Cytologiske Analyse af Spermatogenese: Levende og Faste Tilberedt<em> Drosophila</em> Testikler

Summary

Metoder til isolering og forberede Drosophila testikler prøver (leve og faste) til billeddannelse ved fasekontrast-og fluorescensmikroskopi er beskrevet heri.

Abstract

Drosophila melanogaster er en kraftfuld model, der har været almindeligt anvendt til at belyse forskellige biologiske processer. For eksempel har studier af både kvindelige og mandlige kimlinjer Drosophila høj grad bidraget til den nuværende forståelse af meiose samt stamcellebiologi. Fremragende protokoller er tilgængelige i litteraturen for isoleringen og billeddannelse af Drosophila æggestokke og testikler ^3-12. Heri er metoder til dissektion og udarbejdelse af Drosophila testikler til mikroskopisk analyse beskrevet med en ledsagende video demonstration. En protokol til isolering testikler fra maven af ​​voksne mænd og forberede lysbilleder af levende væv til analyse ved fasekontrast-mikroskopi samt en protokol for fastsættelse og immunfarvning testikler til analyse ved fluorescens mikroskopi præsenteres. Disse teknikker kan anvendes i karakteriseringen af Drosophila mutanter, som udviser defects i spermatogenesen samt i visualisering af subcellulære lokaliseringer af proteiner.

Introduction

Drosophila testikler er en ideel model for studiet af mange biologiske processer, herunder reguleringen af stamceller, meiose, og sæd udvikling ^13-18. De spermatocytter og deres meiotiske spindler er store og dermed praktisk til cytologisk analyse og afslappet cellecykluskontrolpunkter under spermatogenese lette undersøgelsen af ​​mutationer i cellecyklus gener. Forskellige celletyper kan observeres i bestilte progression langs længden af ​​testiklerne, og enhver afbrydelse i spermatogenesen kan føre til ændringer i denne overordnede arrangement. Disse funktioner kombineret med Drosophila genetiske værktøjer har lettet mutationsanalyse af spermatogenesen ^21-23.

Etaperne i Drosophila spermatogenesen er veldefineret. Germline-celler, der udvikler sig synkront inden cyster fremskridt sekventielt gennem stadier af spermatogenesen langs længden af ​​testiklerne. Under both mitose og meiotiske delinger af de mandlige kønsceller, opstår cytokinese ufuldstændigt sådan, at datteren cellerne forbliver forbundet med cytoplasmatiske broer kendt som ring kanaler (figur 1). Den apikale spids af testis indeholder en population af germlinie stamceller, der giver anledning til spermatogonier, der undergår fire mitotiske divisioner ufuldstændig cytokinese at generere 16-celle cyster af primære spermatocytter. Efter premeiotic S fasen, primære spermatocytter indtaste G2, en længere periode med ~ 90 hr hvorunder cellulære volumen øges ~ 25-fold vækst. Progression gennem meiose I og meiose II resulterer i dannelsen af ​​32-celle cyster af sekundære spermatocytter og 64-celle cyster af haploide spermatider, hhv. De umodne, runde spermatider undergår omfattende cellulær ombygning til at danne modne sædceller. Post-meiotiske celler, især bundter af forlængede og modne spermatider, optager meget af mængden af ​​testiklerne.

Than vellykket transport af funktionelle sædceller til kvindelige fluer kræver koordination mellem de forskellige dele af den mandlige reproduktive system, der er sammensat af flere parrede strukturer (testiklerne, sædblærer og tilbehør kirtler) og en enkelt ejakulatorisk kanal (figur 2). Sperm er produceret inden testiklerne og opbevares inden sædblærerne indtil samleje ^24. De tilhørende kirtler indeholder sekretoriske celler, der producerer sædvæsken. Sæden migrere fra sædblærerne blandes med sædvæske inden udløsning kanal, der er forbundet til begge sædblærerne og de accessoriske kirtler. Denne blanding af sæd og sædvæske sidste ende pumpes ud af han i skeden af den kvindelige flyver gennem udløsning pære placeret ved den bageste ende af den mandlige maven ^25. Proteiner i sædvæsken er afgørende for langvarig opbevaring af sæd inden specialiserede organer, der er kendt som spermathecae i reproductive tarmkanalen af Drosophila hunner ^26.

Gode ​​metoder til isolering af Drosophila testikler og visualisering af celler på forskellige stadier af spermatogenesen findes i den videnskabelige litteratur ^3-12. Vi tilføjer heri til dette organ af viden ved at præsentere eksempler på disse protokoller med en ledsagende video demonstration. Protokollen for forberedelse af levende testikler prøver til fasekontrast-mikroskopi er baseret på en tidligere beskrevet metode ^27. Protokollen for formaldehyd fiksering og immunfarvning af testiklerne er også baseret på en tidligere beskrevet metode ^28. De heri beskrevne fremgangsmåder er blevet anvendt i mange undersøgelser Drosophila spermatogenese (for eksempel for at vurdere de roller dynein en minus-ende-directed mikrotubulus motor under Drosophila spermatogenese).

Ud over de grundlæggende protokoller der forslag fastsat varying dissektion, således at berige for spermatogonier, spermatocytter eller modne sædceller. Forskellige metoder til behandling af testiklerne sådan, at cyster enten forblive intakt eller bliver afbrudt efter behov beskrevet. En fordel ved at anvende Drosophila testikler som en model system er, at sammenlignet med Drosophila oocyter og embryoner, kan antistoffer og farvestoffer let trænge celler efter deres spredning fra testiklerne, og der kræves færre vasketrin, og dermed kan protokoller udføres i et relativt kort tid.

Protocol

1.. Testiklerne Dissection Bedøver fluer i en flaske eller hætteglas hjælp af en strøm af CO 2 og overføre til en flue pad. Sorter flyver under et dissektionsmikroskop med en lille pensel, og indsamle et passende antal (afhængigt af forsøget) Drosophila hanner af de ønskede genotyper. Unge mænd (0-2 dage gamle) er ideelle til at undersøge celler i hele de tidligere stadier af spermatogenesen (f.eks spermatogonier, spermatocytter og tidlige post-meiotiske sperma…

Representative Results

Et eksempel på en korrekt dissekeret par Drosophila mandlige kønsorganer er vist i figur 2A. Testikler fjernet fra maven af den voksne mandlige flue er typisk knyttet til udløsning kanalen (brun, figur 2A) og et par af accessoriske kirtler (grøn, figur 2A ') via et par sædblærer (blå, figur 2A) . For at adskille testiklerne fra de fleste af ledsagende somatiske væv udløsning kanalen og de ​​accessoriske kirtler bør tages af og…

Discussion

Selv testiklerne af vildtype fluer let kan identificeres på grund af deres gule farve (i modsætning de omkringliggende hvide væv), testiklerne af hvide mutant fluer er hvide, og dermed kan lejlighedsvis forveksles med tarmen. Mest transgene stammer, som typisk er på en hvid baggrund, har også hvide testikler fordi mini-hvide gen fundet i P-elementer ikke fremmer pigment akkumulation i testiklerne. Da Drosophila testikler kan ikke skelnes efter farve, andre let genkendeli…

Materials

Sylgard	World Precision Instruments	SYLG184	Two-part silicon elastomer for making silicone-coated dissection dish from Kimax Petri dish
PAP pen	Fisher Scientific	NC9888126	Ted Pella #22309
Clear nail protector	Wet n Wild	7780235001
ProLong Gold Antifade Reagent with DAPI	Life Technologies	P36931
Mouse anti-gamma-tubulin antibody (clone GTU-88)	Sigma-Aldrich	T6557
Cy3-AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG	Jackson ImmunoResearch	115-165-003
Triton X-100	Fisher Scientific	BP151-100
Ethanol	Fisher Scientific	AC61511-0040
Methanol	Fisher Scientific	A412-4
16% Formaldehyde	Thermo Fisher Scientific	28908
Sigmacote	Sigma-Aldrich	SL2	Use according to manufacturer's directions to siliconize cover slips
DAPI	Sigma-Aldrich	D-9542	0.5 mg/ml in 75% ethanol; store at -20°C
NaCl	Research Products International Corp.	S23020
Na2HPO4	Sigma-Aldrich	S9763
NaH2PO4	Sigma-Aldrich	S0751
Kimwipes delicate task wipers	Fisher Scientific	S47299
BSA	Research Products International Corp.	A30075	Molecular biology grade
Glass Coplin staining jar, screw cap	Electron Microscopy Sciences	70315
Single frosted microscope slides	Corning	2948-75X25
Poly-L-lysine coated microscope slides	Polysciences, Inc.	22247-1	Optional (to replace untreated microscope slides )
Square cover glass	Corning	2865-22
Razor blades	Fisher Scientific	12-640
Kimax Petri dish	Fisher Scientific	S31473	Kimble #23060 10015 EMD
Forceps	Dumont	52100-51S	Pattern 5 INOX
Name of Equipment	Company
Stemi 2000-CS stereoscope	Carl Zeiss
Eclipse 80i	Nikon
Plan-Fluor 40x objective	Nikon
Axiophot	Carl Zeiss
Plan-Neofluar Ph2 40x objective	Carl Zeiss