пчел мотивированы, чтобы узнать условной связи может зависеть от сложности задачи и внутреннего состояния пчел или времени года. Более сложные задачи требуют более высокой раствор сахарозы для пчел »успешно учиться задачу. CAN наращивание Mold в растворах сахарозы даже при 5 ° С, который поставит под угрозу целостность решения, влияющие на здоровье и восприятие награды пчел во время эксперимента. Лучше всего заменить решение каждые несколько дней.
Точность, Ремень, и Согласованность CS и США Доставка
Наиболее важный вопрос о надлежащей реализации процедуры PER, или в этом отношении любой процедуры кондиционирования, включает точности, времени и последовательности CS и США доставку (рисунок 1). Следователи, которые являются новыми в порядке часто являются неточными о поставке одного или обоих раздражителей. ISI?что не в состоянии обеспечить перекрытия CS и США привести к снижению производительности кондиционирования. PLC автоматизирует звуковой сигнал для экспериментатор доставить сахарозы 3 сек после начала поставки запаха. Следователи должны провести сахарный / капля воды, близкий к пчеле для быстрой доставки после сигнала. Эти процедуры помогают увлечь последовательную ISI. Размещение секундомер на арене кондиционирования обеспечивает удобное размещение времени судебного разбирательства, а также мониторинг время пчел на арене как до, так и после родов раздражителей. Таким образом, в ITI может быть относительно последовательными и вся процедура может быть запущена с контролируемой скоростью. ITI, что слишком короткие, например, менее чем 1 мин, или слишком долго может привести к снижению производительности кондиционирования 1.
Сезонные, экологические, и контекстная Воздействие на Honey Bee Performance
Производительность медоносных пчел "может быть существенным влиянием его окрестностяхкак до, так и во время кондиционирования. Часто, колебания температуры и пищевой наличии, которые приходят со сменой времен года изменит мотивацию пчел, чтобы учиться. Когда цветы цветут, мотивация пчел, чтобы узнать кондиционером объединение в лаборатории уменьшается 38. Когда колония подчеркнул – от экстремальных температур, нехватки продовольствия, или заболевания, связанных стресса – пчелы 'покажет снижение их производительности обучения внутри. Медоносные пчелы хранится в полете комнате может узнать также на некоторое время, но там тоже стресс болезни и старение ухудшение технических характеристик обучения в течение долгого времени. Контекст во кондиционирования также может снизить производительность пчел. Любые посторонние запахи, движение и другие стимулы могут отвлечь пчел из экспериментальных стимулов. Чтобы избежать этой проблемы, поддерживать разумно последовательный, упрощенную визуальный контекст.
Генотип и опыт влияет на производительность на
<р = класса "jove_content"> Honey Bee работники могут значительно отличаться по производительности на любой процедуры кондиционирования за счет целевой специализации, генотип, или других факторов окружающей среды 20. Таким образом, важно, чтобы стандартизировать, насколько это возможно, виды животных, используемых в эксперименте, с тем чтобы уменьшить между индивидуальные различия. В колонии во главе с открытого повязана королевы, а это значит, что она повязана с различными дронами, рабочие будут отличаться в отцовской генотипа. Генетический фон может привести к драматическим различиям в сенсорной отзывчивости 39 и обучения производительность 29. Использование колонии во главе с дамами инструментально осемененных спермой от отдельных дронов 28 уменьшает этот между индивидуальные различия.Протоколы, описанные выше, включает в себя способ сбора меда пчелы работников от входа в гнездо. Тем не менее, эти пчелы отличаются друг от друга по отношению к возрасту или поведенческой задачи. Они могут быть молодые (inexperienCED) или старше (более опытные) комбайны. Они могут быть молодые пчелы мед делающие первые ознакомительные полеты. Или они могут быть сторожевые пчелы. Для уменьшения изменчивости, отмечают пчел с быстрой сушки эмали или маркировочного шильдика либо по мере их появления, как взрослых (для контроля возраста) и / или, как они начинают нагула (для контроля за опыт). Тогда, спустя несколько дней, собрать отмеченные пчел для кондиционирования. Работники, которые занимаются поведения медсестер могут быть собраны из кадров внутри улья. Медсестры могут быть идентифицированы при вставке головы в расплода ячейки, чтобы кормить и ухаживать за личинки внутри.
Использование Virgin Queens или дронов для PER кондиционирования
В дополнение к рабочих пчел, девственные медоносных пчел королев и дроны могут быть легко обработаны в порядке PER для исследований, направленных на развитие генетических линий медоносных пчел, которые отличаются в изучении производительности 28. Виргинские кошки должны быть собраны вскоре после гоеу выйти из окукливания и помещают непосредственно в запретительных жгутов без обезболивания. Молодые, незрелые дроны, собранные из выводка гребень внутри колонии, как правило, не мотивированы, чтобы учиться. После того как они начали спаривания рейсы, беспилотники легко узнать PER задачи 28. Они должны быть собраны, как они возвращаются из брачного полета и поддерживается в течение ночи в маленькой клетке в колонии, используемой для выращивания маток. Не пытайтесь использовать их накануне кондиционирования; они не выживают хорошо в упряжь на ночь. Пару часов до кондиционирования беспилотники могут быть собраны из клеток и помещены в удерживающих ремней безопасности без обезболивания.
Выводы
Эта процедура PER, на пути методов, составляет отправной точкой для проектирования PER эксперименты. Большинство протоколов НА потребует, что процедура, описанная быть изменены в некотором роде для реализации конкретных целей эксперимента и Проживаниее групп несколько лечение. Это легко осуществить. Однако надлежащая реализация требует внимания к деталям и практики. После того, как освоили это может быть мощным процедура для добавления в качестве исследовательского инструмента в течение нескольких фундаментальных и прикладных научно-исследовательских программ с различными видами насекомых.
The authors have nothing to disclose.
Это исследование было поддержано финансирование из NIH NCRR (R01 RR014166 в BHS), NIH NIDCD (R01 DC011422 BHS со-PI), в Министерство сельского хозяйства США (J Трамбл PI; BH Смит со-PI) и Университета штата Аризона. Финансирование семинара для обучения студентов (данные на рисунке 4) была предоставлена научного общества Чили.
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Sucrose | Sigma-Aldrich | S9378-1KG | |
Odorant compounds (for example): | For additional examples of odorants, see any of the papers on olfactory processing from the Smith lab | ||
1-hexanol | Sigma-Aldrich | 471402-100ML | |
2-octanone | Sigma-Aldrich | W280208-800G-K | |
heptanol | Sigma-Aldrich | 51778-5ML | |
gerianol | Sigma-Aldrich | 163333-25G | |
nonanal | Sigma-Aldrich | 131210-100ML | |
Hexane | Sigma-Aldrich | 296090-1L | |
Heavy Mineral Oil | Sigma-Aldrich | 330760-1L | Make sure it’s odorless |
Ethanol | Sigma-Aldrich | 459836-1L | |
Scintillation vials | Sigma-Aldrich | Z190535-1PAK | Use a small drill bit to bore a small hole in the cap of the vials |
Bee harness | Custom-made from 0.9 cm diameter plastic soda straws or hard plastic/metal tubing | ||
Duct tape | |||
Kimwipes | Sigma-Aldrich | Z188956-1PAK | |
Wash bottles | Sigma-Aldrich | Z560847-3EA | For the 70% ethanol |
Small fan in mountable housing | |||
Dryer tubing | |||
FOR METHOD 1 ONLY | |||
Name | Company | Catalog Number | Comments |
20 ml disposable plastic syringes | Cole-Parmer | WU-07945-18 | |
15 mm filter paper circles | Sigma-Aldrich | Z274844-1PAK | |
Pushpins | |||
Toothpicks | |||
FOR METHOD 2 ONLY | |||
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Gilmont Micrometer syringe, 0.2 mL | Cole-Parmer | EW-07840-00 | |
Gilmont micrometer syringe tip | Cole-Parmer | EW-07841-00 | |
26G 3/8” Leur hub hypodermic needles | Fisher Scientific | 14-826-10 | |
1cc tuberculin syringes (plastic/glass) | Sigma-Aldrich | Z181641-1EA OR Z192090-200EA | glass tuberculin syringes are available, but plastic syringes are much less expensive and will work well for a limited number of uses |
Small rubber/silicone restrictors | Cole-Parmer | EW-95702-02 | Made from 4.8 mm outer diameter silicone tubing or the rubber tips of the 1 cc syringe plungers |
Parafilm | Sigma-Aldrich | P7793-1EA | |
75 X 100 mm filter paper | Sigma-Aldrich | Z695106-500EA | |
Direct Logic 05 Programmable Logic Controller | Koyo Electronics Industries Co, Ltd | http://www.koyoele.co.jp/ OR english/support/dlc.html#plc | |
1 mm, 4mm & 6 mm inner diameter PVC or silicone tubing | Cole-Parmer | Various | Cole-Parmer has a wide selection of suitable tubing |
Polypropylene connectors & leur fittings | Cole-Parmer | Various | Cole-Parmer has a wide selection of connectors and fittings for many tube sizes |
65-mm Correlated Flowmeter | Cole-Parmer | EW-03216-08 | Aluminum with Glass float; For Liquids and Gases, With Valve |
OR | |||
Tetra Whisper 300 (Tetratek DW96-2) Aquarium Air Pump | Aquacave | AE-TETRA-300 | www.aquacave.com |
LIF series Solenoid Valves for .042 " ID Tubing, Configuration "E" | The Lee Company | LFAA1200118H | Neoprene, 430 SS, 302 SS, 280mWatts http://www.theleeco.com/LEEWEB2.NSF |
PC-Board 12VDC 70dB Piezo Buzzer | RadioShack | 273-074 | www.radioshack.com |