Correção Deriva de exemplo a seguir 4D confocal tempo-lapso
Summary
Microscopia de lapso de tempo permite a visualização de processos de desenvolvimento. Crescimento ou deriva de amostras durante a aquisição de imagem reduz a capacidade de acompanhar e medir movimentos celulares durante o desenvolvimento de forma precisa. Descreve-se o uso de open source software de processamento de imagem para corrigir desvio tridimensional da amostra ao longo do tempo.
Abstract
A geração de quatro dimensões (4D) de conjuntos de dados confocal; consistindo de sequências de imagens em 3D ao longo do tempo; proporciona um excelente método para capturar comportamentos celulares envolvidos em processos de desenvolvimento. A capacidade de controlar e seguir os movimentos de células é limitado pelos movimentos das amostras que ocorrem devido à deriva da amostra ou, em alguns casos, o crescimento durante a aquisição de imagem. Células de rastreamento em conjuntos de dados afetados pelo desvio e / ou crescimento irá incorporar esses movimentos em qualquer análise da posição da célula. Isto pode resultar no movimento aparente de estruturas estáticas dentro da amostra. Portanto antes de rastreamento de celular, qualquer amostra de desvio deve ser corrigido. Usando o open source Fiji distribuição 1 de ImageJ 2,3 e as ferramentas loci incorporados 4, desenvolvemos o correto 3D deriva plug-in para remover movimento amostra errônea em conjuntos de dados confocal. Este protocolo compensa efetivamente para a tradução da amostra ou alterações no po focalção, utilizando correlação de fase para registrar cada ponto de tempo de um de quatro conjuntos de dados dimensionais confocal, mantendo a capacidade de visualizar e medir movimentos celulares sobre as experiências de lapso de tempo prolongados.
Introduction
Imagiologia confocal é amplamente usado em biologia celular e de desenvolvimento para seguir os movimentos da célula e alterações na morfologia. Capturar uma série de secções ópticas em diferentes planos focais permite a geração de um modelo tridimensional (3D) de uma amostra, que pode ser estendido em quatro dimensões (4D), criando uma série de lapso de tempo de conjuntos de dados 3D. A geração de conjuntos de dados 4D permite a medição detalhada de movimentos e comportamentos celulares. Em experimentos de lapso de tempo de longo prazo, é comum observar o movimento da amostra. Isto pode ser causado por pequenas imprecisões no controlo da fase de hardware e de posições focais. Enquanto em outros casos, a deriva é um resultado de movimentos induzidos pelo crescimento da amostra ou flexibilidade dentro da mídia de montagem da amostra. Existem métodos para compensar ou limitar esses movimentos, incluindo melhorias nos sistemas com foco de hardware e aumento da rigidez do meio de montagem. No entanto, estas abordagens não pode ser aplicado em muitos casos devido à imagiologia set-se obrigados a fornecer as condições adequadas para a manutenção de amostras e crescimento. Soluções de software de código aberto que existem para a correção de movimento em 2D ao longo do tempo, através do uso das StackReg e TurboReg (http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/stackreg/) 5 plugins no ImageJ ou Fiji, mas estes não podem ser aplicada a conjuntos de dados 4D.
Para corrigir o desvio da amostra, temos desenvolvido um plug-in (Correto deriva 3D) para utilizar a plataforma de processamento de imagens de código aberto, Fiji 1. Nosso plug-in é capaz de realizar o registro de correlação de fase para corrigir movimento que ocorre como resultado da deriva amostra em experimentos de time-lapse tridimensionais. Correlação de fase 6 é um método computacional para determinar a tradução eficiente entre as imagens. O plug-in descrito aqui utiliza a biblioteca fase de correlação desenvolvido por Preibisch et al. 7. Em experiências de multi-canal, o plug-in utiliza um canal para determinaçãone a correção requerida. Esta correcção é aplicada então a quaisquer canais adicionais resultantes, o conjunto de dados de registo do 4D.
No sistema modelo de peixe-zebra é possível realizar imagiologia de lapso de tempo ao longo de um período de várias horas ou mesmo vários dias 8. Um método comum para a montagem do peixe-zebra é para incorporar o embrião vivo anestesiados em baixo agarose ponto de fusão (0,8-1,5%), restringindo seu movimento 9-11. Enquanto o movimento é restringido o crescimento da amostra continua a ocorrer, o que resulta em que as células dentro do campo de vista da posição de deslocamento. A fim de seguir o movimento das células dentro do embrião, é necessário em primeiro lugar para corrigir o movimento de toda a amostra. Este protocolo foi desenvolvido com espécimes de peixe-zebra, e tem sido utilizado para o desenvolvimento de imagem somito 12, mas pode ser aplicada a qualquer conjunto de dados confocal 4D.
Protocol
Representative Results
Discussion
A nossa capacidade de usar o software de pós-processamento para corrigir desvio da amostra de conjuntos de dados obtidos a partir de experimentos de microscopia de lapso de tempo prolongados é limitado por uma série de fatores. A capacidade para discernir deriva contra movimento migratório de uma amostra é dependente dos marcadores celulares utilizados. Marcadores celulares que são ou amplamente expressas dentro de uma amostra ou não estão envolvidos em eventos migratórios durante a aquisição de imagem propor…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gostaríamos de agradecer a Gaby Martins e os organizadores do workshop EMBO2010 3D Desenvolvimento de imagem onde este trabalho começou e todos os contribuintes para os projetos de Fiji e ImageJ.
Materials
| Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate (Tricaine) | Sigma-Aldrich | A5040 |
| Low gelling temperature agarose | Sigma-Aldrich | A9414-25G |
| Dumont #4 Forceps | Electron Microscopy Sciences | 0208-4-PO |
| Disposable 3mL graduated | Samco | 212 |
| Polyethylene transfer pipette | ||
| 9cm bacterial grade Petri dishes | Greiner Bio One | 632180 |
| Fluorinated ethylene propylene (FEP) tubing | Bola | S1815-04 |
| Zeiss LSM-710 Confocal microscope | Zeiss | |
| W Plan-Apochromat 20x/1.0 DIC Objective | Zeiss | 421452-9600-000 |
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