Summary
O hawaiensis anfípode Parhyale é um organismo modelo promissor para estudos de embriologia e desenvolvimento crustáceo artrópodes comparativa e evolução. Este protocolo descreve um método para a remoção manual dos blastómeros individuais a partir de embriões de fase de clivagem precoces de Parhyale.
Abstract
O hawaiensis anfípode Parhyale é um pequeno crustáceo encontrado em habitats marinhos intertidal em todo o mundo. Ao longo da última década, Parhyale emergiu como um organismo modelo promissor para estudos de laboratório de desenvolvimento, proporcionando uma comparação grupo externo útil para o modelo de artrópodes organismo bem estudado de Drosophila melanogaster. Em contraste com as clivagens sinciciais de Drosophila, os primeiros clivagens de Parhyale são holoblásticas. Mapeamento destino usando corantes traçadores injetados primeiros blastômeros têm mostrado que todas as três camadas germinativas e da linha germinal são estabelecidas pelo estágio de oito células. Nesta fase, três blastômeros estão fadados a dar origem ao ectoderma, três estão fadados a dar origem à mesoderme, e os restantes dois blastômeros são os precursores da linha endoderme e germe respectivamente. No entanto, as experiências de ablação blastômeros têm mostrado que os embriões Parhyale também possuem capabiliti regulador significativoes, de tal forma que os destinos de blastômeros cauterizado no estágio de oito células pode ser tomada pelos descendentes de alguns dos blastômeros restantes. Ablação blastomere tenha sido anteriormente descrita por um dos dois métodos: a injecção e a subsequente activação de corantes fototóxicas ou ablação manual. No entanto, fotoablação mata blastômeros, mas não remove o corpo de células mortas do embrião. Remoção física completa dos blastómeros específicos podem ser, por conseguinte, um método preferido de ablação para algumas aplicações. Aqui é apresentado um protocolo para a remoção manual dos blastómeros individuais a partir da fase de oito células de embriões Parhyale, ilustrando os instrumentos e procedimentos manuais necessárias para a remoção completa do corpo da célula, mantendo as restantes blastómeros viva e intacta. Este protocolo pode ser aplicado a qualquer célula Parhyale na fase de oito células, ou de blastómeros de outras fases de clivagem antecipada. Além disso, em princípio, este protocolo pode ser aplicável a clea precoceVåge embriões em estágio de outros invertebrados marinhos holoblastically clivagem.
Introduction
O Parhyale hawaiensis anfípode crustáceo emergiu na última década como um organismo modelo promissor e com grande potencial para uso em pesquisa evolucionária biologia do desenvolvimento 1. Entre os artrópodes, a maioria dos sistemas modelo são insetos, e os mais extensivamente estudado delas é a mosca da fruta Drosophila melanogaster. D. melanogaster é um membro da ordem de insectos Diptera, e, como tal, apresenta muitas características da embriologia que são derivadas em relação aos dos insectos basalmente ramificação 2. Além disso, os insetos são aninhados dentro do subfilo Pancrustacea 3, o que significa que os insetos têm seus parentes mais próximos dentro do grupo "natural" de longa data chamado pancrustaceans, e que este grupo é parafilético. Isto sugere que, além de basally ramificação modelos de insetos, estudos de outros crustáceos são obrigados a ter uma visão mais ampla da história evolutiva das características do desenvolvimento de ummecanismos moleculares nd que foram muito bem estudados em D. melanogaster. No entanto, muito poucos crustáceos têm sido bem estabelecido para a análise de laboratório experimental de desenvolvimento. O anfípode P. hawaiensis é um sistema de modelo de laboratório altamente tratável, passíveis de uma variedade de técnicas experimentais. Amphipods exibir muitas características únicas dentro de sua superordem pai Peracarida (funis de praia, Scuds, e camarões bem), e, portanto, são pensados para ser relativamente derivado dentro deste grupo de crustáceos. No entanto, a relativa facilidade de manipulação genética embrionária e funcional oferecido pelo Parhyale fazer este anfípode uma adição valiosa para o estoque atual de organismos modelo.
Como um animal de laboratório, P. hawaiensis oferece muitas vantagens. Os animais são tolerantes a uma ampla gama de temperaturas e salinidades, e sobreviver bem em grandes culturas de água do mar artificial 1. É fácil de distinguir entre omeen homens e mulheres com base em diferenças morfológicas claras, principalmente, das grandes, em forma de gancho, apêndices tronco anterior que os machos usam para agarrar as fêmeas durante o acasalamento. Para o trabalho embrionário e de desenvolvimento, P. hawaiensis tem várias características muito atraentes. Embriogênese dura aproximadamente 10 dias eo tempo para a maturidade sexual é cerca de seis semanas a 28 º C (mas note que Parhyale sobrevive bem em temperaturas que variam de cerca de 20-30 º C, e que a informação detalhada encenação de desenvolvimento está disponível para os embriões criados a 18 º C 4 , 25 º C 4, e 26 º C 5,6). Adultos acasalar durante todo o ano no laboratório, por isso embriões estão disponíveis em qualquer época do ano. As fêmeas colocam 2-20 (dependendo da idade das fêmeas) ovos fecundados num marsúpios ventral situada entre os vários primeiros pares de pernas (Figuras 1A e 1B), e isto é possível reunir estas embriãos muito cedo no desenvolvimento sem matar a fêmea ou danificar os embriões (Figura 1C). Os embriões sobreviver em água do mar artificial filtrada através de incubação, pode ser fixado para a expressão do gene ou posterior análise histológica 7, e uma tabela de preparação detalhada permite a identificação precisa do progresso através do desenvolvimento 5. Protocolos robustos têm sido utilizados para realizar a análise de expressão gênica por hibridização in situ 8-15 ou imunomarcação 4,16,17, knockdown funcional por interferência de RNA 13,15 ou morpholinos 12, e germinal estável transgênese 18. Usando o sistema de transgénese, expressão indutível 14 e 19 armadilha potenciador métodos também podem ser utilizados para investigar a função de genes em P. hawaiensis. Enquanto a sequência do genoma disponível publicamente não está disponível atualmente, um transcriptoma contendo transcrições produzido durante a ovogênese e embriogênese tem abelhan de novo reunidos e anotados 20, e depositado em um banco de dados pesquisável 21, facilitando a descoberta do gene. Em suma, o P. hawaiensis é um organismo modelo altamente tratável adequado para múltiplas abordagens experimentais e genéticas para a compreensão do desenvolvimento.
Ao contrário das clivagens sinciciais de D. primeiros melanogaster, P. embriões hawaiensis clivar holoblastically após a fertilização (Figura 2A). Linhagem análise rastreio mostrou que a clivagem pela terceira, cada uma das terceira blastómeros de clivagem é especificamente destinada a dar origem a uma das três camadas germinais ou da linha germinal 6 (Figura 2B). Estes dados, juntamente com dados de microarranjos 22, linhagem de células analisa 6,23, e as experiências de isolamento de blastômeros 4 sugeriram que os potenciais de desenvolvimento são segregados para pelo menos alguns terceiros blastômeros de clivagem por herança assimétrica de cell determinantes sorte. Deste modo, em experiências de ablação blastómero na qual o precursor de linha germinal (denominado "g" no Parhyale linhagem celular nomenclatura 6) foi removida na fase de oito células, os embriões não tinham células germinais em quatro estágios de desenvolvimento posteriores, como indicado pela ausência de células expressando a proteína vasa, que é um marcador de linha germinal na maioria dos metazoários 24. Em contraste, as experiências de ablação blastômeros somáticas mostrou que P. embriões hawaiensis também possuem capacidades regulatórias significativas, de modo que os destinos de mesoderme ou ectoderma blastômeros precursoras cauterizado no estágio de oito células pode ser tomada pelos descendentes de alguns dos blastômeros restantes 25. Como substituição destino celular regulador pode ocorrer, ea extensão da adoção destino celular autônoma por blastômeros somáticas, permanece desconhecida. Técnicas embriológicas experimentais tais como a ablação blastomere pode ser útil em entending a autonomia relativa e nonautonomy de decisões destino de células 26,27 e são, portanto, de interesse no estudo da P. embriogênese hawaiensis.
Nos experimentos que demonstraram substituição regulador da ectodérmicas e mesodérmicas linhagens, ablação blastomere foi realizada pela injeção de 28 e excitação subseqüente de corantes phototoxic 25. Embora esta técnica seja eficaz em matar a blastomere injectado (s), que não remover completamente o corpo da célula morta do embrião. Além disso, foram observadas diferenças entre os dados de linhagem de células recolhidas nos estadios gastrulação da embriogênese, injetando blastômeros com traçadores fluorescentes linhagem 28,29, e os dados recolhidos pelo seguinte blastômeros não perturbados por meio do desenvolvimento das mesmas fases embrionárias 23. Remoção física completa dos blastómeros específicos podem ser, por conseguinte, um método preferido de ablação para algumas aplicações.
Nós já publicou os resultados de linhagem celular de embriões analisa em que células individuais foram extirpadas manualmente 23. No entanto, as operações delicadas necessárias para remover blastómeros individuais a partir de embriões na fase inicial de clivagem ainda não foram totalmente descritos. Aqui apresentamos um protocolo para coleta de P. embriões hawaiensis e ablação manual de um único blastômero de uma fase de embrião de oito células. O objectivo deste método é o de conseguir a remoção completa do corpo de célula do embrião, permitindo a observação dos comportamentos celulares e competências destino celular das células remanescentes durante a embriogénese e desenvolvimento pós-embrionário. Nosso protocolo mostra a remoção do precursor g linha germinal (Figura 2C), mas pode ser aplicado a qualquer célula na fase de oito células, ou para as fases de clivagem de blastómeros anteriores. Em princípio, este protocolo pode ser usado para remover as células individuais de embriões em estágio iniciais de clivagem outrr holoblastically clivagem invertebrados marinhos.
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Protocol
Comentários que podem ser úteis na execução de certas etapas são indicados em itálico.
1. Dia 1: Preparação de Materiais
- Prepare os seguintes materiais (ver Tabela de Materiais e Equipamentos):
- 15 cm e 22 cm de pipetas de Pasteur
- Escriba Diamante
- Filtrou água do mar artificial (salinidade entre 0,0018-0,0020) contendo 1 mg / ml de anfotericina B (1:100 de uma solução de estoque de 100 mg / ml), 100 unidades / ml de penicilina e 100 mg / ml de estreptomicina (1:50 de uma solução de estoque contendo 5000 unidades / ml de penicilina e 5000 mg / ml de estreptomicina)
- filtrada água do mar artificial (salinidade entre ,0018-0,0020) sem aditivos
- um recipiente de plástico grande para casais de habitação (pelo menos 15 cm x 15 cm x 5 cm)
- pequeno (3 cm ou 5 cm), placas de Petri forradas com Sylgard
- pequena (3 cm ou 5 cm), os pratos de Petri
- um vidro de relógio ou de vidro multi-bem placa
- fórceps (usamos uma pinça sem corte derivado from de idade Dumont # 5 fórceps que foram danificados acidentalmente em outros procedimentos laboratoriais, os quais têm reaproveitado utilizando uma pinça de pedra de afiar para garantir que as extremidades das pinças são lisas, que ambos os dentes são do mesmo comprimento, e que eles não têm pontas afiadas. Fórceps extremamente fina, como novas Dumont # 5 fórceps, são indesejáveis, pois podem ferir os embriões e / ou fêmeas).
- uma pipeta Pasteur com o fim arregalou (veja o passo 1.2 abaixo)
- uma ferramenta de recuperação de embrião constituído por um fio de tungsténio curvado fino incorporado na extremidade mais fina de uma pipeta de Pasteur (poderia ser substituída por uma alternativa implementar; ver 1.3 abaixo)
- uma pipeta de boca, com uma pequena abertura (veja o passo 1.4)
- uma agulha de vidro feito de um capilar de vidro puxado (veja o passo 1.5)
- Para fazer com que a pipeta Pasteur alargado, primeiro pontuação em torno de uma pipeta de Pasteur 15 centímetros no ponto em que a pipeta começa a diminuir com um estilete de diamante, embrulhar a região marcado da pipeta numa toalha de papel Kimwipe ou para proteger os dedos, e, em seguida, cuidadosamente romper a ponta na linha de pontuação. Segure a extremidade quebrada da pipeta sobre a chama do queimador de Bunsen por alguns segundos para suavizar as bordas. A abertura deve ser ligeiramente mais estreito do que a largura máxima da pipeta.
- Para fazer com que a ferramenta de dissecação de arame de tungsténio, inserir um fio de tungsténio para dentro da extremidade de 15 centímetros uma pipeta de Pasteur de vidro, e mantenha rapidamente ao longo de um queimador de chama de Bunsen para fundir o vidro, a fixação do fio no lugar. Use uma pinça de curva suavemente a extremidade do fio para uma forma de gancho. Ver Figura 3 para um exemplo de uma forma adequada para esta ferramenta.
- Para fazer uma pequena abertura para a pipeta de boca, puxe a ponta fina de uma pipeta Pasteur 22 centímetros em duas peças over uma chama, e quebrar a ponta da ponta pequena. Inserir a extremidade do suporte da pipeta a boca.
- Fazer a agulha de vidro que vai ser utilizado para perfurar os blastómeros de interesse durante o processo de ablação com um extractor de agulha. Uma agulha em forma adequada é mostrado na Figura 4. Esta agulha foi retirado em um extrator de agulhas Sutter P97 usando um programa com os parâmetros 2x (calor = 566, puxar = 100, velocidade = 20, tempo = 250) + 1X (calor = 566, puxar = 100, velocidade = 100, time = 250). O programa e instrumento específico usado para fazer a agulha pode variar, mas a agulha deve ter uma ponta fina, mas também ser resistente o suficiente para não quebrar quando empurrado contra o córion do embrião.
2. Dia 1: Casais Gathering Parhyale Acasalamento
- Use a pipeta Pasteur ampliou (passo 1.2 acima) para coletar acasalamento P. casais hawaiensis do grande recipiente de cultura, e transferi-los para um recipiente contendo separado cinclinar-se a água do mar artificial. Não é necessário que esta água do mar ser filtrada. É melhor recolher pares conjugadas no fim da tarde e deixar os casais à temperatura ambiente (20-23 ° C) durante a noite, de modo que, na manhã seguinte, a maioria dos embriões foram recentemente fertilizados e depositado, e, assim, a clivagem inicial fases apropriado para ablação. Reúna pelo menos 20 pares de acasalamento para assegurar que algumas fêmeas estará carregando embriões em estágio inicial de clivagem pela manhã seguinte.
3. Dia 2: Encontro Parhyale Embriões
- Na manhã seguinte, filtrou-infundir água do mar artificial (FASW) com CO 2. Algumas das mulheres terá nadado livre de seus homens durante a noite, recolhendo estas fêmeas separados e anestesiar-los em FASW / CO 2. Os restantes machos desemparelhados podem ser removidos do recipiente par de acoplamento e devolvido para a grande cultura. Pares de acasalamento restante pode ser guardado para coleta de embriões mais tardedurante o dia ou no dia seguinte.
- Transferir uma única fêmea anestesiado transportar embriões para um vidro de relógio em FASW / CO 2. Todas as fêmeas separados, provavelmente, tenham depositado os ovos, que será visível a olho nu, como rosa pálido ou esferóides roxo através das placas coxal transparentes das mulheres (Figura 1A). Para determinar se os embriões estão em estágios iniciais de clivagem e, portanto, apropriado para a ablação de blastômeros, o pesquisador terá que remover os embriões da bolsa ninhada e examiná-las sob um microscópio.
- Visualizando o procedimento sob um microscópio de dissecação, segure as placas da coxa ao longo de um lado do corpo com uma pinça. Os embriões serão visíveis na bolsa ninhada entre essas placas ventral da coxa (Figura 1B).
- Insira a ferramenta de arame fino e curvo (Figura 3; passo 1.3 acima) na extremidade posterior da bolsa ninhada, e levante cuidadosamente o fio no final anterior da bolsa incubadora para separar a ninhadarevestimentos bolsa (estes são modificados apêndices ventrais chamados oostegites 30), abrindo a bolsa e soltando os embriões. Os embriões que estão dentro da primeira hora ou assim de ser colocado estão todos fechados dentro de uma membrana muito fina e transparente, que será facilmente perturbada pela ferramenta de arame, esta membrana desaparece por cerca de 2-3 horas após a postura de ovos, e os embriões não se limite uns com os outros ou para a fêmea de qualquer forma a partir deste ponto em diante todo embriogênese. Se os investigadores achar inconveniente ou difícil de manobrar a ferramenta de arame curvo para remover os embriões a partir da bolsa de ninhada, uma alternativa pode ser usado implementar, enquanto os movimentos são suaves e sem pressão dura é aplicado ao embrião ou ao marsúpios. Outras ferramentas apropriadas para a remoção de embriões da bolsa ninhada incluem pinças embotados ou um capilar de vidro com uma extremidade selada e suavizada.
- Use um inalterado pipeta Pasteur 15 centímetros para liberar água através da bolsa incubadora abriu, empurrando para fora tele embriões, o qual deve assentar no fundo do vidro de relógio. Transfira a fêmea para limpar FASW (sem CO 2) para permitir a recuperação antes de reintroduzir-la para a cultura principal. Várias fêmeas podem ser colocados no mesmo prato de recuperação, mas permitir que as fêmeas para se recuperar totalmente antes de devolvê-los à cultura principal, como eles podem ser comidos por outros animais, se eles ainda estão parcialmente anestesiado.
- Use um inalterado pipeta Pasteur 15 centímetros para transferir os embriões para uma placa de Petri com FASW limpo e visualizar ao microscópio para determinar o seu estágio embrionário. Embriões separados que estão na terceira clivagem (fase 4 5), que são adequados para este procedimento. Deve também ser possível aplicar este protocolo para qualquer fase clivagem antes da formação do disco germe (encena 07-08 maio).
4. Dia 2: ablação de células individuais
- Preencha Sylgard-alinhado placa de Petri com uma camada superficial de FASW. Use um inalterado 15 centímetros Pasteur piPette para transferir um único embrião para a placa.
- Usando fórceps rombas, rolar suavemente o embrião para identificar a célula a ser cauterizado (Figuras 2A e 2B). A linha germinal precursora g pode ser identificada como sendo a menor micrômetros, que fica no topo da menor Mav macromere. Além disso, g não contactar directamente a célula en, que é o micrômetros em frente, como os micrômeros mesoderme precursoras ml e share mr uma borda de célula no meio do embrião. Mr é a blastomere à direita de g, e mL é o micrômetros à esquerda de g. Os macromeres irmã de mr, ml, e en são os precursores ectoderma Er, EL, e Ep respectivamente.
- Com uma pinça na ABLt lado, se o pesquisador é destro (ou na mão direita se o pesquisador é canhoto), orientar o embrião com a célula de interesse para a direita (ou à esquerda se o pesquisador é canhoto) e agarrar suavemente o embrião entre a pinça para estabilizá-la.
- Usando uma agulha puxada vidro (passo 1.5 acima, a Figura 4), punção suavemente a célula de interesse. Não inserir a agulha demasiado longe, de modo a não empurrar a agulha para dentro das células vizinhas ou abaixo da célula de interesse. A agulha tem apenas para perfurar o cório e membrana celular subjacente, e não precisa de estender profundamente para dentro da célula a ser cauterizado.
- Troque a agulha usada para perfurar o embrião para o final de vidro de uma pipeta de boca com um bom puxado ponta da pipeta Pasteur (passo 1.4 acima). Segurar a ponta da pipeta para fechar o orifício criado na célula de interesse, e aplicar o vácuo muito suave.
- Muito aperte delicadamente o embrião com a pinça. À medida que o conteúdo do blastomero é empurrado para fora do córion através do orifício criado na etapa 4.4, sugá-lo para a pipeta boca para permitir uma visão desobstruída do embrião. Se o orifício for suficientemente grande, o núcleo da célula perfurado pode ser visto a emergir também. Esta é uma boa verificação para certificar-se o conteúdo da célula inteiros foram removidos e não pode ser regenerada.
- Observar atentamente o embrião como blastômeros de interesse é removido. A borda da célula perfurado vai recuar em direção ao buraco no córion, tornando as intersecções das células subjacentes visíveis. Continuar a aplicar pressão até que todo o blastómero de interesse tenha sido removido. Use uma pinça para a implantação do embrião de lado a lado e confirmar visualmente que todo o blastômeros de interesse é ido.
- Usando um inalterado 15 centímetros pipetas de Pasteur, transferir o embrião para limpar FASW + (FASW + 1 mg / mL de anfotericina B, 100 unidades / ml de penicilina e 100 mg / ml de estreptomicina).
- Levante embriões ablated-blastômeros em poços individuaisde um ambiente limpo placa 48 poços em FASW +, mudando 50% da FASW suplementados com antibiótico + diária. Em nossas mãos embriões sobreviver e se desenvolver bem, mesmo após a ablação, em um intervalo de temperaturas 18-28 º C. Os investigadores devem elevar seus embriões a uma temperatura para a qual eles têm uma superfície limpa (mas não necessariamente estéril) em que para levantar os embriões com o mínimo de perturbação. Para ser capaz de comparar o tempo dos eventos de desenvolvimento em embriões ablated-blastômeros com controles, nos referimos ao leitor a informação encenação de desenvolvimento detalhado, que está disponível para os embriões criados a 18 º C 4, 25 º C 4, e 26 º C 5,6.
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Representative Results
Após a ablação bem sucedida de solteiro terceira clivagem P. micrômeros hawaiensis conforme descrito neste protocolo, os micrômeros restantes gradualmente mudar suas posições ligeiramente, de modo a ocupar parcialmente o espaço anteriormente ocupado pelo blastomere ablacionada. Por exemplo, quando g é removida, o vizinho blastômeros mr e ml deslocar um pouco e chegar a compartilhar as bordas das células laterais que estavam anteriormente em contato direto com g (comparar Figura 2A e 2C). Seguindo a ablação com sucesso, os restantes blastómeros podem exibir um ligeiro atraso (de menos de uma hora) antes de entrar em quarto de clivagem, mas devem, em seguida, retomar os mesmos padrões de clivagem e tempo do que eles teriam exibido em embriões não manipuladas, pelo menos, através de fases de 23 a gastrulação . Após a ablação de qualquer um dos quatro micrômeros, descendentes do blasto restanteMeres também deve mostrar sincronismo clivagem normal e comportamentos celulares, incluindo a formação de um arranjo celular característico chamado de "roseta" eo início dos movimentos de gastrulação 23. A percentagem de embriões que sobrevivem ao processo de ablação e embriogênese completa através de incubação pode, inicialmente, ser da ordem de cerca de 10% por um investigador novo para a técnica, mas com experiência deve média de aproximadamente 50%, e pode ser tão elevada como 75% com a prática e os cuidados atentos de embriões após a ablação blastômeros. Tabela 1 mostra exemplos de números de embriões cauterizado e taxas de sobrevivência para uma série de experimentos de ablação sucessivos realizados pelo mesmo pesquisador, mostrando que as taxas de sobrevivência são geralmente pelo menos 80% para os primeiros dias após a ablação, e que as taxas de sobrevivência até a eclosão aumento com o aumento da experiência do pesquisador.
Remoção blastomere incompleta seriaevidenciado por ver restos da blastômeros que deveria ter sido extirpada, que podem incluir componentes de membrana, citoplasma, ou grânulos de vitelo, ainda situados no córion do embrião. Um atraso no quarto de clivagem de mais de duas horas, ou padrões de clivagem irregulares ou comportamentos celulares descendentes dos restantes blastómeros, também podem indicar insucessos. Estes fenómenos podem ser o resultado de danos causados a outros blastómeros durante o procedimento de ablação. Se outros do que o alvo de exibição ablação anormalidades morfológicas ou desintegrar-se, em seguida, novamente danificar blastômeros provavelmente foi causado a outros blastômeros durante o procedimento de ablação.
Se os marcadores destino celular estão disponíveis para marcar a descendência de blastómeros terceira clivagem específicos cujos destinos não estão sujeitos a substituição regulador, em seguida, a confirmação adicional da ablação com sucesso pode ser obtido pela rotulagem embriões manipulados com esses marcadores seguinasa da ablação. Marcadores de alguns mesodérmicas e ectodérmicas territórios têm sido descritas em meados de estágios finais da embriogênese 8,14,15. No entanto, porque ambas estas camadas germinais pode sofrer substituição regulador sobre a perda de uma das suas blastómeros fundadores 25, estes marcadores podem não inequivocamente determinar se ou não blastomere ablação foi bem-sucedida. No caso da linha germinal precursora g, todos os seus descendentes são marcadas pela expressão dos vasa transcrição 12 e proteína de 4 durante a embriogénese, e os embriões na qual g tem sido extirpadas as células germinativas falta, pelo menos, através de banda germe fases iniciais de 4. Ablação com sucesso de g pode, assim, ser confirmada por análise de expressão vasa após a ablação em fases posteriores do desenvolvimento embrionário (Figura 5).
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Figura 1. Adulto Parhyale hawaiensis feminino e embriões. (A) Vista lateral de uma fêmea adulta P. hawaiensis, mostrando placas coxal (setas), apêndices torácicos (setas) e embriões visíveis como esferóides rosa ou roxo através das placas coxal transparentes (azul linha pontilhada). Anterior é para a esquerda. (B) vista ventral de uma fêmea adulta P. hawaiensis mostrando embriões visíveis na bolsa ninhada (azul linha pontilhada). Anterior é para a esquerda. (C) os embriões liberados da ninhada bolsa desenvolver normalmente em FASW. Uma variedade de fases variando de S1 até incubação são mostrados, encenada acordo Browne et al 5 Escala da barra = 1 mm (A) e (B),. De 500 mM em (C).51073/51073fig1highres.jpg "target =" _blank "> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2. Oito embriões em estágio de células de P. hawaiensis. (A) Live fase de oito células (fase S4 5) embrião unmanipulated, compreendendo quatro micrômeros (células menores) e quatro macromeres (células maiores). (B) Esquema de um estágio de embrião de oito células mostrando designações destino celular de todos os blastômeros em um embrião do tipo selvagem como revelado por rastreamento linhagem com base em marcadores fluorescentes 6. (C) Live S4 fase de embrião que teve o g blastômeros removidos com o presente protocolo. A região circulou mostra a região anteriormente ocupado pelo g blastômeros, omicrômeros remanescentes mudou de posição um pouco como resultado da ablação de g. Barra de escala = 250 um em (A) e (C). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3. Fio usado para a ferramenta de remoção de embriões a partir da bolsa de ninhada. A ferramenta representada aqui foi feito através da inserção de um fio de tungsténio na extremidade estreita de uma pipeta de Pasteur e suavemente fusão do vidro para vedar o arame no lugar e, em seguida, utilizando um fórceps para introduzir uma curva suave para o fio. Outras ferramentas apropriadas para a remoção de embriões da bolsa ninhada incluem pinças embotados ou um capilar de vidro com uma extremidade selada e suavizada. Scale barra = 1 cm.
Figura 4. Agulha de vidro usado para perfurar blastômeros durante o procedimento de ablação. A agulha mostrado aqui foi puxado em um extrator de agulhas Sutter P97 usando um programa com os parâmetros 2 x (calor = 566, pull = 100, velocidade = 20 time = 250) + 1 x (calor = 566, puxar = 100, velocidade = 100, time = 250). Outros programas ou instrumentos pode ser usado para puxar agulhas adequadas para ablação, contanto que eles sejam da mesma forma geral como a que é mostrada aqui. Barra de escala = 1 cm.
Figura 5. Avaliando os resultados de um blastômeroblation durante a embriogênese. (A) região Gonad de um tipo selvagem fase S29 embrião pouco antes da eclosão, mostrando células germinativas marcadas pelo anti-Vasa immunostaining (setas). O anticorpo anti-vasa usado aqui é específico para P. hawaiensis Vasa (Linsler, Alwes e Extavour, dados não publicados). (B) região gônadas de um embrião fase S29 que tinha o g blastômeros removidos na fase de oito células, mostrando ausência de células germinativas como revelado pela ausência de sinal anti-Vasa específica na região das gônadas (setas). Barra de escala em (A) = 100 mm e aplica-se também a (B). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Ablação rodada | # Ablated | # (%) Sobreviverampara o desenvolvimento de 50% | # (%) Sobreviveram ao desenvolvimento 90-100% |
| 1 | 49 | 41 (83,7) | 6 (12,2) |
| 2 | 48 | 46 (95,8) | 17 (35,4) |
| 3 | 31 | 25 (80,6) | 22 (71,0) |
| 4 | 97 | 72 (74,2) | 56 (57,7) |
| 5 | 108 | 100 (92,6) | 65 (60,2) |
| 6 | 50 | 36 (72,0) | 37 (74,0) |
| TOTAL | 383 | 320 (83,6) | 203 (53,0) |
Tabela 1. Sobrevivência ablação Representanteestatísticas. Após ablação micrômetros, a sobrevivência foi marcado tanto no primeiro 50% do desenvolvimento (5-6 dias a 25 º C) e, em seguida, para o desenvolvimento de 90-100% (10-12 dias a 25 º C). Ablação rodadas 1-6 são exemplos representativos de experimentos realizados por um único pesquisador (AR Nast) em ordem cronológica ao longo de um período de oito meses. Os investigadores devem achar que, como mostrado aqui, as taxas de sobrevivência para aumentar o desenvolvimento 90-100% com a experiência.
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Discussion
Nós descrevemos um protocolo para a ablação manual e remoção física completa de blastômeros individuais de estágios iniciais de clivagem da anfípode P. hawaiensis. Demonstramos uso deste protocolo, removendo a única linha germinal célula precursora g de uma fase de embrião de oito células, e mostrar que a ablação tem sido bem sucedida, confirmando a ausência de células-filhas g 's na embriogênese mais tarde. Este protocolo pode ser usada para remover qualquer dos micrômeros do embrião nos estágios iniciais de clivagem. Para usar este protocolo para remover macromeres neste estágio, ou blastómeros na fase de primeira ou segunda clivagem, os utilizadores podem simplesmente aplicar as ligeiras modificações de criação de um orifício ligeiramente maior no cório, etapa 4.4, e a aplicação de pressão e de sucção para um tempo mais longo para remover o volume maior do conteúdo das células no passo 4.6. Descobrimos que após o uso deste protocolo, o desenvolvimento dos blastômeros restantes após a ablação é unafectadas com respeito a padrões de clivagem e de movimento de células, pelo menos, até ao momento da gastrulação 23.
Este protocolo pode ser útil para a investigação continuou no potencial de desenvolvimento de blastômeros iniciais de clivagem neste anfípode. Muitas perguntas ainda precisam ser respondidas nesta área, inclusive porque algumas células, mas outros não podem mudar os destinos para substituir os de blastômeros cauterizado, eo momento preciso e mecanismos dessas mudanças reguladoras. O protocolo também pode ser modificado para acomodar a ablação de mais de uma célula, por simplesmente repetindo os passos 4,2-4,7 sucessivamente dos blastómeros de interesse.
É importante o uso de um microscópio estereoscópico de alta qualidade com iluminação adequada, a fim de visualizar e identificar corretamente os blastômeros iniciais de clivagem. Nós achamos que o incidente lateral, luz branca a partir de uma fonte de luz fria de fibra óptica é o mais útil para este fim. Luz incidente diretamente acima do SPECIMen cria reflexões que podem obscurecer as morfologias celulares e fronteiras, enquanto a luz transmitida não consegue penetrar a gema densa dos embriões e blastômeros são, portanto, difíceis de distinguir. É mais útil para o vidro de relógio ou placa de Petri contendo embriões para ser colocado sobre uma superfície preta, em vez de uma superfície de vidro branco ou transparente, uma vez que oferece melhor contraste para os embriões pálidos.
Uma limitação do protocolo é que o blastômeros de interesse deve ser corretamente e inequivocamente identificado antes de iniciar o procedimento. Técnicas fotoablação seria mais útil para os pesquisadores novo para o sistema, uma vez que os embriões podem ser deixados para desenvolver por alguns ciclos de clivagem após a injeção do corante fluorescente 28, e a identidade do blastomere injetado confirmou pós-injeção, mas antes fotoablação, através da análise dos padrões dos descendentes celulares, que têm sido bem descritos na linha celular anterioridade analisa 6,23. Uma vez que os pesquisadores estão familiarizados com o P. embrião hawaiensis e pode identificar todos os blastómeros com confiança, a ablação manual descrita aqui pode ser utilizada para aplicações em que a remoção física completa de um blastómero, em vez de matar a célula sem a remoção de células mortas do corpo do embrião, é desejável.
Este procedimento pode em princípio ser aplicada para remover blastómeros individuais a partir de embriões de fase de clivagem de outros crustáceos holoblastically clivagem ou outros invertebrados marinhos ou de água doce, cuja córions ou membranas de fertilização não pode ser facilmente removido. As modificações podem incluir o uso de meio de incubação com características de salinidade apropriados, e modificando a forma da agulha para acomodar membranas mais delicados (mais agulhas, mais finas) ou revestimentos embrionárias mais robustos (mais curtos, rapidamente afilados agulhas).
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Agradecemos Rayhan Arif e Hassaan Shahawy para trabalho de câmera, Tripti Gupta e Frederike Alwes de assistência refinar a técnica de ablação de células, e os membros do laboratório Extavour para feedback sobre os dados, vídeo e manuscrito. Este trabalho foi parcialmente financiado pelo Instituto de Células-Tronco de Harvard (Seed número Grant SG-0057-10-00) da Fundação Ellison Medical (New Scholar Award número AG-NS-07010-10) a CGE, e prêmios do Programa Escola de Pesquisa de Harvard para ARN.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 cm Pasteur pipette | Wheaton | 53499-630 VWR | For transferring intact and blastomere-ablated embryos from dish to dish. |
| 22 cm Pasteur pipette | Wheaton | 53499-632 VWR | For making mouth pipette tips. |
| 3 cm Petri dishes | Thermo Scientific | 25382-334 VWR | Use some unaltered to collect and store embryos; coat some with a layer of Sylgard (see below) to create a working surface for blastomere ablations. |
| 48-well Plates | Greiner Bio-One | 82051-004 VWR | For culturing embryos following ablation. |
| Bottle top filters 0.2 µm | Nalge Nunc International | 28199-296 VWR | For creating FASW (See below). |
| Bunsen burner | VWR | 89038-530 VWR | For creating tungsten wire tool and fine tip of mouth pipette. |
| Diamond scribe | Musco Sports Lighting | 52865-005 VWR | For creating wide-mouthed Pasteur pipettes for collecting couples. |
| Forceps | Fine Science Tools | 11050-10 Fine Science Tools | For holding anaesthetized females during removal of embryos from brood pouch. These do not have to be fine-tipped Dumont forceps - the tips can be at least as blunt as those of the forceps for which the catalogue number is listed here. |
| Fungizone-Amphotericin B | Sigma | A2942 Sigma Aldrich | Add to FASW to a final concentration of 1 mg/ml, and use this solution to culture blastomere-ablated embryos. |
| Glass capillaries 4 in long, 1/0.58 OD/ID (mm) | World Precision Instruments | 1B100-4 World Precision Instruments | For making needles for puncturing the blastomere to be ablated. |
| Glass watchglass 300 mm diameter | Electron Microscopy Sciences | 70543-30 Electron Microscopy Sciences | For use in removing embryos from the brood pouch of anesthetized females. |
| Instant Ocean Artificial Sea Water (ASW) | Instant Ocean | IS160 Aquatic EcoSystems | Make ASW by dissolving salt in deionized water to a salinity of 1.022-1.024. |
| Instant Ocean Filtered Artificial Sea Water (FASW) | Instant Ocean | IS160 Aquatic EcoSystems | Use 0.2 µm filters to sterilize ASW. Make up in small amounts (< 250 ml) as needed. |
| Kimwipes | Kimberly-Clark | 21905-026 VWR | For safely breaking off the fine end of Pasteur pipettes modified for collecting couples. |
| Mouth pipette adaptor | Drummond Labware | A5177-5EA Sigma Aldrich | Insert the fine pulled Pasteur pipette tip into this end, to be used for removing extruded cell contents during the ablation procedure. |
| Mouth pipette tubing | Aldrich | Z280356 Sigma Aldrich | Cut this to be long enough to comfortably hang around your neck during the ablation procedure. |
| Needle Puller | Sutter Instrument Company | P97 Sutter Instrument Company | For making needles from glass capillaries for puncturing the blastomere to be ablated. |
| Penicillin-Streptomycin Solution | Mediatech | 45000-650 VWR | Add to FASW to a final concentration of 100 units/ml penicillin and 100 mg/ml streptomycin, and use this solution to culture blastomere-ablated embryos. |
| Rubber bulb | Electron Microscopy Sciences | 100488-418 VWR | For using Pasteur pipettes to transfer embryos from dish to dish. |
| Sylgard 184 | K. R. Anderson, Inc. | NC9659604 Fisher Scientific | Make up according to manufacturer's instructions. Pour a layer 2-5 mm thick into a 3cm petri dish to create a working surface for blastomere ablations. |
| Tungsten wire 0.004 inches diameter | A-M Systems | 719000 A-M Systems | Use this to make a tool for removing embryos from the brood pouch of anaesthetized females. |
References
- Rehm, E. J., Hannibal, R. L., Chaw, R. C., Vargas-Vila, M. A., Patel, N. H.
- Sander, K. Pattern formation in insect embryogenesis: the evolution of concepts and mechanisms. Int. J.Insect Morphol. Embryol. 25, 349-367 (1997).
- Regier, J. C., et al. Arthropod relationships revealed by phylogenomic analysis of nuclear protein-coding sequences. Nature. 463, 1079-1083 (2010).
- Extavour, C. G. The fate of isolated blastomeres with respect to germ cell formation in the amphipod crustacean Parhyale hawaiensis. Dev. Biol. 277, 387-402 (2005).
- Browne, W. E., Price, A. L., Gerberding, M., Patel, N. H. Stages of embryonic development in the amphipod crustacean, Parhyale hawaiensis. Genesis. 42, 124-149 (2005).
- Gerberding, M., Browne, W. E., Patel, N. H. Cell lineage analysis of the amphipod crustacean Parhyale hawaiensis reveals an early restriction of cell fates. Development. 129, 5789-5801 (2002).
- Rehm, E. J., Hannibal, R. L., Chaw, R. C., Vargas-Vila, M. A., Patel, N. H. Fixation and dissection of Parhyale hawaiensis embryos. Cold Spring Harbor Protoc. 2009, (2009).
- Price, A. L., Patel, N. H. Investigating divergent mechanisms of mesoderm development in arthropods: the expression of Ph-twist and Ph-mef2 in Parhyale hawaiensis. J. Exp. B. Dev. Evol. 310, 24-40 (2008).
- Rehm, E. J., Hannibal, R. L., Chaw, R. C., Vargas-Vila, M. A., Patel, N. H. In situ hybridization of labeled RNA probes to fixed Parhyale hawaiensis embryos. Cold Spring Harbor Protoc. 2009, (2009).
- Browne, W. W., Schmid, B. G. M., Wimmer, E. A., Martindale, M. Q. Expression of otd orthologs in the amphipod crustacean, Parhyale hawaiensis. Dev. Genes Evol. 216, 581-595 (2006).
- Prpic, N. M., Telford, M. J. Expression of homothorax and extradenticle mRNA in the legs of the crustacean Parhyale hawaiensis: evidence for a reversal of gene expression regulation in the pancrustacean lineage. Dev. Genes Evol. 218, 333-339 (2008).
- Kizil, G., Havemann, J., Gerberding, M. Germ cells in the crustacean Parhyale hawaiensis depend on Vasa protein for their maintenance but not for their formation. Dev. Biol. 327, 320-239 (2009).
- Liubicich, D. M., et al. Knockdown of Parhyale Ultrabithorax recapitulates evolutionary changes in crustacean appendage morphology. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 13892-13896 (2009).
- Pavlopoulos, A., et al. Probing the evolution of appendage specialization by Hox gene misexpression in an emerging model crustacean. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 13897-13902 (2009).
- Vargas-Vila, M. A., Hannibal, R. L., Parchem, R. J., Liu, P. Z., Patel, N. H. A prominent requirement for single-minded and the ventral midline in patterning the dorsoventral axis of the crustacean Parhyale hawaiensis. Development. 137, 3469-3476 (2010).
- Simanton, W., et al. Conservation of arthropod midline netrin accumulation revealed with a cross-reactive antibody provides evidence for midline cell homology. Evol. Dev. 11, 260-268 (2009).
- Rehm, E. J., Hannibal, R. L., Chaw, R. C., Vargas-Vila, M. A., Patel, N. H. Antibody staining of Parhyale hawaiensis embryos. Cold Spring Harbor Protoc. 2009, (2009).
- Pavlopoulos, A., Averof, M. Establishing genetic transformation for comparative developmental studies in the crustacean Parhyale hawaiensis. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102, 7888-7893 (2005).
- Kontarakis, Z., et al. A versatile strategy for gene trapping and trap conversion in emerging model organisms. Development. 138, 2625-2630 (2011).
- Zeng, V., et al. De novo assembly and characterization of a maternal and developmental transcriptome for the emerging model crustacean Parhyale hawaiensis. BMC Genom. 12, 581 (2011).
- Zeng, V., Extavour, C. G. ASGARD: an open-access database of annotated transcriptomes for emerging model arthropod species. Database. , (2012).
- Nestorov, P., Battke, F., Levesque, M. P., Gerberding, M. The Maternal Transcriptome of the Crustacean Parhyale hawaiensis Is Inherited Asymmetrically to Invariant Cell Lineages of the Ectoderm and Mesoderm. PLoS ONE. 8, (2013).
- Alwes, F., Hinchen, B., Extavour, C. G. Patterns of cell lineage, movement, and migration from germ layer specification to gastrulation in the amphipod crustacean Parhyale hawaiensis. Dev. Biol. 139, 110-123 (2011).
- Ewen-Campen, B., Schwager, E. E., Extavour, C. G. The molecular machinery of germ line specification. Mol. Reprod. Dev. 77, 3-18 (2010).
- Price, A. L., Modrell, M. S., Hannibal, R. L., Patel, N. H. Mesoderm and ectoderm lineages in the crustacean Parhyale hawaiensis display intra-germ layer compensation. Dev. Biol. 341, 256-266 (2010).
- Fraser, S. E., Harland, R. M. The molecular metamorphosis of experimental embryology. Cell. 100, 41-55 (2000).
- Olsson, L. A clash of traditions: the history of comparative and experimental embryology in Sweden as exemplified by the research of Gösta Jägersten and Sven Hörstadius. Theory Biosci. 126, 117-129 (2007).
- Rehm, E. J., Hannibal, R. L., Chaw, R. C., Vargas-Vila, M. A., Patel, N. H. Injection of Parhyale hawaiensis blastomeres with fluorescently labeled tracers. Cold Spring Harbor Protoc. 2009, (2009).
- Chaw, R., Patel, N. H. Independent migration of cell populations in the early gastrulation of the amphipod crustacean Parhyale hawaiensis. Dev. Biol. 371, 94-109 (2012).
- Schmitz, E. H. Crustacea Microscopic Anatomy of Invertebrates. Microscopic Anatomy of Invertebrates. Harrison, F. W. 9, Wiley-Liss, Inc.. 443-528 (1992).
