Metoder for å isolere og forbereder Drosophila testikler prøver (lever og fast) for avbildning av fase-kontrast og fluorescens mikroskopi er beskrevet her.
Drosophila melanogaster er et kraftig modellsystem som har blitt mye brukt for å belyse en rekke biologiske prosesser. For eksempel har studier over både kvinnelige og mannlige kjønns linjer av Drosophila bidratt sterkt til den nåværende forståelse av meiose samt stamcelle biologi. Utmerket protokoller er tilgjengelige i litteraturen for isolering og avbildning av Drosophila eggstokker og testikler 3-12. Heri er fremgangsmåter for disseksjon og fremstillingen av Drosophila testes for mikroskopisk analyse beskrevet i forbindelse med en tilhørende video-demonstrasjon. En protokoll for isolering av testikler fra buken av voksne menn og fremstilling av lysbilder av levende vev for analyse ved fase-kontrastmikroskopi, så vel som en protokoll for feste og farging prøvene for analyse ved fluorescens mikroskopi er presentert. Disse teknikkene kan bli anvendt i den karakteriseringen av Drosophila mutanter som oppviser defects i spermatogenesen samt i visualisering av subcellulære lokaliseringer av proteiner.
Drosophila Testiklene er en ideell modell system for studier av mange biologiske prosesser, inkludert regulering av stamceller, meiose, og sperm utvikling 13-18. De spermatocytter og deres meiotisk spindler er store og dermed praktisk for cytologisk analyse, og avslappede cellesyklus sjekkpunkter under spermatogenesis rette studiet av mutasjoner i cellesyklus gener. Forskjellige celletyper kan observeres i beordret progresjon langs lengden av testiklene, og en hvilken som helst forstyrrelse av spermatogenesen kan føre til endringer i denne generelle arrangement. Disse funksjonene kombinert med Drosophila genetiske verktøy har muliggjort mutational analyse av spermatogenesen 21-23.
Stadier av Drosophila spermatogenesen er godt definert. Kimlinje-celler som utvikler seg synkront i løpet av cyster fremgang sekvensielt gjennom stadier av spermatogenesen langs lengden av testiklene. Under both den mitotiske og meiotisk divisjoner av de mannlige kjønnsceller, oppstår cytokinese ufullstendig slik at dattercellene forbli tilkoblet med cytoplasmatiske broer kjent som kanalringer (Figur 1). Den apikale spissen av testis inneholder en befolkning på germline stamceller som gir opphav til spermatogonial celler, som gjennomgår fire mitotiske divisjoner med ufullstendig cytokinese å generere 16-celle cyster av primær spermatocytter. Etter premeiotic S-fasen, primær spermatocytter inn G2, en langvarig vekstperiode på ~ 90 timer og i løpet cellular volumøkninger ~ 25-fold. Progresjon gjennom meiose I og meiose II resultater i dannelsen av 32-celle cyster av sekundære spermatocytter og 64-celle cyster av haploide spermatider, henholdsvis. Umodne, runde spermatider gjennomgå omfattende cellular ombygging for å danne modne sædceller. Post-meiotisk celler, særlig de bunter av elongating og modne spermatider, opptar mye av volumet i testis.
Than vellykket transport av funksjonell sperm til kvinnelige fluer krever koordinering mellom de ulike delene av det mannlige reproduksjonssystemet, som er sammensatt av flere sammenkoblede strukturer (testiklene, sædblærene og tilbehør kjertler) og et enkelt uttømmelsesrør (figur 2). Sperm produseres i testiklene og lagres innen sædblærene inntil parr 24. Tilbehørs kjertler inneholde sekresjonscellene som produserer sædvæske. Sperm migrerer fra sædblærene blandes med sædvæsken innenfor uttømmelsesrør, som er koblet til begge sædblærene og tilbehørs kjertler. Denne blanding av spermier og seminal væske er til slutt pumpes ut av hann inn i vagina i den kvinnelige fly gjennom ejaculatory bulb som ligger ved den bakre enden av det mannlige abdomen 25.. Proteiner i sædvæsken er avgjørende for langvarig lagring av sæd innenfor spesialiserte organer kjent som lommene på reproductive kanalen av Drosophila kvinner 26.
Utmerket fremgangsmåter for isolering av Drosophila testikler og visualisering av celler på ulike stadier av spermatogenesen er tilgjengelige i den vitenskapelige litteraturen 3-12. Vi her legge til denne kroppen av kunnskap ved å presentere eksempler på disse protokollene med en medfølgende videodemonstrasjon. Protokollen for fremstilling av levende testikler prøver for fase-kontrastmikroskopi er basert på en tidligere beskrevet metode 27. Protokollen for formaldehyd fiksering og farging av testiklene er også basert på en tidligere beskrevet metode 28. De metoder som er beskrevet her har blitt brukt i mange undersøkelser av Drosophila spermatogenese (for eksempel for å vurdere rollen som dynein, et minus-ende-rettet microtubule motor, under Drosophila spermatogenese).
I tillegg til de grunnleggende protokoller, er forslag gitt for variasjong disseksjon, slik som å berike for spermatogonier, spermatocytter, eller moden sperm. Forskjellige fremgangsmåter for å behandle prøvene slik det cyster forblir enten intakt eller blir forstyrret etter behov, er beskrevet. En fordel ved bruk av Drosophila testikler som modellsystem er at, sammenlignet med Drosophila oocytter og embryoer, kan antistoffer og fargestoffer lett trenge celler etter deres spredning fra prøvene, og færre vasketrinn er nødvendig, og derfor kan protokoller bli utført i en relativt kort tid.
Selv om testiklene av vill type fluer lett kan identifiseres på grunn av sin gule farge (i motsetning nabo hvite vev), testiklene av hvite mutant fluer er hvit og dermed kan noen ganger forveksles med tarmen. Mest transgene stammer, som er typisk i en hvit bakgrunn, har også hvite testiklene fordi mini-hvite genet finnes i P-elementer ikke fremme pigment opphopning i testiklene. Når Drosophila testiklene ikke kan være preget av farge, andre lett gjenkjennelige funksjoner …
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne ønsker å takke Michael Anderson for etablering i Lee lab disse aksepterte metoder for å studere spermatogenesen med ekspertråd fra Karen Hales. H. Oda og Y. Akiyama-Oda sjenerøst gitt γ-tubulin-GFP fly lager. Dette arbeidet ble støttet av en NIH R01 stipend til LAL (GM074044).
Sylgard | World Precision Instruments | SYLG184 | Two-part silicon elastomer for making silicone-coated dissection dish from Kimax Petri dish |
PAP pen | Fisher Scientific | NC9888126 | Ted Pella #22309 |
Clear nail protector | Wet n Wild | 7780235001 | |
ProLong Gold Antifade Reagent with DAPI | Life Technologies | P36931 | |
Mouse anti-gamma-tubulin antibody (clone GTU-88) | Sigma-Aldrich | T6557 | |
Cy3-AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG | Jackson ImmunoResearch | 115-165-003 | |
Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151-100 | |
Ethanol | Fisher Scientific | AC61511-0040 | |
Methanol | Fisher Scientific | A412-4 | |
16% Formaldehyde | Thermo Fisher Scientific | 28908 | |
Sigmacote | Sigma-Aldrich | SL2 | Use according to manufacturer's directions to siliconize cover slips |
DAPI | Sigma-Aldrich | D-9542 | 0.5 mg/ml in 75% ethanol; store at -20°C |
NaCl | Research Products International Corp. | S23020 | |
Na2HPO4 | Sigma-Aldrich | S9763 | |
NaH2PO4 | Sigma-Aldrich | S0751 | |
Kimwipes delicate task wipers | Fisher Scientific | S47299 | |
BSA | Research Products International Corp. | A30075 | Molecular biology grade |
Glass Coplin staining jar, screw cap | Electron Microscopy Sciences | 70315 | |
Single frosted microscope slides | Corning | 2948-75X25 | |
Poly-L-lysine coated microscope slides | Polysciences, Inc. | 22247-1 | Optional (to replace untreated microscope slides ) |
Square cover glass | Corning | 2865-22 | |
Razor blades | Fisher Scientific | 12-640 | |
Kimax Petri dish | Fisher Scientific | S31473 | Kimble #23060 10015 EMD |
Forceps | Dumont | 52100-51S | Pattern 5 INOX |
Name of Equipment | Company | ||
Stemi 2000-CS stereoscope | Carl Zeiss | ||
Eclipse 80i | Nikon | ||
Plan-Fluor 40x objective | Nikon | ||
Axiophot | Carl Zeiss | ||
Plan-Neofluar Ph2 40x objective | Carl Zeiss |