המורפוגנזה ונדידת נוירונים הן אירועים מכריעים שבבסיס התפתחות מוח תקין. כאן אנו מתארים שיטות לתמרן גנטי נוירונים בתרבית המוח הקטן גרגיר והמוח קטן מתפתח להערכה של מורפולוגיה ומאפייני נדידה של תאי עצב.
אירועים התפתחותיים במוח כולל המורפוגנזה ונדידת נוירונים הם מתוזמרים מאוד תהליכים. במבחנה in vivo מנתחים לאפשר לאפיון מעמיק כדי לזהות מסלולים מעורבים באירועים אלו. נוירונים גרגיר cerebellar (CGNs) המופקים מהמוח הקטן מתפתח הם מערכת מודל אידיאלית המאפשרת לניתוחים מורפולוגיים. כאן אנו מתארים שיטה כיצד לתפעל גנטי CGNs ואיך ללמוד-axono וdendritogenesis של נוירונים בודדים. בשיטה זו ניתן להשוות את ההשפעות של התערבות RNA, ביטוי יתר או מולקולות קטנות כדי לשלוט בנוירונים. בנוסף, קליפת המוח הקטן המכרסם היא נגישה בקלות במערכת vivo בשל ההתפתחות לאחר הלידה הדומיננטית שלה. גם אנחנו מציגים את in vivo electroporation טכניקה כדי לתפעל גנטי cerebella לפתח ולתאר במוח קטן שלאחר מכן מנתח כדי להעריך מורפולוגיה עצביתnd הגירה.
המוח הקטן הוא מערכת מצוינת ללמוד מנגנונים של צמיחת האקסון ונדידה. המוח הקטן כבר את הנושא של מחקרים אנטומיים משחר מדעי המוח 1. מיקרוסקופ מודרני וטכניקות immunohistochemical הרחיבו באופן משמעותי ומעודן תגליות הראשוניות על ידי סנטיאגו, רמון, וקחל 2-4. גנטיקה עכבר ומחקרים מולקולריים חשפו גורמי גדילה ושעתוק חיוניים בשליטה על התפתחות המוח הקטן, מה שהובילו להבנה טובה יותר של אירועים קריטיים דרושים לחיווט נכון סוגים שונים של תאי עצב, כולל נוירונים במוח קטנים גרגיר (CGNs) 5-7 של.
המוח הקטן הוא נגזר של rhombomere 1 של המוח האחורי פיתוח 8. השפתיים rhombic, שהוא חלק מהגג של חדר 4 ה, מולידה אבות נוירון גרגר המוח הקטן, אשר יהוו את האוכלוסייה עצבית הרבות ביותר בהמוח הקטן בוגר 9. בעקבות הגירה מקורי, הם להתיישב בanlage המוח הקטן. הנה, מיטוזה של מבשרי נוירון הגרגר מובילה להתרחבות הדרמטית של השכבה החיצונית הפרטנית (EGL), המתרחש לאחר לידה במכרסמים. מEGL, הנוירונים להתחיל נודדים פנימה דרך השכבה המולקולרית (מ"ל), בעבר בשכבת תא פורקינג' סופו של דבר לקחת את מגוריו בשכבת גרגרים הפנימיים (IGL 2). במהלך תהליך נדידה זו, הם רוכשים צורה דו קוטבית עם שני אקסונים הארכה לML. על הגירה נוספת, גוף התא נודד הרחק מאקסונים ושני תהליכי הפתיל כדי ליצור האקסון אחד מפוצל, בצורת אות T 10. בהמשך לכך, אקסונים אלה fasciculate ומכונים סיבים במקביל כ. לאחר שהתיישב בIGL, CGNs לגדול דנדריטים, המהווים טפרים הדנדריטים להקים סינפסות עם סיבי אזובי. כדי לבחון תהליכים בסיסיים במוח הקטן מתפתח, בשילוב במבחנה בapproac vivoשעות מאפשרת לתוצאות ומסקנות אמינות.
CGNs הם לא רק נוירונים הרבים ביותר של המוח הקטן, אלא של כל המוח ויכול להיות מתורבת לטוהר גבוה 11-13. בתרבות, אוכלוסייה עצבית הומוגנית מאוד זה הופך במהירות postmitotic ורוכשת מורפולוגיה קוטב עם אקסונים ודנדריטים לזיהוי בקלות. CGNs התרבית הוכיחו להיות מאוד שימושי כדי ללמוד היבטים שונים של התפתחות עצבית הכוללים ריבוי אב, בידול, אקסון ופיתוח דנדריט, נדידת נוירונים, אפופטוזיס ומאפייני אלקטרו (14-19 ועוד רבים אחרים). השימוש במניפולציה גנטית הרחיבה את הרבגוניות של CGNs התרבותי ואיפשר לתובנה מכניסטית נוסף לאירועים האמורים. Transfection של נוירונים בתרבית באמצעות סידן זרחה יעילות נמוכה או שיטות lipophilic אחרי immunocytochemistry עם סמני קוטביות או הוא מסייע ניתוח נתמך תוכנהtates ההערכה למשל המורפולוגיה של נוירונים בודדים בתרבות עצבית צפופה. עם גישה זו, תפקידם של חלבונים של עניין צמיחת האקסון או דנדריט ניתן ללמוד 20-25,26-28. מערכת תרבות אולם זה היא פחות שימושי לנתח נדידת נוירונים כהגירה היא מוגבלת מאוד בתרבויות בצפיפות גבוהה ותדרוש cocultures. הניתוח במבחנה של האקסון וצמיחת דנדריט גם מאפשר הבדיקה של חלבונים ביניהם של מסלול איתות באמצעות שילובים של התערבות RNA (i), על ביטוי או מולקולות קטנות.
כדי לבסס את הרלוונטיות של החלבון של העניין בהאקסון ורגולציה צמיחת דנדריט או נדידת נוירונים, electroporation in vivo הטכניקה (IVE) מאפשר הניתוח בפיתוח המוח הקטן קליפת המוח. בשל העובדה שפיתוח המוח הקטן במכרסמים משתרע דרך כלשבועות לאחר הלידה הראשון, המוח הקטן מייצג accessibמבנה המוח le למניפולציות גנטיות כדי לבחון פיתוח אקסונים ודנדריטים, נדידת נוירונים, synaptogenesis ואפופטוזיס 20-24,29,30,26,27,31-34. בנוסף, מערכת מודל זה שימושי גם להיבטים אחרים של התפתחות עצבית הדורשים את קליפת המוח הקטן בשלמותה כגון pathfinding האקסון, חיווט וקישוריות של תאי עצב ונוירון, גליה אינטראקציות יחדיו, פרוטוקול זה מספק במבחנה בטכניקות vivo כדי להתמודד עם גישה משלימה לגבי המורפוגנזה ונדידת נוירונים.
יתרונות ומגבלות של תאר במבחנה בשיטות vivo:
CGNs תרבית מעכבר והחולדות מתאימים באותה מידה גם עבור ניתוחים מורפולוגיים. בשל הגודל גדול יותר של המוח הקטן עכברוש, התשואה של CNGs מגורי חולדה עולה על זו של גורי עכבר 3-4x. מלבד CGNs, ניתן להשתמ?…
The authors have nothing to disclose.
אנחנו מודים N. Schwedhelm-Domeyer לקבלת סיוע טכני מעולה, ג האמר וש 'פאפיול לעזרה בניתוחים סטטיסטיים. העבודה שלנו ממומנת על ידי אגודת מקס פלנק, Forschungsgemeinschaft דויטשה, מרכז ננו מיקרוסקופית, מולקולרי ופיזיולוגיה של המוח (CNMPB), גטינגן, גרמניה ועל ידי ג 'וניור קבוצת מלגת GGNB של אוניברסיטת גטינגן.
DMEM | Gibco | 11960-044 | |
BME | Gibco | 41010-026 | |
Insulin | Sigma-Aldrich | Si-1-4011 | |
Poly-L-Ornithine | Sigma-Aldrich | P-2533 | |
CaCl2 | Appli-Chem | A3652 | |
Isofluorane | Actavis Deutschland | ||
Tissue-Tek OCT | Sakura | ||
Material Name | Company | Catalogue Number | Comments (optional) |
ECM 830 and tweezertrodes | Harvard Apparatus | ||
Epifluorescence microscope and camera | Nikon | ||
SP2 confocal microscope | Leica | ||
ImageJ | NIH | ||
Imaris 7.4.2 | Bitplane, Inc. | ||
GraphPad Prism | GraphPad Software, Inc. | ||
MS Excel | Microsoft | ||
Loading tip 1-200 µl | Costar | 4853 | |
Pipette tip 200 µl | Sarstedt | 70.760.502 | |
Microlance 3 needle, 30 gauge | BD | 302200 | |
50 µl gastight Syringe 1705 | Hamilton | ||
Glass coverslips | Thermo Scientific Menzel Glaeser | CB00120RA1 |