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Biology

精子形成細胞学的分析:ライブとの固定の準備 doi: 10.3791/51058 Published: January 20, 2014

Summary

単離および位相コントラストおよび蛍光顕微鏡によって撮像するためのショウジョウバエ精巣サンプル(ライブおよび固定)の製造方法は、本明細書に記載されている。

Abstract

キイロショウジョウバエは、広く様々な生物学的プロセスを解明するために使用されている強力なモデル系である。例えば、 ショウジョウバエの雌雄生殖系の両方の研究は、現在の減数分裂の理解だけでなく、幹細胞生物学に大きく貢献しています。優れたプロトコルは、 ショウジョウバエの卵巣と精巣3月12日の単離およびイメージングのための文献で ​​利用可能です。ここでは、顕微鏡分析のための切開およびショウジョウバエ精巣の調製方法は、添付のデモビデオで説明されています。成人男性の腹部から精巣を単離し、蛍光顕微鏡による分析のために精巣を固定し、免疫染色のために位相差顕微鏡ならびにプロトコルによる分析のために生きている組織のスライドを調製するためのプロトコルが提示される。これらの技術は、dは示すショウジョウバエの変異体の特徴付けにも適用することができる精子形成においてだけでなく、タンパク質の細胞内局在を可視化する中efects。

Introduction

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ショウジョウバエの精巣は、幹細胞の調節、減数分裂および精子の開発13-18を含む多くの生物学的プロセスの研究のための理想的なモデル系である。精母細胞とその減数分裂のスピンドルは精子形成の間に大規模なので、細胞学的分析のための便利な、リラックスした細胞周期チェックポイントである細胞周期遺伝子の変異の研究を促進する。異なる細胞型は、精巣の長さに沿って順序付けられた進行において観察することができ、精子形成を中断させるが、この全体的な配置に変化をもたらすことができる。 ショウジョウバエの遺伝学的ツールと組み合わせ、これらの機能は、精子形成21〜23の変異解析を容易にした。

ショウジョウバエの精子形成の段階は明確に定義されています。嚢胞内で同期開発の生殖系列細胞は精巣の長さに沿って精子形成の段階を経て順次進行する。 BOの間に雄の生殖細胞の有糸分裂と減数分裂番目、細胞質分裂が娘細胞がリング運河( 図1)として知られている細胞質の橋で接続されたままである不完全な発生します。精巣の先端チップは、一次精母細胞の16細胞嚢胞を生成するために、不完全な細胞質分裂で4糸分裂を経る精原細胞に生じる生殖細胞系列幹細胞の集団が含まれています。減数分裂前S期の後、一次精母細胞はG2、〜25倍〜90時間の間に細胞容積の増加に長期の成長期に入る。二次精母細胞とそれぞれ半数体精子細胞の64細胞嚢胞の32細胞嚢胞の形成における減数分裂Iおよび減数分裂IIの結果を通じて進行。未熟、円形精子が成熟精子を形成するために、広範な細胞リモデリングを受ける。減数分裂後の細胞は、伸長のバンドルと成熟した精子細胞、特に、精巣の容積の大部分を占める。

T女性のハエに対する機能精子の彼の成功の輸送は、いくつかの対になった構造(精巣、精嚢、および付属腺)および単一射精管で構成されている男性生殖器系、( 図2)の異なる部分間の調整が必要になります。精子は、精巣内で生産され、交尾24まで精嚢内に格納されます。付属腺は、精液を生産分泌細胞が含まれています。精嚢からの移行精子精嚢および付属腺の両方に接続されて射精管、内の精液と混合される。精子と精液のこの混合物は、最終的には雄雌の腹部25の後方端部に配置射精バルブを介してフライの膣内に雄から排出される。精液中のタンパク質は、REPにspermathecaの複数形と呼ばれる特殊な器官内で精子の長期保管のために必須であるショウジョウバエのメス26のroductiveトラクト。

ショウジョウバエの精巣の単離および精子形成の様々な段階での細胞の可視化のための優れた方法は、科学文献3月12日で利用できます。私たちは、ここに添付のビデオデモで、これらのプロトコルの例を提示することによって、知識のボディに追加します。位相差顕微鏡のための生精巣試料の調製のためのプロトコールは、以前に記載された方法27に基づいている。ホルムアルデヒド固定および精巣の免疫染色のためのプロトコルは、先に説明した方法28に基づいています。本明細書に記載されるアプローチは、 ショウジョウバエの精子形成(例えば、ダイニンの役割を評価するために、 ショウジョウバエの精子形成中のマイナス端指向性微小管モーター)の多くの研究で使用されてきた。

基本的なプロトコルに加え、提案がvaryinために提供されG解剖精原細胞、精母細胞、または成熟精子を濃縮するようになっている。嚢胞がそのまま残るか、必要に応じて破壊さどちらように精巣を処理するための異なる方法が記載されている。モデル系としてショウジョウバエ精巣を使用する利点は、 ショウジョウバエの卵母細胞および胚と比較して、抗体および色素が容易に精巣からの分散次の細胞に浸透することができ、より少ない洗浄ステップが必要とされる、ということであるため、プロトコルは、比較的に行うことができる短い時間。

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Protocol

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1。精巣の解剖

  1. CO 2のストリームを使用して、ボトルまたはバイアル中のハエを麻酔し、フライパッドに移す。
  2. 並べ小さな絵筆を使って解剖顕微鏡下で飛んで、目的の遺伝子型のショウジョウバエの雄の(実験に応じて)適切な数を収集します。 (2-5日齢)少し古い男性は、細胞を検査するための理想的であるのに対し(0-2日齢)の若い男性は、精子形成の初期段階を通じて細胞を検査するための理想的な( 例えば 、精原細胞、精母細胞、早期減数分裂後の精子細胞)精子形成の最終段階にある(特に、成熟精子)。
  3. 各(解剖時に液体中に浮遊するからハエを防ぐために)飛んでから翼を削除するために鉗子を使用してください。
  4. 上のシリコーン被覆解剖皿に降下;〜リン酸緩衝生理食塩水(PBS 130mMのNaClを、7のNa 2 HPO 4、3mMののNaH 2 PO 4)を500mlの追加黒の背景。他の水溶液が正常精巣解剖3のために使用されている。
  5. ポイントは、その場の前の方に鉗子、胸部でそれを把握し、PBSドロップでそれを浸す。解剖顕微鏡を通して見ながら、それが腹部から外れるまで後方に外性器(腹側腹部の後端に位置ダークブラウン構造)を把握し、引っ張​​って鉗子の別のペアを使用しています。ほとんどの場合、精巣、精嚢、および付属腺は外性器と腹部に沿ってから削除される、そうでない場合には、腹部に鉗子の単一の対を挿入し、精巣を引き出す。
  6. PBS降下の二対の鉗子( 図2)を用いて付属腺および外性器から分離睾丸。野生型の精巣は、簡単に自分の黄色い色で隣接白の組織とは区別される。 2すぐにステップ進みます。
  7. pharate男性( から精巣を単離するために。。電子蛹のケース内に囲まれている)、追加のステップは、第蛹ケースからハエを除去することを含むことを行う必要があります。この手順は、以前に別の場所で31記載されている。ステップ1.2から始まる大人の精巣の場合と解剖を進める。
  8. 幼虫男性から精巣を単離するために、 ショウジョウバエの幼虫の卵巣32を単離するためのプロトコルの変更を行う。簡単に言うと、オスの幼虫は脂肪体の後部3分の1に埋め込まれた大規模な、明確な、楕円形の構造(幼虫精巣)のペアが存在することによって、女性の幼虫と区別することができる。幼虫の精巣を単離するために、部分的にフレイ幼虫卵巣の単離のために説明したように腹部から精巣と周囲の脂肪体を分離するために男性の幼虫を開きます。本明細書に記載されたプロトコルのステップ2に直ちに進む。精巣は、後述する直前卵巣32について記載したように(2.3又は3.14〜ステップ)に取り付け脂肪体から除去することができる。

  1. 優しく角のガラスカバースリップ上のPBSで4-5 mLの低下で精巣の2〜3ペアを配置するためにピンセットを使用してください。少なすぎる液体は時に押しつぶされ、細胞が破裂する原因となりますのに対し、あまりにも多くの液体が押しつぶされた場合に適切に広がるから細胞を防ぐことができます:PBSボリュームに精巣数の比を調整する必要があることに注意してください。オプション:使用シリコン処理カバーがステップ3.2でのスリップをカバーするために、組織の接着を最小限にするためにスリップ。
  2. 押しつぶし中のスライド上に引き裂か領域からその精巣の内容が主になり、出力に注意(調製において所望の生殖系列細胞型の存在を最大にするように適切な位置に各精巣オープン引き裂くためにピンセットを使用しステップ)精原細胞および精母細胞を濃縮するため、その先端チップ(レベル1、 図2B)に隣接して精巣を開き涙。精母細胞および精子細胞を濃縮するため、涙は、POSでの精巣を開くレベル1(レベル2、 図2B)に少し基礎ition。より成熟した生殖細胞系細胞を濃縮するために、涙は曲率が(レベル3、 図2B)を開始する場所に近い精巣を開きます。
  3. 優しく睾丸をつぶすためにカバースリップの上にガラス顕微鏡スライドを配置し、一人でカバースリップの重量が適切に押しつぶさ試料を得るために十分であるように手動で圧​​力を加えないでください。気泡をトラップ避けるようにしてください。オプション:使用したポリ-L-リジンコーティングした顕微鏡は、ステップ3.2にスライドする組織の付着を促進するためにスライドする。
  4. 位相差顕微鏡による生きた細胞を観察するために(理想的には準備の15分以内)すぐに準備を使用してください。精巣内の蛍光タグ付きタンパク質の発現を有するトランスジェニックハエのために、生きている細胞は、この段階で、蛍光顕微鏡で検査することができる。代わりに、固定と抗体染色(プロトコル3)に進む。
  5. 優しくクリーニングWを使用してカバーガラスの下から余分な液体を吸い上げる生殖細胞に焦点が明らかになるまでIPEは、調製物の平坦化を可能にする。

3。ホルムアルデヒド固定および抗体染色

  1. スナップ(液体窒素バブリングを停止するまで)、液体窒素中で簡単にそれを浸漬金属トングのペアを使用して(プロトコル2)から押しつぶさ精巣を含む各スライドを凍結する。
  2. すぐにカミソリの刃を使用して、カバーガラスを取り外します。
  3. 氷冷95%エタノール(分光光度グレード、メタノールを含まない)で満たされた予冷したガラススライドラックにスライドを転送するために、金属トングを使用する。 10分間-20℃で保存。
  4. PBS +0.1%トリトンX-100(PBS-T)中の4%ホルムアルデヒドを充填したガラススライドラックにスライドを転送するために、金属トングを使用する。 7分間室温で保管してください。
  5. PBSで満たしたガラススライドラックにスライドを転送するために金属製トングを使用してください。室温で5分間、PBSでスライドを洗浄する。 1Xを繰り返します。 (ガラススライドラックでソリューションを破棄することにより、すべての洗浄を行う
  6. PBSを捨て、細胞膜を透過性にするために、室温で30分間、PBS-Tでスライドを浸す。
  7. 室温で5分間、PBSでスライドを洗浄する。 2Xを繰り返します。
  8. ステップ(オプション)ブロッキング:室温で45分間、PBS中のスライドプラス1%BSAを浸します。
  9. (ステップ3.9および3.11で追加)抗体溶液を閉じ込めるために(目で見えやすい)押しつぶされた組織の周囲にスライド上に円を描くように、疎水性のバリアペンを使用してください。免疫染色を行いながら組織を常に湿った保たれるべきである。
  10. 円内の組織に(抗体によっては、1時50分にPBS-T、1:400で希釈)一次抗体の30〜40 mLを加え。ブロッキングを実行した場合、PBS-T +1%BSA中で一次抗体を希釈する。 ( 図4における中心体の染色のため)、抗-γ-チューブリン抗体を1:100に希釈した。 例えば (湿った、暗い室内でインキュベートする。閉じたプラスチックの箱室温または4℃で一晩2時間湿ったペーパータオル)と
  11. 洗浄は室温の3倍で5分間、PBS中でスライドする。ブロッキングを実行した場合、PBS-Tで二回洗浄し、PBSで一回(室温で各5分)。
  12. 組織に蛍光団結合二次抗体(PBS中1:400希釈)の30〜40 mlを加え、室温で1〜2時間、暗所でインキュベートする。
  13. 室温で5分間、PBSでスライドを洗浄する。 2Xを繰り返します。
  14. 円内の組織にDAPI溶液(PBS中0.2 mg / ml)を30〜40 mLを加え。
  15. 優しく、気泡を捕捉しないように注意しながら、組織の上のガラスカバースリップを配置。気泡が表示された場合は、気泡がカバースリップの側面から脱出するまで、スカッシュを破壊することなく、カバーガラスの周りに慎重に移動します。
  16. クリーニングに使用したスライドの端から余分なDAPI​​ブロットする拭き取ります。
  17. 明確なマニキュアを使用してスライドにカバースリップをシール。
  18. この準備を使用する蛍光顕微鏡による免疫染色した細胞を表示するには、次の3〜4時間以内で。 (少なくとも数週間まで)スライドの長期的な保存のため、DAPIでメディアをマウントグリセロールベースの​​ハードを使用し、-20˚Cで店舗スライド
  19. 別の方法として、(抗原によって異なる)メタノールの代わりに、ホルムアルデヒドのサンプルを固定します。ステップ3.2を通してプロトコル全体を完了した後、-20℃で10分間メタノールに押しつぶさ精巣のスライドを浸す以降のステップ3.5に進みます。

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Representative Results

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ショウジョウバエの雄性生殖器官の解剖正しくペアの例は、 図2Aに示されている。成人男性のハエの腹部から削除精巣は通常、射精管(茶色、 図2A ')と付属腺(緑、 図2Aのペア'精嚢(青、 図2A ')の対を介して)に接続されている。添付体細胞組織のほとんどから精巣を分離するために、射精管および付属腺は切り離され、このような唯一の精巣対および精嚢ことを破棄しなければならない( 図2Bおよび2B ')のまま。精嚢は、さらに処理されるだけ精巣対を残して、除去することができる。

精巣郭清のために選択された成人男性の年齢は重要な検討事項である。若い男性(羽化​​後0-2日間)で、精嚢は小さいとほぼ空、および精巣( 図2のように)その最大直径である。若い男性を使用すると、生殖細胞系列の細胞(有糸分裂または減数分裂のいずれかを受けている)と早期減数分裂後の精子細胞を分割し、比較的多数を確保します。以上の年齢の男性(羽化​​後3〜5日)が(画像は示していない)切開のために使用される場合、それらは精子と膨出されているため、精嚢がより顕著であり、および精巣は、若い男性におけるよりも狭い。目標は、成熟した精子を可視化する場合年配の男性が好ましい。

ショウジョウバエ精巣の長さに沿った発生事象の規則正しい進行のために、精子形成の特定の段階における生殖系列細胞は、精巣潰す前に引き裂かれている解剖した位置をもとにして濃縮することができる。たとえば、Open引き裂くことは、その先端チップ(レベル1、 図2B ')の近くに精巣は精子形成の初期段階にある細胞の豊富さが得られます。 図3Aは、このようにして得られた精原細胞(白矢印)、初期の一次精母細胞(黄色の矢印)、及び後期精母細胞(赤い矢印)の代表人口の位相差像を示している。代わりに、もう少し基礎位置で開いた精巣を引き裂く(レベル2、 図2B ')は 、主に精母細胞および精子細胞が得られます。 図3Bは 、一次精母細胞(赤い矢印)の代表細胞集団の位相差像を示し、円形精子細胞(緑色の矢印)、このようにして得られた精子細胞(オレンジの矢印)、および成熟精子の束(青矢印)を長くする。

精巣の位相コントラストイメージングは、このプロセスのために重要である遺伝子における突然変異に起因するショウジョウバエの精子形成の欠陥を特徴付けるために使用することができる。位相差顕微鏡を通して見たときに円形精子細胞は、非常に画一的な外観を有する。これらの未成熟精子細胞には、それぞれ1つの、PHAを持ってEライト、ラウンドの核と( 図3Cに、それぞれ、紫色の矢印と矢印でマークされている)とほぼ同サイズの単一位相暗い、ラウンドミトコンドリア集計。これらのオルガネラの相対数やサイズの変化は異常な減数分裂(説明を参照)に起因することができます。このような欠陥の一例が図3Dに示されている。 バラバラ(ASUN)遺伝子の変異を有する成人男性から丸い精子細胞は、細胞質分裂と染色体分離29の欠陥の結果として、単一の大規模なミトコンドリアの骨材と、複数の小さな核を含んでいる。

蛍光顕微鏡は、 ショウジョウバエの精子形成を研究するためのもう1つの強力なアプローチである。押しつぶさ精巣試料から固定された細胞の蛍光画像の例を図4に示す。精巣はbTub56D遺伝子の産物が、そのC TERで融合(GFP-β1-チューブリンを発現するトランスジェニックハエから入手したminal GFPと終わりとユービーアイ-p63Eユビキチン遺伝子プロモーターの制御下で、H·小田とY秋山-ODAからの贈り物、JT生命誌研究館、大阪、日本)微小管を標識するために、( 図4D、グレースケールで緑図4aに)。 DNA( 図4Dに青、グレースケールをマークする中心体( 図4D、図4Cにグレースケールで赤)およびDAPI染色されたマークを付ける:トランスジェニック精巣は、γ-チューブリン(抗マウスCy3標識二次抗体)に対するマウス抗体を用いて免疫染色した図4Bの)。精子形成の異なる段階の細胞を容易に微小管、中心体、および染色体(凡例を参照)の配列を調べることによって同定することができる。

図1
ふぃぎゅ 1。 ショウジョウバエの雄における生殖細胞の細胞分裂の概略それぞれの幹細胞の分裂は、一次精母細胞の16細胞嚢胞を生成するために、不完全な細胞質分裂で分裂分裂 ​​の4ラウンドを受けるgonial細胞を生成します。各一次精母細胞の前相互接続された円形精子細胞の64細胞嚢胞が続く相互接続された二次精母細胞の32細胞嚢胞を形成するために、不完全な細胞質分裂を繰り返しますが、2回の減数分裂を経への長期の成長段階を経る。丸い精子細胞は、同様の大きさの位相光核および位相暗ミトコン​​ドリア凝集体(小核)が存在することを特徴とする。丸い精子細胞は、成熟した精子を形成するため、伸びと個別化を受ける。成熟した精子頭部は、それらの針状核によって同定することができる。核は青色で示されているが、黒でNebenkerne(ミトコンドリア集合体);日焼け細胞質。/ 50981fig1highres.jpg "ターゲット=" _blank ">拡大画像を表示するにはここをクリックしてください。

図2
図2。 ショウジョウバエの雄の生殖器官。若い成人男性(0-2日羽化後)は、解剖のために選択した。孤立した生殖器の光顕微鏡写真Aの漫画を、対応する'B'ABに示されている。 (A、A ')成人男性のハエの腹部から削除ショウジョウバエ精巣(赤)精嚢(青)を経由して(ブラウン)射精管に接続されている。アクセサリ腺(緑)の一対はまた、射精管に取り付けられている。 (B、B ')精巣付属腺Bから分離する必要がありますお使いになる前の準備にスライドさせます。成熟した精子を濃縮すると、レベル3で、減数分裂と減数分裂後の生殖系細胞の混合集団を得るために、レベル2で、退治する前に、レベル1の精巣は、精子形成の初期段階で細胞を濃縮するために開いた涙。スケールバー、250ミリメートルで。 拡大画像を表示するにはここをクリックしてください。

図3
ショウジョウバエの精巣の図3。位相コントラスト像(A)精原細胞(白矢印)、初期の一次精母細胞(黄色の矢印)、及び後期精母細胞(赤矢印)を含む精子形成の初期段階、の細胞の存在量は、一般的に解放されます精巣は、レベル1で引き裂かれたときに( UREの2B ')。二つ以上の相互接続されたセル(不完全な細胞質分裂の結果)は、多くの場合、押しつぶし手順(黄色の矢印が2早期精母細胞の融合をマーク)の成果物として完全に融合。 (B)ラウンド精子細胞(緑色の矢印)、伸長精 ​​子細胞(オレンジ色の矢印が部分嚢胞マーク)、および成熟精子の束(青色の矢印)を含め精母細胞(赤い矢印が遅れて、一次精母細胞をマーク)と、減数分裂後の細胞の組み合わせは、典型的には、精巣は、レベル2で引き裂かれたとき(「図2(b)参照 )をリリース。押しつぶされた精巣の(C、D)の位相コントラスト像を容易に豊富で画一的な円形精子細胞の欠陥を識別するために使用することができる。シングルミトコンドリアの集約(相濃い、紫色の矢印でマークされている)に接続され、ほぼ同じサイズの(C)は、野生型精子細胞は、1核(紫の矢印でマークされた位相の光を)持っている。 asunf02815から精子細胞精巣は、染色体分離、(D)に失敗しました分裂とエラーの結果として、複数の小さな核と一つの大きなミトコンドリアの集計が含まれています。スケールバー、10ミリメートルで。 拡大画像を表示するにはここをクリックしてください。

図4
図4 ショウジョウバエ精巣の蛍光画像 GFPタグβ1-チューブリンを発現している男性から押しつぶさ精巣の準備は孤立した(D、Aのグレースケールで緑)がDNAの両方のために固定し、染色した(DAPI、D、Bの中のグレースケールでブルー)。と中心体(γ-チューブリン抗体、D内の赤、C言語でグレースケール)。分割spermatoCYTE(白矢印)が、次のラウンドの精子細胞の大規模なフィールド(白い矢印は代表的な細胞をマーク)と、成熟精子(黄色の矢印)の束を見ることができます。スケールバー、10ミリメートルで。 拡大画像を表示するにはここをクリックしてください。

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Discussion

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野生型のハエの精巣は、容易に、それらの黄色(これとは対照的に、隣接する白の組織)に識別することができますが、 白の変異型ハエの精巣は白であり、従って、時折、腸と混同することができます。 P-エレメントで見つかったミニ遺伝子が精巣内の色素蓄積を促進しないので、 白の背景に、典型的には、ほとんどのトランスジェニック株は、、また白い精巣を持っています。 ショウジョウバエの精巣は、色で区別できない場合には、他の容易に認識可能な特徴は、対12での螺旋パターンと出現が含まれています。一部の労働者はそれが簡単に精巣12を隔離するために代わりに鉗子の解剖針を使用することを見つけることに注意してください。

このプロトコルの重要なステップは、潰れ精巣の調製である。一つの有用なアプローチは、数ミリように精巣を含むカバースリップの上にスライドを置くことで、表面TEカバースリップ上のPBS nsionは、スライドに向けた組織を含むカバースリップを持ち上げる。この方法は、嚢胞を破壊し、個々の細胞を画像化するために最適です、スライド上の細胞を分散する傾向がある。あるいは、画像化のために全部または一部嚢胞を維持するために、PBSの体積は(4〜5ミリリットル7〜8ミリリットルまで)増加させることができるカバースリップ上に置いた。

関心のある特定のショウジョウバエの変異体は成人期まで生存していない場合、幼虫または蛹の精巣は、代替的に、精子形成を研究するために使用することができる。プロトコルセクションで、参考文献はpharate雄および幼虫の卵巣の単離のために提供され、後者のプロトコルの改変は、幼虫の精巣を単離するために使用することができる。 、涙押しつぶし、幼虫や蛹の精巣を染色するための手順は、成人の精巣のためにここに記載したものと本質的に同一である。研究するフライラインは、成人期に達することができる場合であってもGも、幼虫や蛹精巣の単離は好ましいかもしれないOALは、精子形成の初期段階で細胞を得ることである。代表的な結果のセクションで説明したように、精巣前潰しに引き裂かれるレベルを変化させることによって所望のように、精子形成の初期または後期段階における細胞を濃縮することができる。

位相差顕微鏡は、 ショウジョウバエの精子形成を研究するための比較的単純なアプローチを提供しています。免疫染色し、蛍光顕微鏡上の位相差顕微鏡の一つの利点は、より少ない時間が試料を調製するために必要とされることである。精子形成の主要な段階の全ては、容易にこの技術24を用いて同定することができる。実際、いくつかのグループがショウジョウバエの雄性不稔の突然変異系統21〜23の表現型を特徴付けるための一次スクリーニングとして精巣の位相差顕微鏡分析を使用していた。減数分裂の際に、ミトコンドリア染色体が均等に娘細胞に仕切られている。 Drosophilにおける精子形成の独特の特徴および他の昆虫は、円形精子24ミトコンドリア集計(小核)の形成を含む。丸い精子細胞は、1:1の比率( 図3)に位相暗い小核とほぼ同じ大きさの位相光核を含んでいる。核の直径は、円形精子細胞のDNA含有量を反映しているため、減数分裂時の染色体分離におけるエラーは、核の大きさ33の変動につながることができます。単一の集約34に内Nebenkerneヒューズ多核ラウンド精子細胞において染色体分離の結果を次の減数分裂の破壊。したがって、円形精子内の任意の1:1の比で、または小核の大きさや形状の変化や核は容易に生きた精巣の位相差顕微鏡によって検出することができ、多くの場合、減数分裂の欠陥の診断となる。一般的な嚢胞内2つ以上の相互接続された細胞の融合が頻繁に押しつぶし手順の成果物として発生する( 図3(A)黄色矢印); Nebenkerneに核の1:1の比率は、しかし、依然として維持される。

ショウジョウバエの精巣の固定の製剤の免疫染色は、精子形成を起こしている細胞を上演するだけでなく、発現パターンと、目的のタンパク質の細胞内局在を評価するために実施することができます。細胞形態、クロマチン組織、およびチューブリンおよびDNA染色のための免疫染色し、精巣細胞の微小管の取り決めに基づき、 ショウジョウバエの精子形成の段階を分類するための洗練された方式では、 ショウジョウバエ第一次精母細胞が比較的大きい細胞である。19を説明してきたし、減数分裂のスピンドルは、CAN明らかに、このアプローチを用いて観察することができる。 (例えば、γ-チューブリンに対する抗体を用いて)中心体のためCoimmunostainingは、減数分裂紡錘体構造のより正確なビューを得るために行うことができる。不格好なやつの広い範囲で精巣を免疫染色する際、ホルムアルデヒドが適し固定剤である新設(例えば、抗ラミンおよび抗ダイニン重鎖)。微小管および中心体の形態は、しかしながら、より良好なメタノールで保存され、α-チューブリンおよびγ-チューブリンに対する抗体で免疫染色行う際に、従って、メタノールは、典型的には、固定剤として使用される。

目的のタンパク質に対する抗体が使用できない場合は、タンパク質の蛍光タグ化( 例えば 。mCherryまたはGFP)のバージョンを発現するトランスジェニックショウジョウバエ株は、代替アプローチとして生成することができる。タンパク質の細胞内局在は、次いで、組織の生存又は固定された調製物においてGFP蛍光を見るために顕微鏡を用いて決定することができ、或いは、抗GFP抗体が固定された試料中の融合タンパク質を検出するために使用することができる。 図4では、固定精巣調製における微小管は、(グロブの制御下で導入遺伝子から発現されたGFP-タグ化β1-チューブリンの固有蛍光を介して可視化した同盟国)はユビキチンプロモーターを表明した。あるいは、発現は、組織特異的プロモーターの制御下にある遺伝子組換えハエは、例えば、β2-チューブリン遺伝子のプロモーターは、精巣特異的発現35のために使用されている。あるいは、目的のタンパク質の発現は、UAS-Gal4のシステム36を使用して、特定の雄の生殖系列細胞に限定することができる。 ナノス -Gal4のは、精原細胞内UASプロモーターの制御下でタンパク質の発現を誘導するために使用することができ、 バム -Gal4のは、精母細胞37内のその発現を誘導するために用いることができる。目的のタンパク質のノックダウンはまた、これらのGal4ドライバー37と連動してUASプロモーターの制御下でのRNAiヘアピン構築体を発現させることによって精巣において誘導することができる。

ショウジョウバエの精巣細胞のライブ画像解析のための方法の開発があり得る質問の範囲を拡大しているこのシステムを使用して対処。減数分裂の事象は、細胞35の寿命を延長するために、潅流チャンバー内のフィブリン塊中で培養精母細胞の位相差顕微鏡によって可視化することができる。蛍光タグ付きタンパク質を発現するショウジョウバエの精母細胞の経時的共焦点顕微鏡も強力なアプローチ(例えば、減数分裂紡錘体を研究する)38となっている。初期段階のライブイメージングのための共焦点顕微鏡法の使用は、 ショウジョウバエ精巣の生殖細胞系列割る幹細胞は、幹細胞の調節の増大理解につながっている。本明細書に提示位相コントラストおよび免疫蛍光顕微鏡法アプローチに加えて、透過型電子顕微鏡法はまた、 ショウジョウバエの精子形成31を研究するために広く使用されている。

撮像に加えて、 ショウジョウバエの精巣は、生化学analysi用材料の供給源として使用することができるS。イムノブロッティング実験のために、解剖フライ精巣は、6×サンプル緩衝液(5ミリリットル/精巣対)でホモジナイズ煮沸し、直接SDS-PAGEゲル(4〜精巣対/レーン)上にロードすることができる。例えば、このアプローチは、いくつかのショウジョウバエの変異体の精巣におけるダイニンダイナクチン成分のレベルを評価するために使用されている。精巣抽出物は、代替的には、タンパク質の完全性を維持することが重要である場合には、非変性溶解緩衝液中で組織をホモジナイズすることにより調製することができる。例えば、 ショウジョウバエ精巣抽出物は、この組織41-43で安定なタンパク質複合体の存在を実証する免疫共沈降実験で使用されてきた。

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Disclosures

著者は、彼らが競合する経済的利益を持っていないことを宣言します。

Acknowledgments

著者らは、リー·ラボでカレンヘイルズから専門家の助言で精子形成を研究するため、これらの受け入れ方法を確立するために、マイケル·アンダーソンに感謝したいと思います。 H·小田とY秋山-ODAは、寛大に、γ-チューブリン-GFPは株式を飛ぶ提供。この作品は、LAL(GM074044)にNIHのR01の助成金によってサポートされていました。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Sylgard World Precision Instruments SYLG184 Two-part silicon elastomer for making silicone-coated dissection dish from Kimax Petri dish
PAP pen Fisher Scientific NC9888126 Ted Pella #22309
Clear nail protector Wet n Wild 7780235001
ProLong Gold Antifade Reagent with DAPI Life Technologies P36931
Mouse anti-gamma-tubulin antibody (clone GTU-88) Sigma-Aldrich T6557
Cy3-AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG  Jackson ImmunoResearch 115-165-003
Triton X-100 Fisher Scientific BP151-100
Ethanol Fisher Scientific AC61511-0040
Methanol Fisher Scientific A412-4
16% Formaldehyde Thermo Fisher Scientific 28908
Sigmacote Sigma-Aldrich SL2 Use according to manufacturer's directions to siliconize cover slips
DAPI Sigma-Aldrich D-9542 0.5 mg/ml in 75% ethanol; store at -20 °C
NaCl Research Products International Corp. S23020
Na2HPO4 Sigma-Aldrich S9763
NaH2PO4 Sigma-Aldrich S0751
Kimwipes delicate task wipers Fisher Scientific S47299
BSA Research Products International Corp. A30075 Molecular biology grade
Glass Coplin staining jar, screw cap Electron Microscopy Sciences 70315
Single frosted microscope slides Corning 2948-75X25
Poly-L-lysine coated microscope slides Polysciences, Inc. 22247-1 Optional (to replace untreated microscope slides )
Square cover glass Corning 2865-22
Razor blades Fisher Scientific 12-640
Kimax Petri dish Fisher Scientific S31473 Kimble #23060 10015 EMD
Forceps Dumont 52100-51S Pattern 5 INOX
Stemi 2000-CS stereoscope Carl Zeiss
Eclipse 80i Nikon
Plan-Fluor 40X objective Nikon
Axiophot Carl Zeiss
Plan-Neofluar Ph2 40X objective Carl Zeiss

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References

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精子形成細胞学的分析:ライブとの固定の準備<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;精巣
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Sitaram, P., Hainline, S. G., Lee, L. A. Cytological Analysis of Spermatogenesis: Live and Fixed Preparations of Drosophila Testes. J. Vis. Exp. (83), e51058, doi:10.3791/51058 (2014).More

Sitaram, P., Hainline, S. G., Lee, L. A. Cytological Analysis of Spermatogenesis: Live and Fixed Preparations of Drosophila Testes. J. Vis. Exp. (83), e51058, doi:10.3791/51058 (2014).

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