Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Biology

Cytologiske Analyse af Spermatogenese: Levende og Faste Tilberedt doi: 10.3791/51058 Published: January 20, 2014

Summary

Metoder til isolering og forberede Drosophila testikler prøver (leve og faste) til billeddannelse ved fasekontrast-og fluorescensmikroskopi er beskrevet heri.

Abstract

Drosophila melanogaster er en kraftfuld model, der har været almindeligt anvendt til at belyse forskellige biologiske processer. For eksempel har studier af både kvindelige og mandlige kimlinjer Drosophila høj grad bidraget til den nuværende forståelse af meiose samt stamcellebiologi. Fremragende protokoller er tilgængelige i litteraturen for isoleringen og billeddannelse af Drosophila æggestokke og testikler 3-12. Heri er metoder til dissektion og udarbejdelse af Drosophila testikler til mikroskopisk analyse beskrevet med en ledsagende video demonstration. En protokol til isolering testikler fra maven af ​​voksne mænd og forberede lysbilleder af levende væv til analyse ved fasekontrast-mikroskopi samt en protokol for fastsættelse og immunfarvning testikler til analyse ved fluorescens mikroskopi præsenteres. Disse teknikker kan anvendes i karakteriseringen af Drosophila mutanter, som udviser defects i spermatogenesen samt i visualisering af subcellulære lokaliseringer af proteiner.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Drosophila testikler er en ideel model for studiet af mange biologiske processer, herunder reguleringen af stamceller, meiose, og sæd udvikling 13-18. De spermatocytter og deres meiotiske spindler er store og dermed praktisk til cytologisk analyse og afslappet cellecykluskontrolpunkter under spermatogenese lette undersøgelsen af ​​mutationer i cellecyklus gener. Forskellige celletyper kan observeres i bestilte progression langs længden af ​​testiklerne, og enhver afbrydelse i spermatogenesen kan føre til ændringer i denne overordnede arrangement. Disse funktioner kombineret med Drosophila genetiske værktøjer har lettet mutationsanalyse af spermatogenesen 21-23.

Etaperne i Drosophila spermatogenesen er veldefineret. Germline-celler, der udvikler sig synkront inden cyster fremskridt sekventielt gennem stadier af spermatogenesen langs længden af ​​testiklerne. Under both mitose og meiotiske delinger af de mandlige kønsceller, opstår cytokinese ufuldstændigt sådan, at datteren cellerne forbliver forbundet med cytoplasmatiske broer kendt som ring kanaler (figur 1). Den apikale spids af testis indeholder en population af germlinie stamceller, der giver anledning til spermatogonier, der undergår fire mitotiske divisioner ufuldstændig cytokinese at generere 16-celle cyster af primære spermatocytter. Efter premeiotic S fasen, primære spermatocytter indtaste G2, en længere periode med ~ 90 hr hvorunder cellulære volumen øges ~ 25-fold vækst. Progression gennem meiose I og meiose II resulterer i dannelsen af ​​32-celle cyster af sekundære spermatocytter og 64-celle cyster af haploide spermatider, hhv. De umodne, runde spermatider undergår omfattende cellulær ombygning til at danne modne sædceller. Post-meiotiske celler, især bundter af forlængede og modne spermatider, optager meget af mængden af ​​testiklerne.

Than vellykket transport af funktionelle sædceller til kvindelige fluer kræver koordination mellem de forskellige dele af den mandlige reproduktive system, der er sammensat af flere parrede strukturer (testiklerne, sædblærer og tilbehør kirtler) og en enkelt ejakulatorisk kanal (figur 2). Sperm er produceret inden testiklerne og opbevares inden sædblærerne indtil samleje 24. De tilhørende kirtler indeholder sekretoriske celler, der producerer sædvæsken. Sæden migrere fra sædblærerne blandes med sædvæske inden udløsning kanal, der er forbundet til begge sædblærerne og de accessoriske kirtler. Denne blanding af sæd og sædvæske sidste ende pumpes ud af han i skeden af den kvindelige flyver gennem udløsning pære placeret ved den bageste ende af den mandlige maven 25. Proteiner i sædvæsken er afgørende for langvarig opbevaring af sæd inden specialiserede organer, der er kendt som spermathecae i reproductive tarmkanalen af Drosophila hunner 26.

Gode ​​metoder til isolering af Drosophila testikler og visualisering af celler på forskellige stadier af spermatogenesen findes i den videnskabelige litteratur 3-12. Vi tilføjer heri til dette organ af viden ved at præsentere eksempler på disse protokoller med en ledsagende video demonstration. Protokollen for forberedelse af levende testikler prøver til fasekontrast-mikroskopi er baseret på en tidligere beskrevet metode 27. Protokollen for formaldehyd fiksering og immunfarvning af testiklerne er også baseret på en tidligere beskrevet metode 28. De heri beskrevne fremgangsmåder er blevet anvendt i mange undersøgelser Drosophila spermatogenese (for eksempel for at vurdere de roller dynein en minus-ende-directed mikrotubulus motor under Drosophila spermatogenese).

Ud over de grundlæggende protokoller der forslag fastsat varying dissektion, således at berige for spermatogonier, spermatocytter eller modne sædceller. Forskellige metoder til behandling af testiklerne sådan, at cyster enten forblive intakt eller bliver afbrudt efter behov beskrevet. En fordel ved at anvende Drosophila testikler som en model system er, at sammenlignet med Drosophila oocyter og embryoner, kan antistoffer og farvestoffer let trænge celler efter deres spredning fra testiklerne, og der kræves færre vasketrin, og dermed kan protokoller udføres i et relativt kort tid.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1.. Testiklerne Dissection

  1. Bedøver fluer i en flaske eller hætteglas hjælp af en strøm af CO 2 og overføre til en flue pad.
  2. Sorter flyver under et dissektionsmikroskop med en lille pensel, og indsamle et passende antal (afhængigt af forsøget) Drosophila hanner af de ønskede genotyper. Unge mænd (0-2 dage gamle) er ideelle til at undersøge celler i hele de tidligere stadier af spermatogenesen (f.eks spermatogonier, spermatocytter og tidlige post-meiotiske spermatider), mens de lidt ældre mænd (2-5 dage gamle) er ideelle til at undersøge celler i de sidste stadier af spermatogenesen (især modne sædceller).
  3. Brug pincet til at fjerne vingerne fra hver flyve (for at forhindre fluerne fra variabel i væske under dissektion).
  4. Læg ~ 500 ml phosphatbufret saltvand (130 mM NaCI, 7 mM Na 2 HPO 4, 3 mM NaH 2PO 4, PBS) i et fald til en silikone-coated dissektion skålen sort baggrund. Andre vandige opløsninger med succes er blevet brugt til testikler dissektion 3..
  5. Punkt pincetter mod forreste af fluen, tag fat i det ved brystkassen, og nedsænkes i PBS dråbe. Mens du ser gennem dissektionsmikroskop, bruge en anden tang til at gribe og trække den eksterne kønsorganer (mørkebrun struktur placeret i den bageste ende af den ventrale maven) bagtil, indtil den frigøres fra maven. I de fleste tilfælde vil testiklerne, sædblærer og tilbehør kirtel fjernes fra underlivet sammen med de ydre kønsorganer, og hvis ikke, skal du indsætte et enkelt par pincet i maven og drille testiklerne.
  6. Separate testikler fra tilbehør kirtel og ydre kønsorganer bruger to par tænger i PBS dråbe (Figur 2). Wild-type testikler er let skelnes fra de tilstødende hvide væv ved deres gule farve. Fortsæt straks til trin 2.
  7. At isolere testikler fra pharate hanner (i.. E indesluttet i puppe tilfældet), skal et yderligere trin først udføres, der omfatter fjernelse af flyve fra puppe tilfælde, og dette trin er tidligere blevet beskrevet andetsteds 31. Fortsæt med dissektion som for de voksne testikler begynder ved trin 1.2.
  8. At isolere testikler fra larve mænd, udføre en ændring af en protokol til isolering Drosophila larve æggestokke 32.. Kort fortalt, kan han larver skelnes fra kvindelige larver ved tilstedeværelsen af ​​et par store, tydelige, ovale strukturer (larval testikler) indlejret i den bageste tredjedel af fedt kroppen. For at isolere larval testikler, delvist flaa åbne han larve at isolere testiklerne og det omgivende fedt kroppen fra maven som beskrevet til isolering af larvestadium æggestokke. Fortsæt straks til trin 2 i protokollen beskrevne, testiklerne kan senere fjernes fra fedt kroppen lige før montering (trin 2.3 eller 3.14) som beskrevet for æggestokkene 32.

  1. Brug en pincet til forsigtigt at placere 2-3 par testikler i et fald på 4-5 ml PBS på en kvadratisk dækglas. Bemærk, at forholdet mellem testiklerne nummer til PBS volumen skal justeres: for meget væske vil forhindre celler i at sprede sig korrekt, når mast, mens for lidt væske vil forårsage celler til at sprænge, ​​når mast. Valgfrit: Brug silikoniseret dækglas at minimere vedhæftning af væv for at dække slip i trin 3.2.
  2. Anvend en pincet til at rive åben hver testis ved en passende position, således at maksimere tilstedeværelsen af ​​de ønskede kimcellelinje celletyper i præparatet (bemærk, at indholdet af testiklerne vil mest udgang fra revet område på objektglasset under Squashing trin.) For at berige for spermatogonier og spermatocytter, rive åbne testiklerne støder op til dens apikale spids (niveau 1, figur 2B). At berige for spermatocytter og spermatider, rive åbne testiklerne på en position lidt basal til niveau 1 (niveau 2, figur 2B). At berige for mere modne kimcellelinjesekvenser celler, rive testiklerne tættere på, hvor krumningen begynder (niveau 3, figur 2B).
  3. Forsigtigt placere et objektglas over dækglasset til squash testiklerne, gælder ikke trykket manuelt som vægten af ​​dækglasset alene er tilstrækkeligt til at opnå et ordentligt mast prøve. Prøv at undgå at fange luftbobler. Valgfrit: Brug poly-L-lysin coatede objektglas at fremme overholdelse af væv til at glide i trin 3.2.
  4. Brug forberedelse straks (helst inden for 15 min forberedelse) at observere levende celler med fasekontrast mikroskopi, for transgene fluer med udtryk for fluorescens mærkede proteiner i testiklerne, kan levende celler undersøges ved fluorescensmikroskopi på dette trin. Alternativt, skal du fortsætte med fiksering og antistoffarvning (Protokol 3).
  5. Forsigtigt væge eventuel overskydende væske ud under dækglasset ved hjælp af en rengøring wIPE at tillade udfladning af præparatet indtil kønsceller klart i fokus.

3. Formaldehyd Fiksering og antistoffarvning

  1. Snap fryse hver slide indeholder mast testikler (fra protokol 2) ved hjælp af et par af metal tænger til at fordybe det kort i flydende kvælstof (indtil flydende nitrogen stopper boblende).
  2. Fjern låget slip straks med et barberblad.
  3. Brug metal tænger til at overføre dias til en forafkølet objektglas rack fyldt med iskold 95% ethanol (spektrofotometrisk kvalitet, methanol-fri). Opbevar ved -20 ° C i 10 min.
  4. Brug metal tænger til at overføre dias til et objektglas rack fyldt med 4% formaldehyd i PBS plus 0,1% Triton X-100 (PBS-T). Opbevares ved stuetemperatur i 7 min.
  5. Brug metal tænger til at overføre dias til en glasplade rack fyldt med PBS. Vask objektglassene i PBS i 5 minutter ved stuetemperatur. Gentag 1x. Udfør alle vaskninger ved at kassere opløsning i objektglasset tandstang (
  6. Kassér PBS og nedsænkes objektglassene i PBS-T i 30 minutter ved stuetemperatur for at permeabilisere cellemembraner.
  7. Vask objektglassene i PBS i 5 minutter ved stuetemperatur. Gentag 2x.
  8. Blokering trin (valgfrit): Fordyb dias i PBS plus 1% BSA i 45 minutter ved stuetemperatur.
  9. Brug en hydrofob barriere pen til at tegne en cirkel på diaset omkring mast væv (let synlige med det blotte øje) for at begrænse de antistofopløsninger (tilføjet i trin 3.9 og 3.11). Vævet skal holdes fugtig på alle tidspunkter, mens de udfører immunfarvning.
  10. Læg 30-40 ml primært antistof (fortyndet i PBS-T, 1:400 til 1:50, afhængigt antistof) på væv inden for cirklen. Hvis blokering blev udført, fortyndes primære antistof i PBS-T plus 1% BSA. Anti-gamma-tubulin-antistof (til farvning af centrosomes i figur 4) blev fortyndet 1:100. Placer i en fugtig, mørk kammer (f.eks. Lukket plastboksmed fugtige papirhåndklæder) i 2 timer ved stuetemperatur eller natten over ved 4 ° C.
  11. Vask objektglassene i PBS i 5 minutter ved stuetemperatur 3x. Hvis blokering blev udført, vaskes to gange i PBS-T, og en gang i PBS (5 minutter ved stuetemperatur hver).
  12. Læg 30-40 ml fluorofor-konjugeret sekundært antistof (fortyndet 1:400 i PBS) til vævet, og der inkuberes i mørke i 1-2 timer ved stuetemperatur.
  13. Vask objektglassene i PBS i 5 minutter ved stuetemperatur. Gentag 2x.
  14. Læg 30-40 ml DAPI-opløsning (0,2 mg / ml i PBS) til væv i cirklen.
  15. Forsigtigt placere et dækglas over væv, der tager sig for at undgå at fange luftbobler. Hvis luftbobler skal vises, forsigtigt flytte rundt på dækglasset uden at ødelægge squash indtil boblerne flygte fra siderne af dækglasset.
  16. Brug en renseserviet at skamplet overskydende DAPI fra kanten af ​​diaset.
  17. Forsegl dækglasset til diaset hjælp klar neglelak.
  18. Brug denne forberedelseinden for de næste 3-4 timer til at se immunofarvet celler ved fluorescerende mikroskopi. Ved længere tids opbevaring af dias (op til mindst flere uger), skal du bruge en glycerol-baserede hårdt montere medier med DAPI, og gemme dias ved -20 ˚ C.
  19. Alternativt fastsætte prøver i methanol i stedet for formaldehyd (afhængigt antigen). Efter at have afsluttet hele protokollen igennem trin 3.2, fordybe lysbilleder af squashed testikler i methanol i 10 min ved -20 ° C, og fortsæt med trin 3.5 og fremefter.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Et eksempel på en korrekt dissekeret par Drosophila mandlige kønsorganer er vist i figur 2A. Testikler fjernet fra maven af den voksne mandlige flue er typisk knyttet til udløsning kanalen (brun, figur 2A) og et par af accessoriske kirtler (grøn, figur 2A ') via et par sædblærer (blå, figur 2A) . For at adskille testiklerne fra de fleste af ledsagende somatiske væv udløsning kanalen og de ​​accessoriske kirtler bør tages af og kasseres, således at kun testiklerne pair og sædblærerne remain (figur 2B og 2B '). Sædblærerne kan også fjernes, så kun testiklerne par til at blive behandlet yderligere.

Alderen på de voksne hanner udvalgt til testiklerne dissektion er en vigtig overvejelse. I unge mænd (0-2 dage efter eclosion), sædblærerne er småog næsten tom, og testiklerne er på deres maksimale diameter (som i figur 2). Brug yngre mænd sikrer et relativt stort antal delende kimcellelinje celler (gennemgår enten mitose eller meiose) og tidlige post-meiotiske spermatider. Når ældre mænd (3-5 dage efter eclosion) anvendes til dissektion (image ikke vist), sædblærerne er mere fremtrædende, fordi de er svulmende med sæd, og testiklerne er smallere end hos yngre mænd. Ældre mænd er at foretrække, hvis målet er at visualisere modne sædceller.

På grund af den bestilte progression af udviklingsmæssige begivenheder langs længden af Drosophila testiklerne kan kimlinie celler på bestemte stadier af spermatogenesen blive beriget baseret på den position, hvor dissekeret testiklerne er revet før fladtrykning. For eksempel rive åbne testiklerne nær dens apikale spids (niveau 1, 2B ') giver en overflod af celler i tidlige stadier af spermatogenesen. Figur 3.A viser et fase-kontrast billede af en repræsentativ population af spermatogonier (hvid pil), tidlige primære spermatocytter (gul pil), og sene primære spermatocytter (rød pil) opnået på denne måde. Alternativt rive åbne testiklerne på et lidt mere basal position (niveau 2, figur 2B ') giver primært spermatocytter og spermatider. 3B viser et fase-kontrast billede af en repræsentativ celle population af primære spermatocytter (rød pil), runde spermatider ( grøn pil), forlængede spermatider (orange pil) og modne sædceller bundter (blå pil) opnået på denne måde.

Fasekontrast billeddannelse af testiklerne kan anvendes til at karakterisere defekter i Drosophila spermatogenese følge af mutationer i gener, der er afgørende for denne proces. De runde spermatider har en meget stereotyp udseende, når den ses gennem et fasekontrast-mikroskop. Hver af disse umodne spermatider har en enkelt, PHAe-lys, rund kerne og en enkelt fase-mørke, runde mitokondrie aggregat af nogenlunde samme størrelse (markeret med lilla pilespids og pil, henholdsvis i figur 3C). Variation i de relative tal eller størrelser af disse organeller kan skyldes afvigende meiotiske delinger (se diskussionen). Et eksempel på en sådan defekt er vist i figur 3D. Runde spermatider fra voksne mænd med mutation af i stykker (Asun) gen indeholder en enkelt stor mitokondrie aggregat og mange små kerner som følge af fejl i cytokinese og kromosom adskillelse 29.

Fluorescensmikroskopi er en anden kraftig metode til at studere Drosophila spermatogenese. Et eksempel på en fluorescerende billede af fikserede celler fra en mast testikler prøve er vist i figur 4. Testiklerne blev opnået fra transgene fluer udtrykker GFP-beta1-tubulin (produkt af bTub56D genet fusioneret ved sin C-terminal ende til GFP og under kontrol af Ubi-p63E ubiquitin gen promotor, gave fra H. Oda og Y. Akiyama-Oda JT Biohistory Research Hall, Osaka, Japan) for at mærke de mikrotubuli (grøn i figur 4D, gråtone i figur 4A). De transgene testikler blev immunfarvet bruge en mus antistof mod gamma-tubulin (sekundært antistof: anti-mus Cy3) for at markere centrosomes (rød i figur 4D, gråtoner i figur 4C) og DAPI-farvede at markere DNA (blå i figur 4D, gråtone i figur 4B). Celler på forskellige stadier af spermatogenesen let kan identificeres ved at undersøge indretningen af ​​mikrotubuli, centrosomes og kromosomer (se legende).

Figur 1
Figu Ad 1. Skematisk af kønscelleoverførsel celledelinger i Drosophila hanner. Hver stamcelle division producerer en gonial celle, der gennemgår fire runder af mitotiske divisioner med ufuldstændig cytokinese at fremstille en 16-celle cyste af primære spermatocytter. Hver primære spermatocyte gennemgår en langvarig vækstfase før undergår de to meiotiske delinger, igen med ufuldstændig cytokinese til dannelse af en 32-celle cyste af indbyrdes forbundne sekundære spermatocytter efterfulgt af en 64-celle cyste sammenkoblede runde spermatider. Runde spermatider er kendetegnet ved tilstedeværelsen af ​​en fase-lys kerne og en fase-dark mitokondrie aggregat (den Nebenkern) af lignende størrelser. De runde spermatider undergår forlængelse og individualisering til dannelse af den modne sædceller. Modne spermahoveder kan identificeres ved deres nåleformede kerner. Kernerne er vist i blå, Nebenkerne (mitokondrie tilslagsmaterialer) i sort cytoplasma i tan./ 50981fig1highres.jpg "target =" _blank "> Klik her for at se større billede.

Figur 2
Figur 2.. Reproduktionsorganerne hos Drosophila hanner. Unge voksne handyr (0-2 dage efter eclosion) blev udvalgt til dissektion. Lysmikrografier af isolerede kønsorganer er vist i A og B med tilsvarende tegnefilm i A 'og B'. (A, A ') Drosophila testikler (rød) er fjernet fra maven af en voksen mand flue er forbundet til udløsning kanal (brun) via sædblærerne (blå). Et par tilbehør kirtler (grøn) er også fastgjort til udløsning kanalen. (B, B ') Testiklerne bør adskilles fra de accessoriske kirtler bør præparatglaspræpareringsprotokol. Forud for kvaser, rive åbne testiklerne på niveau 1 for at berige for celler i de tidlige stadier af spermatogenesen, på niveau 2 for at opnå en blandet population af meiotisk og post-meiotiske kimcellelinjesekvenser celler, og på niveau 3 for at berige for modne sædceller. Målestokken, 250 mm. Klik her for at se større billede.

Figur 3
Figur 3.. Fasekontrast-billeder af Drosophila testikler. (A) En overflod af celler i tidlige stadier af spermatogenesen, herunder spermatogonia (hvid pil), tidlige primære spermatocytter (gul pil), og sene primære spermatocytter (rød pil) er typisk frigivet når testiklerne er revet på niveau 1 (se figure 2B "). To eller flere indbyrdes forbundne celler (en konsekvens af ufuldstændig cytokinese) ofte smelter fuldstændigt som en artefakt af Squashing procedure (gul pilespids markerer en sammensmeltning af to tidlige spermatocytter). (B) En kombination af spermatocytter (rød pil markerer sent primær spermatocyte) og post-meiotiske celler, herunder runde spermatider (grøn pil), forlængede spermatider (orange pil markerer delvis cyste) og modne sædceller bundter (blå pil), er typisk frigives, når testiklerne er revet på niveau 2 (se figur 2B). (C, D) fasekontrast billeddannelse af squashed testikler kan bruges til let at identificere fejl i de rigelige og stereotype runde spermatider. Wild-type spermatider har en kerne (fase-lys, præget af lilla pilespids) knyttet til en enkelt mitokondrie aggregat (fase-dark, markeret med lilla pil) på ca samme størrelse (C). Spermatider fra asunf02815testikler indeholde flere små kerner og en stor mitokondrie aggregat som følge af undladt cytokinese og fejl i kromosom adskillelse (D). Scale bar, 10 mm. Klik her for at se større billede.

Figur 4
.. Figur 4. Fluorescerende billede af Drosophila testikler Tilberedt squashed testikler isoleret fra mænd udtrykker GFP-mærkede beta1-tubulin (grøn i D, gråtoner i A), blev fikseret og farvet for både DNA (DAPI, blå i D, gråtoner i B) og centrosomes (gamma-tubulin antistof; rødt i D, gråtone i C). En dividere spermatoCYTE (hvid pilespids) kan ses ved siden af ​​et stort felt af runde spermatider (hvid pil markerer en repræsentative celler) og et bundt af modne sædceller (gul pil). Scale bar, 10 mm. Klik her for at se større billede.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Selv testiklerne af vildtype fluer let kan identificeres på grund af deres gule farve (i modsætning de omkringliggende hvide væv), testiklerne af hvide mutant fluer er hvide, og dermed kan lejlighedsvis forveksles med tarmen. Mest transgene stammer, som typisk er på en hvid baggrund, har også hvide testikler fordi mini-hvide gen fundet i P-elementer ikke fremmer pigment akkumulation i testiklerne. Da Drosophila testikler kan ikke skelnes efter farve, andre let genkendelige funktioner omfatter deres spiralmønster og forekomst i par 12. Bemærk, at nogle arbejdere finder det nemmere at bruge dissektion nåle i stedet for pincet til at isolere testiklerne 12.

En kritisk skridt i denne protokol er forberedelsen af ​​de squashed testikler. En nyttig metode er at svæve slide et par millimeter over dækglasset indeholder testiklerne sådan, at overfladen tension af PBS på dækglasset løfter dækglasset indeholdende væv mod objektglasset. Denne metode har tendens til at forstyrre cyster og spredt ud celler på diaset, hvilket gør den ideel til billeddannelse enkelte celler. Alternativt, for at opretholde hele eller delvise cyster til billeddannelse volumen PBS placeret på dækglasset kan øges (4-5 ml til 7-8 ml).

Hvis en bestemt Drosophila mutant af interesser ikke overleve til voksenalderen, så larvernes eller puppe testiklerne kan alternativt bruges til at studere spermatogenesen. I protokollen afsnit er referencer i henhold til isolering af pharate hanner og larvernes æggestokke, en ændring af den sidstnævnte protokol kan bruges til at isolere larvernes testikler. Trinnene til tåreflåd, squashing og farvning larvestadiet eller puppe testiklerne er i det væsentlige identisk med den, der er beskrevet heri til de voksne testikler. Selv om fluelinen skal undersøges kan nå voksenalderen, kan isolering af larvestadium eller puppe testikler være at foretrække, hvis gOAL er at få celler i de tidligste stadier af spermatogenesen. Som beskrevet i den repræsentative resultater afsnit kan celler i tidlige eller sene stadier af spermatogenesen blive beriget som ønsket ved at variere det niveau, hvor testiklerne er revet før kvaser.

Fasekontrastmikroskopi giver en relativ enkel fremgangsmåde til at studere Drosophila spermatogenese. En fordel ved fasekontrastmikroskopi løbet immunfarvning og fluorescerende mikroskopi er, at der kræves mindre tid til at forberede prøverne. Alle de vigtigste trin i spermatogenese kan let identificeres ved hjælp af denne teknik 24. Faktisk har adskillige grupper brugt fasekontrast-mikroskopisk analyse af testiklerne som en primær skærm til karakteriseringen af de fænotyper af Drosophila hansterile mutant linjer 21-23. Under meiotiske delinger, der er mitokondrier og kromosomer lige partitioneret til datterceller. En unik egenskab ved spermatogenesen i Drosophilen og andre insekter indebærer dannelsen af en mitokondrie aggregat (den Nebenkern) i runde spermatider 24. Runde spermatider indeholde en fase-mørk Nebenkern og en fase-lys kerne af omtrent samme størrelse i forholdet 1:1 (figur 3). Diameteren af kernen afspejler DNA-indholdet i de runde spermatider, så fejl i kromosomsegregering under meiose kan føre til variation i kernestørrelse 33. Forstyrrelse af meiotisk cytokinese følgende kromosomsegregering resulterer i flerkernede runde spermatider hvor Nebenkerne sikring i et enkelt aggregat 34. Derfor kan enhver variation i forholdet 1:1 eller i den størrelse eller form af Nebenkern og kernen i runde spermatider let påvises ved fasekontrast-mikroskopi af levende testikler og er ofte diagnostisk fejl i meiosen. Fusion af to eller flere indbyrdes forbundne celler i et fælles cyste forekommer ofte som en artefakt af Squashing procedure (figur 3A, Gul pilespids) forholdet 1:1 af cellekerner til Nebenkerne, dog stadig opretholdes.

Immunofarvning af faste præparater af Drosophila testikler kan udføres til fase celler undergår spermatogenese samt at vurdere ekspressionsmønstre og subcellulære lokaliseringer af proteiner af interesse. En raffineret ordning til klassificering faser af Drosophila spermatogenesen baseret på den cellulære morfologi, kromatin organisation, og mikrotubuli arrangementer af testikler celler immunofarvede til tubulin og DNA-farvede er blevet beskrevet 19. Drosophila primære spermatocytter er relativt store celler, og de ​​meiotiske spindler kan tydeligt ses ved hjælp af denne fremgangsmåde. Coimmunostaining for centrosomes (for eksempel ved anvendelse af antistoffer mod gamma-tubulin) kan udføres for at opnå et mere præcist billede af den meiotiske spindel struktur. Formaldehyd er et passende fixativ ved immunfarvning testikler med en bred vifte af Antiboderne (for eksempel anti-lamin og anti-dynein tung kæde). Morfologien af ​​mikrotubuli og centrosomes, dog er bedre bevaret med methanol, og derfor er methanol, der typisk anvendes som fikseringsmiddel ved udførelse af immunfarvning med antistoffer mod alpha-tubulin og gamma-tubulin.

Hvis antistoffer mod et protein af interesse er tilgængelig, kan transgene Drosophila linjer, der udtrykker en fluorescens-mærkede (f.eks. MCherry eller GFP) version af proteinet frembragt som en alternativ fremgangsmåde. Den subcellulære lokalisering af proteinet kan derefter bestemmes ved hjælp af et mikroskop for at se GFP-fluorescens i levende eller faste præparater af væv kan alternativt anti-GFP-antistoffer anvendes til påvisning af fusionsproteinet i faste prøver. I figur 4 blev mikrotubuli i en fast testikler præparat visualiseres via iboende fluorescens af GFP-mærkede beta1-tubulin (udtrykt fra et transgen under kontrol af en klatallieret udtrykte ubiquitinpromotoren). Alternativt transgene fluer, hvor ekspression er under kontrol af en vævsspecifik promotor, for eksempel, har promotoren for beta2-tubulin-genet er blevet anvendt til testiklerne ekspression 35. Alternativt kan ekspression af et protein af interesse er begrænset til specifikke mandlige kimcellelinje-celler ved hjælp af UAS-Gal4-systemet 36. Nanos-Gal4 kan anvendes til at inducere ekspression af et protein under kontrol af en UAS promotor inden spermatogonier mens bam-Gal4 kan anvendes til at inducere dets ekspression i spermatocytter 37. Knockdown af et protein af interesse, kan også induceres i testiklerne ved at udtrykke en RNAi hårnål-konstruktion under styring af en UAS-promotor sammen med disse Gal4 drivere 37.

Udviklingen af metoder til levende billedanalyse af Drosophila testikler celler har udvidet rækken af spørgsmål, som kanbehandles ved hjælp af dette system. Begivenhederne i meiotisk cytokinese kan visualiseres ved fasekontrast-mikroskopi af spermatocytter dyrket i fibrinklumper inde i en perfusionskammer for at forlænge levetiden af cellerne 35. Time-lapse konfokal mikroskopi af Drosophila spermatocytter udtrykker fluorescens mærkede proteiner har også været en kraftig tilgang (for eksempel at studere meiotic spindel samling) 38. Brugen af konfokal mikroskopi til billeddannelse af et tidligere tidspunkt, skillespejlene kønscelleoverførsel stamceller Drosophila testikler, har ført til en øget forståelse af stamceller regulering. Ud over de fase-kontrast og immunofluorescensmikroskopi fremgangsmåder fremlagt heri har transmissionselektronmikroskopi også blevet anvendt i udstrakt grad til at studere Drosophila spermatogenese 31.

I tillæg til billeddannelse, kan Drosophila testikler anvendes som kildemateriale til biokemisk analysisek. For immunoblotting eksperimenter kan dissekerede flyve testikler homogeniseres i 6x prøve buffer (5 ml / testikler par), kogt, og som læsses direkte på en SDS-PAGE gel (~ 4 testikler par / bane). For eksempel har denne fremgangsmåde været anvendt til at vurdere niveauerne af dynein-dynactin komponenter i testiklerne i flere Drosophila-mutanter. Testikler ekstrakter kan alternativt fremstilles ved at homogenisere vævet i denaturerende lysepuffer hvis det er vigtigt at bevare protein integritet. For eksempel Drosophila testikler ekstrakter har været brugt i coimmunoprecipitation eksperimenter at påvise tilstedeværelsen af stabile protein komplekser i dette væv 41-43.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen konkurrerende finansielle interesser.

Acknowledgments

Forfatterne vil gerne takke Michael Anderson til etablering i Lee lab disse accepterede metoder til at studere spermatogenesen med ekspertrådgivning fra Karen Hales. H. Oda og Y. Akiyama-Oda generøst forudsat at γ-tubulin-GFP flyve lager. Dette arbejde blev støttet af en NIH R01 tilskud til LAL (GM074044).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Sylgard World Precision Instruments SYLG184 Two-part silicon elastomer for making silicone-coated dissection dish from Kimax Petri dish
PAP pen Fisher Scientific NC9888126 Ted Pella #22309
Clear nail protector Wet n Wild 7780235001
ProLong Gold Antifade Reagent with DAPI Life Technologies P36931
Mouse anti-gamma-tubulin antibody (clone GTU-88) Sigma-Aldrich T6557
Cy3-AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG  Jackson ImmunoResearch 115-165-003
Triton X-100 Fisher Scientific BP151-100
Ethanol Fisher Scientific AC61511-0040
Methanol Fisher Scientific A412-4
16% Formaldehyde Thermo Fisher Scientific 28908
Sigmacote Sigma-Aldrich SL2 Use according to manufacturer's directions to siliconize cover slips
DAPI Sigma-Aldrich D-9542 0.5 mg/ml in 75% ethanol; store at -20 °C
NaCl Research Products International Corp. S23020
Na2HPO4 Sigma-Aldrich S9763
NaH2PO4 Sigma-Aldrich S0751
Kimwipes delicate task wipers Fisher Scientific S47299
BSA Research Products International Corp. A30075 Molecular biology grade
Glass Coplin staining jar, screw cap Electron Microscopy Sciences 70315
Single frosted microscope slides Corning 2948-75X25
Poly-L-lysine coated microscope slides Polysciences, Inc. 22247-1 Optional (to replace untreated microscope slides )
Square cover glass Corning 2865-22
Razor blades Fisher Scientific 12-640
Kimax Petri dish Fisher Scientific S31473 Kimble #23060 10015 EMD
Forceps Dumont 52100-51S Pattern 5 INOX
Stemi 2000-CS stereoscope Carl Zeiss
Eclipse 80i Nikon
Plan-Fluor 40X objective Nikon
Axiophot Carl Zeiss
Plan-Neofluar Ph2 40X objective Carl Zeiss

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. McKim, K. S., Joyce, E. F., Jang, J. K. Cytological analysis of meiosis in fixed Drosophila ovaries. Methods Mol. Biol. 558, 197-216 (2009).
  2. Weil, T. T., Parton, R. M., Davis, I. Preparing individual Drosophila egg chambers for live imaging. J. Vis. Exp. (2012).
  3. Bonaccorsi, S., Giansanti, M. G., Cenci, G., Gatti, M. Drosophila Protocols. Sullivan, W., Ashburner, M., Hawley, R. S. Cold Spring Harbor Laboratory Press. 87-109 (2000).
  4. Bonaccorsi, S., Giansanti, M. G., Cenci, G., Gatti, M. Immunostaining of Drosophila testes. Cold Spring Harb. Protoc.. 2011, 1273-1275 (2011).
  5. Bonaccorsi, S., Giansanti, M. G., Cenci, G., Gatti, M. Methanol-acetone fixation of Drosophila testes. Cold Spring Harb. Protoc.. 2011, 1270-1272 (2011).
  6. Bonaccorsi, S., Giansanti, M. G., Cenci, G., Gatti, M. Preparation of live testis squashes in Drosophila. Cold Spring Harb. Protoc.. 2011, (2011).
  7. Bonaccorsi, S., Giansanti, M. G., Cenci, G., Gatti, M. Formaldehyde fixation of Drosophila testes. Cold Spring Harb. Protoc.. 2012, (2012).
  8. Bonaccorsi, S., Giansanti, M. G., Cenci, G., Gatti, M. Paraformaldehyde fixation of Drosophila testes. Cold Spring Harb. Protoc.. 2012, 102-104 (2012).
  9. Bonaccorsi, S., Giansanti, M. G., Cenci, G., Gatti, M. F-actin staining of Drosophila testes. Cold Spring Harb. Protoc.. 2012, 105-106 (2012).
  10. Kibanov, M. V., Kotov, A. A., Olenina, L. V. Multicolor fluorescence imaging of whole-mount Drosophila testes for studying spermatogenesis. Anal. Biochem. 436, 55-64 (2013).
  11. Singh, S. R., Hou, S. X. Immunohistological techniques for studying the Drosophila male germline stem cell. Methods Mol. Biol. 450, 45-59 (2008).
  12. Zamore, P. D., Ma, S. Isolation of Drosophila melanogaster Testes. J. Vis. Exp. (2641), (2011).
  13. de Cuevas, M., Matunis, E. L. The stem cell niche: lessons from the Drosophila testis. Development. 138, 2861-2869 (2011).
  14. Fabian, L., Brill, J. A. Drosophila spermiogenesis: Big things come from little packages. Spermatogenesis. 2, 197-212 (2012).
  15. Giansanti, M. G., Sechi, S., Frappaolo, A., Belloni, G., Piergentili, R. Cytokinesis in Drosophila male meiosis. Spermatogenesis. 2, 185-196 (2012).
  16. Matunis, E. L., Stine, R. R., de Cuevas, M. Recent advances in Drosophila male germline stem cell biology. Spermatogenesis. 2, 137-144 (2012).
  17. McKee, B. D., Yan, R., Tsai, J. H. Meiosis in male Drosophila. Spermatogenesis. 2, 167-184 (2012).
  18. Zoller, R., Schulz, C. The Drosophila cyst stem cell lineage: Partners behind the scenes. Spermatogenesis. 2, 145-157 (2012).
  19. Cenci, G., Bonaccorsi, S., Pisano, C., Verni, F., Gatti, M. Chromatin and microtubule organization during premeiotic, meiotic and early postmeiotic stages of Drosophila melanogaster spermatogenesis. J. Cell Sci.. 107, 3521-3534 (1994).
  20. Rebollo, E., Gonzalez, C. Visualizing the spindle checkpoint in Drosophila spermatocytes. EMBO Rep. 1, 65-70 (2000).
  21. Castrillon, D. H., et al. Toward a molecular genetic analysis of spermatogenesis in Drosophila melanogaster: characterization of male-sterile mutants generated by single P element mutagenesis. Genetics. 135, 489-505 (1993).
  22. Giansanti, M. G., et al. Genetic dissection of meiotic cytokinesis in Drosophila males. Mol. Biol. Cell. 15, 2509-2522 (2004).
  23. Wakimoto, B. T., Lindsley, D. L., Herrera, C. Toward a comprehensive genetic analysis of male fertility in Drosophila melanogaster. Genetics. 167, 207-216 (2004).
  24. Fuller, M. T. The Development of Drosophila melanogaster. Bate, M., Martinez-Arias, A. Cold Spring Harbor Laboratory Press. 71-147 (1993).
  25. Wolfner, M. F. Tokens of love: functions and regulation of Drosophila male accessory gland products. Insect Biochem. Mol. Biol. 27, 179-192 (1997).
  26. Tram, U., Wolfner, M. F. Male seminal fluid proteins are essential for sperm storage in Drosophila melanogaster. Genetics. 153, 837-844 (1999).
  27. Kemphues, K. J., Raff, E. C., Raff, R. A., Kaufman, T. C. Mutation in a testis-specific beta-tubulin in Drosophila: analysis of its effects on meiosis and map location of the gene. Cell. 21, 445-451 (1980).
  28. Gunsalus, K. C., et al. Mutations in twinstar, a Drosophila gene encoding a cofilin/ADF homologue, result in defects in centrosome migration and cytokinesis. J. Cell Biol. 131, 1243-1259 (1995).
  29. Anderson, M. A., et al. Asunder is a critical regulator of dynein-dynactin localization during Drosophila spermatogenesis. Mol. Biol. Cell. 20, 2709-2721 (2009).
  30. Sitaram, P., Anderson, M. A., Jodoin, J. N., Lee, E., Lee, L. A. Regulation of dynein localization and centrosome positioning by Lis-1 and asunder during Drosophila spermatogenesis. Development. 139, 2945-2954 (2012).
  31. Martins, A. R., Machado, P., Callaini, G., Bettencourt-Dias, M. Microscopy methods for the study of centriole biogenesis and function in Drosophila. Methods in cell biology. 97, 223-242 (2010).
  32. Maimon, I., Gilboa, L. Dissection and staining of Drosophila larval ovaries. J. Vis. Exp. (10), (2011).
  33. Gonzalez, C., Casal, J., Ripoll, P. Relationship between chromosome content and nuclear diameter in early spermatids of Drosophila melanogaster. Genet. Res. 54, 205-212 (1989).
  34. Liebrich, W. The effects of cytochalasin B and colchicine on the morphogenesis of mitochondria in Drosophila hydei during meiosis and early spermiogenesis. An in vitro study. Cell Tissue. Res. 224, 161-168 (1982).
  35. Wong, R., et al. PIP2 hydrolysis and calcium release are required for cytokinesis in Drosophila spermatocytes. Curr. Biol. 15, 1401-1406 (2005).
  36. Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118, 401-415 (1993).
  37. White-Cooper, H. Tissue cell type and stage-specific ectopic gene expression and RNAi induction in the Drosophila testis. Spermatogenesis. 2, 11-22 (2012).
  38. Rebollo, E., Llamazares, S., Reina, J., Gonzalez, C. Contribution of noncentrosomal microtubules to spindle assembly in Drosophila spermatocytes. PLoS Biol. 2, (2004).
  39. Cheng, J., Hunt, A. J. Time-lapse live imaging of stem cells in Drosophila testis. Curr. Protoc. Stem Cell. Biol.. 2, 10-1002 (2009).
  40. Sheng, X. R., Matunis, E. Live imaging of the Drosophila spermatogonial stem cell niche reveals novel mechanisms regulating germline stem cell output. Development. 138, 3367-3376 (2011).
  41. Belloni, G., et al. Mutations in Cog7 affect Golgi structure, meiotic cytokinesis and sperm development during Drosophila spermatogenesis. J. Cell Sci. 125, 5441-5452 (2012).
  42. Moon, S., Cho, B., Min, S. H., Lee, D., Chung, Y. D. The THO complex is required for nucleolar integrity in Drosophila spermatocytes. Development. 138, 3835-3845 (2011).
  43. Wang, Z., Mann, R. S. Requirement for two nearly identical TGIF-related homeobox genes in Drosophila spermatogenesis. Development. 130, 2853-2865 (2003).
Cytologiske Analyse af Spermatogenese: Levende og Faste Tilberedt<em&gt; Drosophila</em&gt; Testikler
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Sitaram, P., Hainline, S. G., Lee, L. A. Cytological Analysis of Spermatogenesis: Live and Fixed Preparations of Drosophila Testes. J. Vis. Exp. (83), e51058, doi:10.3791/51058 (2014).More

Sitaram, P., Hainline, S. G., Lee, L. A. Cytological Analysis of Spermatogenesis: Live and Fixed Preparations of Drosophila Testes. J. Vis. Exp. (83), e51058, doi:10.3791/51058 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter