Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Biology

Cytologisk Analyse spermatogenese: Skarp og Faste Preparater av doi: 10.3791/51058 Published: January 20, 2014

Summary

Metoder for å isolere og forbereder Drosophila testikler prøver (lever og fast) for avbildning av fase-kontrast og fluorescens mikroskopi er beskrevet her.

Abstract

Drosophila melanogaster er et kraftig modellsystem som har blitt mye brukt for å belyse en rekke biologiske prosesser. For eksempel har studier over både kvinnelige og mannlige kjønns linjer av Drosophila bidratt sterkt til den nåværende forståelse av meiose samt stamcelle biologi. Utmerket protokoller er tilgjengelige i litteraturen for isolering og avbildning av Drosophila eggstokker og testikler 3-12. Heri er fremgangsmåter for disseksjon og fremstillingen av Drosophila testes for mikroskopisk analyse beskrevet i forbindelse med en tilhørende video-demonstrasjon. En protokoll for isolering av testikler fra buken av voksne menn og fremstilling av lysbilder av levende vev for analyse ved fase-kontrastmikroskopi, så vel som en protokoll for feste og farging prøvene for analyse ved fluorescens mikroskopi er presentert. Disse teknikkene kan bli anvendt i den karakteriseringen av Drosophila mutanter som oppviser defects i spermatogenesen samt i visualisering av subcellulære lokaliseringer av proteiner.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Drosophila Testiklene er en ideell modell system for studier av mange biologiske prosesser, inkludert regulering av stamceller, meiose, og sperm utvikling 13-18. De spermatocytter og deres meiotisk spindler er store og dermed praktisk for cytologisk analyse, og avslappede cellesyklus sjekkpunkter under spermatogenesis rette studiet av mutasjoner i cellesyklus gener. Forskjellige celletyper kan observeres i beordret progresjon langs lengden av testiklene, og en hvilken som helst forstyrrelse av spermatogenesen kan føre til endringer i denne generelle arrangement. Disse funksjonene kombinert med Drosophila genetiske verktøy har muliggjort mutational analyse av spermatogenesen 21-23.

Stadier av Drosophila spermatogenesen er godt definert. Kimlinje-celler som utvikler seg synkront i løpet av cyster fremgang sekvensielt gjennom stadier av spermatogenesen langs lengden av testiklene. Under both den mitotiske og meiotisk divisjoner av de mannlige kjønnsceller, oppstår cytokinese ufullstendig slik at dattercellene forbli tilkoblet med cytoplasmatiske broer kjent som kanalringer (Figur 1). Den apikale spissen av testis inneholder en befolkning på germline stamceller som gir opphav til spermatogonial celler, som gjennomgår fire mitotiske divisjoner med ufullstendig cytokinese å generere 16-celle cyster av primær spermatocytter. Etter premeiotic S-fasen, primær spermatocytter inn G2, en langvarig vekstperiode på ~ 90 timer og i løpet cellular volumøkninger ~ 25-fold. Progresjon gjennom meiose I og meiose II resultater i dannelsen av 32-celle cyster av sekundære spermatocytter og 64-celle cyster av haploide spermatider, henholdsvis. Umodne, runde spermatider gjennomgå omfattende cellular ombygging for å danne modne sædceller. Post-meiotisk celler, særlig de bunter av elongating og modne spermatider, opptar mye av volumet i testis.

Than vellykket transport av funksjonell sperm til kvinnelige fluer krever koordinering mellom de ulike delene av det mannlige reproduksjonssystemet, som er sammensatt av flere sammenkoblede strukturer (testiklene, sædblærene og tilbehør kjertler) og et enkelt uttømmelsesrør (figur 2). Sperm produseres i testiklene og lagres innen sædblærene inntil parr 24. Tilbehørs kjertler inneholde sekresjonscellene som produserer sædvæske. Sperm migrerer fra sædblærene blandes med sædvæsken innenfor uttømmelsesrør, som er koblet til begge sædblærene og tilbehørs kjertler. Denne blanding av spermier og seminal væske er til slutt pumpes ut av hann inn i vagina i den kvinnelige fly gjennom ejaculatory bulb som ligger ved den bakre enden av det mannlige abdomen 25.. Proteiner i sædvæsken er avgjørende for langvarig lagring av sæd innenfor spesialiserte organer kjent som lommene på reproductive kanalen av Drosophila kvinner 26.

Utmerket fremgangsmåter for isolering av Drosophila testikler og visualisering av celler på ulike stadier av spermatogenesen er tilgjengelige i den vitenskapelige litteraturen 3-12. Vi her legge til denne kroppen av kunnskap ved å presentere eksempler på disse protokollene med en medfølgende videodemonstrasjon. Protokollen for fremstilling av levende testikler prøver for fase-kontrastmikroskopi er basert på en tidligere beskrevet metode 27. Protokollen for formaldehyd fiksering og farging av testiklene er også basert på en tidligere beskrevet metode 28. De metoder som er beskrevet her har blitt brukt i mange undersøkelser av Drosophila spermatogenese (for eksempel for å vurdere rollen som dynein, et minus-ende-rettet microtubule motor, under Drosophila spermatogenese).

I tillegg til de grunnleggende protokoller, er forslag gitt for variasjong disseksjon, slik som å berike for spermatogonier, spermatocytter, eller moden sperm. Forskjellige fremgangsmåter for å behandle prøvene slik det cyster forblir enten intakt eller blir forstyrret etter behov, er beskrevet. En fordel ved bruk av Drosophila testikler som modellsystem er at, sammenlignet med Drosophila oocytter og embryoer, kan antistoffer og fargestoffer lett trenge celler etter deres spredning fra prøvene, og færre vasketrinn er nødvendig, og derfor kan protokoller bli utført i en relativt kort tid.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

En. Testikler Dissection

  1. Anesthetize fluer i en flaske eller hetteglass ved hjelp av en strøm av CO 2 og overføre til en flue pad.
  2. Sortering fluer under et dissekerende mikroskop ved hjelp av en liten pensel, og samle inn et passende antall (avhengig av eksperimentet) av Drosophila hanner av de ønskede genotyper. Unge menn (0-2 dager gamle) er ideelle for å undersøke celler gjennom tidligere stadier av spermatogenesen (f.eks spermatogonier, spermatocytter, og tidlig post-meiotisk spermatider), mens litt eldre menn (2-5 dager gamle) er ideelle for å undersøke celler i sluttfasen av spermatogenesen (særlig modne sædceller).
  3. Bruk pinsett til å fjerne vingene fra hver fly (for å hindre fluene fra flytende i væsken under disseksjon).
  4. Til ~ 500 ml fosfat-bufret saltløsning (130 mM NaCl, 7 mM Na HPO 2 4, 3 mM NaH 2 PO 4; PBS) i en dråpe i et silikonbelagt disseksjon fatet påen svart bakgrunn. Andre vannløsninger har blitt brukt for testiklene disseksjon tre.
  5. Point tang mot fremre av flua, ta tak i det ved thorax, og dypp den i PBS dråpe. Mens du ser gjennom dissekere mikroskop, bruke en annen pinsett til å ta tak og dra i ytre genitalia (mørk brun struktur som ligger på bakre enden av ventrale abdomen) posteriorly inntil det løsner fra magen. I de fleste tilfeller vil testiklene, sædblærene og tilbehør kjertel bli fjernet fra magen sammen med de eksterne genitalia, hvis ikke, setter du inn en eneste pinsett inn i magen og erte ut testiklene.
  6. Separate testikler fra tilbehøret kjertel og ytre kjønnsorganer ved hjelp av to par av pinsetter i PBS dråpe (figur 2). Villtype testiklene er lett skilles fra nabo hvite servietter med sine gule farge. Fortsett umiddelbart til trinn to.
  7. For å isolere testiklene fra pharate hanner (i.. E omsluttet pupal tilfelle), må et ekstra trinn først gjennomføres som innebærer å fjerne fly fra pupal tilfelle, og dette trinn er tidligere beskrevet andre steder 31. Fortsett med disseksjon som for den voksne testiklene begynner på trinn 1.2.
  8. For å isolere testiklene fra larve hanner, utføre en modifikasjon av en protokoll for å isolere Drosophila larve eggstokkene 32. Kort, kan hann larver skilles fra hunn larver av tilstedeværelsen av et par store og tydelige, ovale strukturer (larve testikler) innleiret i den bakre tredjedel av fettet kroppen. Å isolere larve testiklene, delvis flå åpne den mannlige larve å isolere testiklene og de omkringliggende fett kroppen fra magen som beskrevet for isolering av larver eggstokkene. Går umiddelbart videre til trinn 2 av protokollen som beskrevet heri; testes senere kan fjernes fra fettet kroppen like før montering (trinn 2.3 og 3,14), som beskrevet i eggstokkene 32.

  1. Bruk en pinsett til å forsiktig plassere 2-3 par testikler i et fall på 4-5 ml PBS på en firkantet glass dekkglass. Legg merke til at forholdet mellom testiklene nummer til PBS volumet kan være nødvendig å justere: for mye væske vil hindre celler fra å spre riktig når knust, mens for lite væske vil føre cellene til å sprekke når knust. Valgfritt: Bruk silikonisert dekselet slips å minimere etterlevelse av vev for å dekke slip i trinn 3.2.
  2. Bruk en pinsett til å rive åpen hvert testis i en passende posisjon, slik som å maksimalisere tilstedeværelsen av de ønskede kimlinje celletyper i preparatet (legg merke til at innholdet i testis vil stort sett utgang fra revet område på glide under squashing trinn.) Å berike for spermatogonier og spermatocytter, rive åpne testis ved siden av sin apikale tips (nivå 1, figur 2B). Å berike for spermatocytter og spermatider, rive åpne testis på en position litt basal til nivå 1 (nivå 2, figur 2B). Å berike for mer modne germline celler, rive åpne testis nærmere der krumningen begynner (nivå 3, figur 2B).
  3. Forsiktig en glassobjektglass over dekkglass for å knuse prøvene, gjelder ikke trykket manuelt som vekten av dekkglass alene er tilstrekkelig for å oppnå en skikkelig knust prøve. Prøv å unngå overlapping luftbobler. Valgfritt: Bruk poly-L-lysin belagt objektglass for å fremme etterlevelse av vev til å gli i trinn 3.2.
  4. Bruk forberedelse umiddelbart (helst innen 15 min forberedelse) for å observere levende celler ved fasekontrastmikroskopi, for transgene fluer med uttrykk av fluorescently merkede proteiner i testiklene, kan levende celler bli undersøkt av fluorescens mikroskopi på dette trinnet. Alternativt, fortsette med fiksering og antistoffarging (Protokoll 3).
  5. Veke overflødig væske forsiktig fra under dekkglass ved hjelp av en rengjøring wIPE å tillate utflating av forberedelse til kjønnsceller er klart i fokus.

Tre. Formaldehyd Fiksering og antistoffarging

  1. Snap fryse hvert lysbilde som inneholder knust testiklene (fra protokoll 2) ved hjelp av et par av metall tang til å fordype det kort i flytende nitrogen (til flytende nitrogen stopper boblende).
  2. Ta av dekkglass umiddelbart med et barberblad.
  3. Bruk metall tang for å overføre lysbilder til en prechilled glass lysbilde stativ fylt med iskald 95% etanol (spectrophotometric klasse, metanol-fri). Oppbevares ved -20 ° C i 10 min.
  4. Bruk metallklyper for å overføre lysbilder på en glass-slide beholder fylt med 4% formaldehyd i PBS pluss 0,1% Triton X-100 (PBS-T). Oppbevar ved romtemperatur i 7 min.
  5. Bruk metall tang for å overføre lysbilder til et glass lysbilde stativ fylt med PBS. Vask glir i PBS i 5 min ved romtemperatur. Gjenta 1x. Utfør alle vasker ved å forkaste løsning i glass-slide stativ (
  6. Kast PBS og dyppe lysbilder i PBS-T i 30 min ved romtemperatur for å permeabilize cellemembraner.
  7. Vask glir i PBS i 5 min ved romtemperatur. Gjenta 2x.
  8. Blokkering trinn (valgfritt): Fordyp lysbilder i PBS pluss 1% BSA i 45 minutter ved romtemperatur.
  9. Bruk en hydrofob barriere penn til å tegne en sirkel på lysbildet rundt knust vev (lett synlig ved øyet) for å begrense antistoff løsninger (lagt i trinn 3,9 og 3,11). Vevet bør holdes fuktig hele tiden mens du utfører farging.
  10. Til 30 til 40 ml av primært antistoff (fortynnet i PBS-T, 1:400 til 01:50, avhengig av antistoffet) til vev inne i sirkelen. Ved blokkering ble utført, fortynnes primære antistoff i PBS-T pluss 1% BSA. Anti-gamma-tubulin-antistoff (for farging av centrosomes i figur 4) ble fortynnet 1:100. Inkuber i en fuktig, mørke kammer (f.eks. Lukket plastboksmed fuktige papirhåndklær) i 2 timer ved romtemperatur eller over natten ved 4 ° C.
  11. Vask glir i PBS i 5 min ved romtemperatur 3 ganger. Ved blokkering ble utført, vaskes to ganger i PBS-T, og en gang i PBS (5 min ved værelsestemperatur hver).
  12. Til 30 til 40 ml av fluorofor-konjugert sekundært antistoff (fortynnet 1:400 i PBS) i vev og inkuberes i mørket i 1-2 timer ved romtemperatur.
  13. Vask glir i PBS i 5 min ved romtemperatur. Gjenta 2x.
  14. Til 30 til 40 ml av DAPI-løsning (0,2 mg / ml i PBS) til vevet innenfor sirkelen.
  15. Forsiktig plassere et glass dekkglass over vev, ta vare å unngå overlapping luftbobler. Hvis luftbobler skal vises, forsiktig flytte rundt på dekkglass uten å ødelegge squash til boblene flykte fra sidene av dekkglass.
  16. Bruk en rengjøringsklut for å utslette overflødig DAPI fra kantene av raset.
  17. Tett dekkglass til lysbildet bruker klar neglelakk.
  18. Bruk dette preparateti løpet av neste 3-4 timer for å vise immunfargete celler av fluoriserende mikroskopi. For lengre tids lagring av lysbilder (opp til minst flere uker), bruke en glyserol-baserte hardt montere media med DAPI, og lagre lysbilder ved -20 ˚ C.
  19. Alternativt kan feste prøver i metanol i stedet for formaldehyd (avhengig av antigen). Etter å ha fullført hele protokollen gjennom trinn 3.2, fordype lysbilder av knust testiklene i metanol i 10 min ved -20 ° C og fortsett med trinn 3.5 og framover.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Et eksempel på en skikkelig dissekert par av Drosophila mannlige kjønnsorganer er vist i figur 2A. Testes fjernet fra bukhulen av den voksne mannlige fly er vanligvis knyttet til uttømmelsesrør (brun, figur 2A ') og et par av aksessoriske kjertler (grønn, figur 2A') via et par av sædblærene (blå, figur 2A ') . For å skille testiklene fra de fleste av den medfølgende somatisk vev, uttømmelsesrør og tilbehøret kjertler bør tas av og kastes slik at bare testiklene pair og sædblærene forbli (Tall 2B og 2B '). Sædblærene kan også bli fjernet, slik at bare testiklene paret å bli behandlet videre.

Alderen på de voksne menn som er valgt for testiklene disseksjon er en viktig faktor. Hos unge hanner (0-2 dager etter eklosjonshormon), sædblærene er småog nesten tom, og testiklene er på sitt maksimale diameter (som i figur 2). Ved hjelp av yngre menn sikrer et relativt stort antall skillelinjene germline celler (enten gjennomgår mitose eller meiose) og tidlig post-meiotisk spermatider. Ved eldre menn (3-5 dager etter eklosjonshormon) blir brukt til disseksjon (image ikke vist), sædblærene er mer fremtredende fordi de svulmende med spermier og testiklene er smalere enn hos yngre menn. Eldre menn er å foretrekke hvis målet er å visualisere moden sperm.

På grunn av den bestilte progresjon av utviklingshendelser langs lengden av Drosophila testes, kan germline cellene ved spesielle stadier av spermatogenesen anrikes basert på posisjonen hvor dissekert testiklene er revet før squashing. For eksempel, river opp testis nær sin apikale tips (nivå 1, figur 2B ') gir en overflod av celler i tidlige stadier av spermatogenesen. Figur 3A viser en fase-kontrast bilde av en representativ populasjon av spermatogonier (hvit pil), tidlige primær spermatocytter (gul pil), og sent primære spermatocytter (rød pil) oppnådde på denne måten. Alternativt, river opp testis på en litt mer basal posisjon (nivå 2, figur 2B ') gir primært spermatocytter og spermatider. Figur 3B viser en fase-kontrast bilde av en representant celle populasjon av primær spermatocytter (rød pil), runde spermatider ( grønn pil), elongating spermatider (oransje pil) og moden sperm bunter (blå pil) innhentet på denne måten.

Fase-kontrast avbildning av prøvene kan brukes til å karakterisere defekter i Drosophila spermatogenese som følge av mutasjoner i gener som er avgjørende for denne prosessen. De runde spermatider har et veldig stereotypt utseende sett gjennom en fase-kontrast mikroskop. Hver av disse umodne spermatider har et enkelt, phase-lys, rund kjerne og et enkelt, fase-mørk, rund mitokondrie summen av omtrent samme (markert med lilla pilspiss og pil, henholdsvis i figur 3C) størrelse. Variasjon i de relative tall eller størrelser av disse organeller kan skyldes avvik meiotisk divisjoner (se diskusjon). Et eksempel på en slik defekt vist i figur 3D. Runde spermatider fra voksne menn med mutasjon av stykker (asun) genet inneholder en enkelt stor mitokondriell aggregat og flere små kjerner som et resultat av defekter i cytokinese og kromosomsegregering 29..

Fluorescens mikroskopi er en annen kraftig tilnærming for å studere Drosophila spermatogenesen. Et eksempel på en fluoriserende bilde av faste celler fra et knust testikler prøven er vist i figur 4.. Testes ble innhentet fra transgene fluer uttrykker GFP-beta1-tubulin (produkt av bTub56D genet smeltet på sitt C-terterminalen ende til GFP og under kontroll av Ubi-p63E ubiquitin genpromotoren; gave fra H. Oda og Y. Akiyama-Oda, JT Biohistory Forskning Hall, Osaka, Japan) for å merke mikrotubuli (grønne i figur 4D, gråtoner i Figur 4A). De transgene testiklene ble immunostained bruker mus antistoff mot gamma-tubulin (sekundært antistoff: anti-mus Cy3) for å markere centrosomes (røde i figur 4D, gråtoner i Figur 4C) og DAPI-farget for å markere DNA (blått i figur 4D, gråtoner i figur 4B). Celler på ulike stadier av spermatogenesen kan lett identifiseres ved å kontrollere arrangement av mikrotubuli, centrosomes, og kromosomer (se legenden).

Figur 1
Figu re en. Skjematisk av germline celledelinger i Drosophila hanner. Hver stamcelle divisjon produserer en gonial celle som gjennomgår fire runder med mitotiske divisjoner med ufullstendig cytokinese å produsere en 16-cellers cyste av primære spermatocytter. Hver primære spermatocyte undergår en langvarig vekstfase før under de to meiotisk divisjoner, igjen med ufullstendig cytokinese, for å danne et 32-celle cyste av sammenkoblede sekundær spermatocytter etterfulgt av en 64-celle cyste av sammenhengende runde spermatider. Runde spermatider er karakterisert ved nærværet av en fase-lys kjerne og en fase-mørke mitokondriell aggregat (den Nebenkern) av tilsvarende størrelse. De runde spermatider gjennomgå tøyelighet og individualisering å danne modne sædceller. Modne sædceller hoder kan bli identifisert av sin nål-formede kjerner. Atomkjerner er vist i blått, Nebenkerne (mitokondrie aggregater) i svart; cytoplasma i tan./ 50981fig1highres.jpg "target =" _blank "> Klikk her for å se større bilde.

Fig. 2
Figur 2. Reproduktive organer av Drosophila hanner. Unge voksne menn (0-2 dager etter eklosjonshormon) ble valgt for disseksjon. Lys mikrografer av isolerte reproduktive organer er vist i A og B med tilhørende tegneserier i A 'og B'. (A, A ') Drosophila testikler (rød) som er fjernet fra bukhulen til en voksen mann flue er koblet til uttømmelsesrør (brun) via sædblærene (blå). Et par tilbehørs kjertler (grønn) er også knyttet til uttømmelsesrør. (B, B ') Testiklene bør skilles fra tilbehøret kjertler before forberedelse skyv. Før squashing, rive åpne testiklene på nivå 1 for å berike for celler på tidlige stadier av spermatogenesen, på nivå to for å få en blandet befolkning av meiotisk og post-meiotisk germline celler, og på nivå 3 til å berike for moden sperm. Scale bar, 250 mm. Klikk her for å se større bilde.

Figur 3
Bilder Figur 3. Fase-kontrast av Drosophila testikler. (A) En overflod av celler på tidlige stadier av spermatogenesen, inkludert spermatogonier (hvit pil), tidlige primær spermatocytter (gul pil), og sent primære spermatocytter (rød pil) er vanligvis frigitt når testis er revet på nivå 1 (se figure 2B '). To eller flere sammenhengende celler (en konsekvens av ufullstendig cytokinese) ofte smelter helt som en gjenstand av squashing prosedyre (gul pilspiss markerer en fusjon av to tidlige spermatocytter). (B) En kombinasjon av spermatocytter (rød pil markerer slutten primære spermatocyte) og post-meiotisk celler, inkludert runde spermatider (grønn pil), elongating spermatider (oransje pil markerer delvis cyste), og moden sperm bunter (blå pil), er typisk frigjøres når testis rives på nivå 2 (se figur 2B). (C, D) fase-kontrast avbildning av knust testiklene kan brukes til å lett identifisere feil i de rike og stereotype runde spermatider. Vill-type spermatider har en kjerne (fase-lys, markert med fiolett pilhode) er festet til et enkelt aggregat mitokondriell (fase-mørke, markert med pilen purpur) av omtrent samme størrelse (C). Spermatider fra asunf02815testikler inneholder flere små kjerner og en stor mitochondrial tilslag som følge av mislykket cytokinese og feil i kromosomsegregering (D). Scale bar, 10 mm. Klikk her for å se større bilde.

Figur 4
.. Figur 4 Fluorescent bilde av Drosophila testikler Preparater av knust testiklene isolert fra menn som uttrykker GFP-merket beta1-tubulin (grønn i D, gråtoner i A) ble fikset og farget for både DNA (DAPI; blå i D, gråtoner i B) og centrosomes (gamma-tubulin antistoff, rødt i D, gråtone i C). En dele spermatocyte (hvit pilspiss) kan ses ved siden av et stort felt av runde spermatider (hvit pil markerer et representativt celler) og en bunt av modne sædceller (gul pil). Scale bar, 10 mm. Klikk her for å se større bilde.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Selv om testiklene av vill type fluer lett kan identifiseres på grunn av sin gule farge (i motsetning nabo hvite vev), testiklene av hvite mutant fluer er hvit og dermed kan noen ganger forveksles med tarmen. Mest transgene stammer, som er typisk i en hvit bakgrunn, har også hvite testiklene fordi mini-hvite genet finnes i P-elementer ikke fremme pigment opphopning i testiklene. Når Drosophila testiklene ikke kan være preget av farge, andre lett gjenkjennelige funksjoner inkluderer deres spiralmønster og forekomst i par 12. Merk at noen arbeidstakere synes det er enklere å bruke disseksjon nåler i stedet for tang å isolere testiklene 12.

Et kritisk punkt i denne protokollen er utarbeidelsen av klemt testiklene. En nyttig metode er å sveve glide noen få millimeter over dekkglass inneholdende prøvene slik at overflaten tension i PBS på dekkglass løfter opp den dekkglass som inneholder vevet til objektglasset. Denne metoden har en tendens til å forstyrre cyster og spredt ut celler på lysbildet, noe som gjør den ideell for imaging individuelle celler. Alternativt, for å opprettholde hele eller delvise cyster for avbildning, volumet av PBS plassert på dekkglass kan økes (4-5 ml til 7-8 ml).

Hvis en bestemt Drosophila mutant av interesse ikke overleve til voksen alder, da larver eller pupal testikler kan alternativt brukes til å studere spermatogenesen. I den protokoll delen, er referanser gitt for isolering av pharate hanner og larve eggstokker, en modifikasjon av den sistnevnte protokollen kan brukes for å isolere larve testiklene. Fremgangsmåten for å rive, squashing, og flekker larver eller pupal testiklene er i hovedsak identisk med den som er beskrevet i dette dokumentet for den voksne testiklene. Selv om snøret som skal studeres kan nå voksen alder, kan isolering av larver eller pupal testiklene være å foretrekke hvis det goal er å få celler på de tidligste stadiene av spermatogenesen. Som beskrevet i den representative resultatene delen, kan celler i tidlige eller sene stadier av spermatogenesen bli beriket som ønsket ved å variere nivået som testis er revet før squashing.

Fasekontrastmikroskopi gir en relativt enkel tilnærming for å studere Drosophila spermatogenesen. En fordel med fasekontrastmikroskopi i løpet farging og fluoriserende mikroskopi er at mindre tid er nødvendig for å forberede prøvene. Alle de store stadier av spermatogenesen kan lett identifiseres ved hjelp av denne teknikken 24. Faktisk har flere grupper brukt fase-kontrast mikroskopisk analyse av testiklene som en primær skjerm for å karakterisere de fenotyper av Drosophila manns steril mutant linjene 21-23. Under meiotisk divisjoner, er mitokondrier og kromosomer likt partisjonert til datterceller. En unik funksjon i spermatogenesen i Drosophilen og andre insekter innebærer dannelsen av en mitokondrie aggregat (den Nebenkern) i runde spermatider 24. Runde spermatider inneholder en fase-mørke Nebenkern og en fase-lys kjernen av omtrent lik størrelse i forholdet 1:1 (figur 3). Diameteren av kjernen reflekterer DNA-innhold av de runde spermatider, slik at feil i kromosom segregering under meiose kan føre til variasjoner i atomstørrelse 33.. Forstyrrelse av meiotisk cytokinese følgende kromosom segregering resultater i multinucleated runde spermatider der Nebenkerne sikringen til en enkelt samlet 34. Derfor kan en hvilken som helst variasjon i forholdet 1:1, eller i størrelsen eller formen på Nebenkern og kjernen i runde spermatider kan lett detekteres ved fase-kontrastmikroskopi av levende testiklene og er ofte diagnostikk av defekter i meiose. Sammensmelting av to eller flere innbyrdes forbundede celler i en felles cyste ofte forekommer som en gjenstand av squashing prosedyren (fig. 3A, Gul pilspiss), 1:1-forholdet mellom kjernene til Nebenkerne imidlertid fremdeles opprettholdes.

Farging av faste preparater av Drosophila prøvene kan utføres for å fase-celler som gjennomgår spermatogenese, samt for å vurdere uttrykk mønstre og subcellulære lokaliseringer av proteiner av interesse. En raffinert ordning for klassifisering av stadier av Drosophila spermatogenesis basert på mobilnettet morfologi, kromatin organisasjon, og microtubule arrangementer av testikler celler immunostained for tubulin og DNA-farget har blitt beskrevet 19. Drosophila primære spermatocytter er relativt store celler, og de ​​meiotisk spindler kan være tydelig observert ved hjelp av denne tilnærmingen. Coimmunostaining for centrosomes (for eksempel ved hjelp av antistoffer mot gamma-tubulin) kan utføres for å oppnå en mer nøyaktig visning av meiotisk spindelstruktur. Formaldehyd er et egnet bindemiddel når farging testiklene med et bredt spekter av antibodies (for eksempel anti-lamin og anti-dynein tungkjede). Morfologi av mikrotubuli og centrosomes, er imidlertid bedre bevart med metanol, derfor er metanol vanligvis brukes som bindemiddel ved utføring av farging med antistoffer mot a-tubulin-og gamma-tubulin.

Dersom antistoffer mot et protein av interesse er tilgjengelig, kan transgene Drosophila linjer som uttrykker et fluorescensmerket (f.eks. MCherry eller GFP) versjon av proteinet bli generert som en alternativ tilnærming. Den subcellulære lokaliseringen av proteinet kan deretter bestemmes ved bruk av et mikroskop for å se GFP fluorescens i levende eller faste preparater av vev, alternativt kan anti-GFP-antistoffer brukes til å detektere fusjonsproteinet i faste prøver. I figur 4, ble mikrotubuli i en fast testes preparatet visualisert via den indre fluorescens av GFP-merket beta 1-tubulin (uttrykt fra en transgenet under kontroll av en globalliert uttrykt ubiquitin promoter). Alternativt kan transgene fluer hvori ekspresjon er under kontroll av en vevsspesifikk promotor, for eksempel, har promotoren av den beta2-tubulin-genet blitt brukt i testiklene-spesifikk ekspresjon 35.. Alternativt kan ekspresjon av et protein av interesse være begrenset til spesifikke mannlige germline celler ved hjelp av UAS-Gal4-system 36.. Nanos-Gal4 kan brukes for å indusere ekspresjon av et protein under kontroll av en promoter i UAS spermatogonial celler, mens bam-Gal4 kan brukes til å fremkalle sitt uttrykk innenfor spermatocytter 37. Knockdown av et protein av interesse kan også bli indusert i testes ved å uttrykke en RNAi hårnål konstruksjon under kontroll av en promoter UAS i forbindelse med disse Gal4 driverne 37.

Utvikling av metoder for live-bildeanalyse av Drosophila testikler celler har utvidet utvalget av spørsmål som kan væreadressert ved hjelp av dette systemet. Hendelsene meiotisk cytokinese kan visualiseres ved fasekontrastmikroskopi av spermatocytter dyrket i fibrin klumper inne i en perfusjon kammer for å forlenge levetiden på cellene 35. Time-lapse konfokalmikroskopi av Drosophila spermatocytter uttrykker fluorescently merket proteiner har også vært en kraftig tilnærming (for eksempel for å studere meiotisk spindelenheten) 38. Bruken av konfokalmikroskopi for direkte avbildning av et tidligere stadium, skillelinjene germline stamceller av Drosophila testikler, har ført til en økt forståelse av stamcelle regulering. I tillegg til fase-kontrast og immunfluorescens mikros tilnærminger presenteres her, har transmisjonselektronmikroskopi også vært mye brukt for å studere Drosophila spermatogenesis 31.

I tillegg til avbildning, kan Drosophila testikler brukes som en kilde for materialet for biokjemisk analysis. For immunoblottingforsøk eksperimenter, kan dissekert flue testikler bli homogenisert i 6x prøvebuffer (5 ml / testikler par), kokt, og direkte lastet på en SDS-PAGE gel (~ 4 testikler parene / kjørefelt). For eksempel har denne tilnærmingsmåten er benyttet for å vurdere nivået av dynein-dynactin komponenter i testiklene av flere Drosophila mutanter. Testikler ekstrakter kan alternativt fremstilles ved homogenisering av vevet i nondenaturing lysis buffer dersom det er viktig å opprettholde proteinet integritet. For eksempel, testikler Drosophila ekstrakter har vært brukt i coimmunoprecipitation eksperimenter for å verifisere tilstedeværelsen av stabile proteinkomplekser i dette vevet 41-43.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne hevder at de ikke har noen konkurrerende finansielle interesser.

Acknowledgments

Forfatterne ønsker å takke Michael Anderson for etablering i Lee lab disse aksepterte metoder for å studere spermatogenesen med ekspertråd fra Karen Hales. H. Oda og Y. Akiyama-Oda sjenerøst gitt γ-tubulin-GFP fly lager. Dette arbeidet ble støttet av en NIH R01 stipend til LAL (GM074044).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Sylgard World Precision Instruments SYLG184 Two-part silicon elastomer for making silicone-coated dissection dish from Kimax Petri dish
PAP pen Fisher Scientific NC9888126 Ted Pella #22309
Clear nail protector Wet n Wild 7780235001
ProLong Gold Antifade Reagent with DAPI Life Technologies P36931
Mouse anti-gamma-tubulin antibody (clone GTU-88) Sigma-Aldrich T6557
Cy3-AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG  Jackson ImmunoResearch 115-165-003
Triton X-100 Fisher Scientific BP151-100
Ethanol Fisher Scientific AC61511-0040
Methanol Fisher Scientific A412-4
16% Formaldehyde Thermo Fisher Scientific 28908
Sigmacote Sigma-Aldrich SL2 Use according to manufacturer's directions to siliconize cover slips
DAPI Sigma-Aldrich D-9542 0.5 mg/ml in 75% ethanol; store at -20 °C
NaCl Research Products International Corp. S23020
Na2HPO4 Sigma-Aldrich S9763
NaH2PO4 Sigma-Aldrich S0751
Kimwipes delicate task wipers Fisher Scientific S47299
BSA Research Products International Corp. A30075 Molecular biology grade
Glass Coplin staining jar, screw cap Electron Microscopy Sciences 70315
Single frosted microscope slides Corning 2948-75X25
Poly-L-lysine coated microscope slides Polysciences, Inc. 22247-1 Optional (to replace untreated microscope slides )
Square cover glass Corning 2865-22
Razor blades Fisher Scientific 12-640
Kimax Petri dish Fisher Scientific S31473 Kimble #23060 10015 EMD
Forceps Dumont 52100-51S Pattern 5 INOX
Stemi 2000-CS stereoscope Carl Zeiss
Eclipse 80i Nikon
Plan-Fluor 40X objective Nikon
Axiophot Carl Zeiss
Plan-Neofluar Ph2 40X objective Carl Zeiss

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. McKim, K. S., Joyce, E. F., Jang, J. K. Cytological analysis of meiosis in fixed Drosophila ovaries. Methods Mol. Biol. 558, 197-216 (2009).
  2. Weil, T. T., Parton, R. M., Davis, I. Preparing individual Drosophila egg chambers for live imaging. J. Vis. Exp. (2012).
  3. Bonaccorsi, S., Giansanti, M. G., Cenci, G., Gatti, M. Drosophila Protocols. Sullivan, W., Ashburner, M., Hawley, R. S. Cold Spring Harbor Laboratory Press. 87-109 (2000).
  4. Bonaccorsi, S., Giansanti, M. G., Cenci, G., Gatti, M. Immunostaining of Drosophila testes. Cold Spring Harb. Protoc.. 2011, 1273-1275 (2011).
  5. Bonaccorsi, S., Giansanti, M. G., Cenci, G., Gatti, M. Methanol-acetone fixation of Drosophila testes. Cold Spring Harb. Protoc.. 2011, 1270-1272 (2011).
  6. Bonaccorsi, S., Giansanti, M. G., Cenci, G., Gatti, M. Preparation of live testis squashes in Drosophila. Cold Spring Harb. Protoc.. 2011, (2011).
  7. Bonaccorsi, S., Giansanti, M. G., Cenci, G., Gatti, M. Formaldehyde fixation of Drosophila testes. Cold Spring Harb. Protoc.. 2012, (2012).
  8. Bonaccorsi, S., Giansanti, M. G., Cenci, G., Gatti, M. Paraformaldehyde fixation of Drosophila testes. Cold Spring Harb. Protoc.. 2012, 102-104 (2012).
  9. Bonaccorsi, S., Giansanti, M. G., Cenci, G., Gatti, M. F-actin staining of Drosophila testes. Cold Spring Harb. Protoc.. 2012, 105-106 (2012).
  10. Kibanov, M. V., Kotov, A. A., Olenina, L. V. Multicolor fluorescence imaging of whole-mount Drosophila testes for studying spermatogenesis. Anal. Biochem. 436, 55-64 (2013).
  11. Singh, S. R., Hou, S. X. Immunohistological techniques for studying the Drosophila male germline stem cell. Methods Mol. Biol. 450, 45-59 (2008).
  12. Zamore, P. D., Ma, S. Isolation of Drosophila melanogaster Testes. J. Vis. Exp. (2641), (2011).
  13. de Cuevas, M., Matunis, E. L. The stem cell niche: lessons from the Drosophila testis. Development. 138, 2861-2869 (2011).
  14. Fabian, L., Brill, J. A. Drosophila spermiogenesis: Big things come from little packages. Spermatogenesis. 2, 197-212 (2012).
  15. Giansanti, M. G., Sechi, S., Frappaolo, A., Belloni, G., Piergentili, R. Cytokinesis in Drosophila male meiosis. Spermatogenesis. 2, 185-196 (2012).
  16. Matunis, E. L., Stine, R. R., de Cuevas, M. Recent advances in Drosophila male germline stem cell biology. Spermatogenesis. 2, 137-144 (2012).
  17. McKee, B. D., Yan, R., Tsai, J. H. Meiosis in male Drosophila. Spermatogenesis. 2, 167-184 (2012).
  18. Zoller, R., Schulz, C. The Drosophila cyst stem cell lineage: Partners behind the scenes. Spermatogenesis. 2, 145-157 (2012).
  19. Cenci, G., Bonaccorsi, S., Pisano, C., Verni, F., Gatti, M. Chromatin and microtubule organization during premeiotic, meiotic and early postmeiotic stages of Drosophila melanogaster spermatogenesis. J. Cell Sci.. 107, 3521-3534 (1994).
  20. Rebollo, E., Gonzalez, C. Visualizing the spindle checkpoint in Drosophila spermatocytes. EMBO Rep. 1, 65-70 (2000).
  21. Castrillon, D. H., et al. Toward a molecular genetic analysis of spermatogenesis in Drosophila melanogaster: characterization of male-sterile mutants generated by single P element mutagenesis. Genetics. 135, 489-505 (1993).
  22. Giansanti, M. G., et al. Genetic dissection of meiotic cytokinesis in Drosophila males. Mol. Biol. Cell. 15, 2509-2522 (2004).
  23. Wakimoto, B. T., Lindsley, D. L., Herrera, C. Toward a comprehensive genetic analysis of male fertility in Drosophila melanogaster. Genetics. 167, 207-216 (2004).
  24. Fuller, M. T. The Development of Drosophila melanogaster. Bate, M., Martinez-Arias, A. Cold Spring Harbor Laboratory Press. 71-147 (1993).
  25. Wolfner, M. F. Tokens of love: functions and regulation of Drosophila male accessory gland products. Insect Biochem. Mol. Biol. 27, 179-192 (1997).
  26. Tram, U., Wolfner, M. F. Male seminal fluid proteins are essential for sperm storage in Drosophila melanogaster. Genetics. 153, 837-844 (1999).
  27. Kemphues, K. J., Raff, E. C., Raff, R. A., Kaufman, T. C. Mutation in a testis-specific beta-tubulin in Drosophila: analysis of its effects on meiosis and map location of the gene. Cell. 21, 445-451 (1980).
  28. Gunsalus, K. C., et al. Mutations in twinstar, a Drosophila gene encoding a cofilin/ADF homologue, result in defects in centrosome migration and cytokinesis. J. Cell Biol. 131, 1243-1259 (1995).
  29. Anderson, M. A., et al. Asunder is a critical regulator of dynein-dynactin localization during Drosophila spermatogenesis. Mol. Biol. Cell. 20, 2709-2721 (2009).
  30. Sitaram, P., Anderson, M. A., Jodoin, J. N., Lee, E., Lee, L. A. Regulation of dynein localization and centrosome positioning by Lis-1 and asunder during Drosophila spermatogenesis. Development. 139, 2945-2954 (2012).
  31. Martins, A. R., Machado, P., Callaini, G., Bettencourt-Dias, M. Microscopy methods for the study of centriole biogenesis and function in Drosophila. Methods in cell biology. 97, 223-242 (2010).
  32. Maimon, I., Gilboa, L. Dissection and staining of Drosophila larval ovaries. J. Vis. Exp. (10), (2011).
  33. Gonzalez, C., Casal, J., Ripoll, P. Relationship between chromosome content and nuclear diameter in early spermatids of Drosophila melanogaster. Genet. Res. 54, 205-212 (1989).
  34. Liebrich, W. The effects of cytochalasin B and colchicine on the morphogenesis of mitochondria in Drosophila hydei during meiosis and early spermiogenesis. An in vitro study. Cell Tissue. Res. 224, 161-168 (1982).
  35. Wong, R., et al. PIP2 hydrolysis and calcium release are required for cytokinesis in Drosophila spermatocytes. Curr. Biol. 15, 1401-1406 (2005).
  36. Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118, 401-415 (1993).
  37. White-Cooper, H. Tissue cell type and stage-specific ectopic gene expression and RNAi induction in the Drosophila testis. Spermatogenesis. 2, 11-22 (2012).
  38. Rebollo, E., Llamazares, S., Reina, J., Gonzalez, C. Contribution of noncentrosomal microtubules to spindle assembly in Drosophila spermatocytes. PLoS Biol. 2, (2004).
  39. Cheng, J., Hunt, A. J. Time-lapse live imaging of stem cells in Drosophila testis. Curr. Protoc. Stem Cell. Biol.. 2, 10-1002 (2009).
  40. Sheng, X. R., Matunis, E. Live imaging of the Drosophila spermatogonial stem cell niche reveals novel mechanisms regulating germline stem cell output. Development. 138, 3367-3376 (2011).
  41. Belloni, G., et al. Mutations in Cog7 affect Golgi structure, meiotic cytokinesis and sperm development during Drosophila spermatogenesis. J. Cell Sci. 125, 5441-5452 (2012).
  42. Moon, S., Cho, B., Min, S. H., Lee, D., Chung, Y. D. The THO complex is required for nucleolar integrity in Drosophila spermatocytes. Development. 138, 3835-3845 (2011).
  43. Wang, Z., Mann, R. S. Requirement for two nearly identical TGIF-related homeobox genes in Drosophila spermatogenesis. Development. 130, 2853-2865 (2003).
Cytologisk Analyse spermatogenese: Skarp og Faste Preparater av<em&gt; Drosophila</em&gt; Testikler
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Sitaram, P., Hainline, S. G., Lee, L. A. Cytological Analysis of Spermatogenesis: Live and Fixed Preparations of Drosophila Testes. J. Vis. Exp. (83), e51058, doi:10.3791/51058 (2014).More

Sitaram, P., Hainline, S. G., Lee, L. A. Cytological Analysis of Spermatogenesis: Live and Fixed Preparations of Drosophila Testes. J. Vis. Exp. (83), e51058, doi:10.3791/51058 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter