Summary
מיקרוסקופיה זמן לשגות מאפשרת ההדמיה של תהליכים התפתחותיים. צמיחה או סחיפה של דגימות במהלך רכישת תמונה מפחיתה את היכולת לעקוב באופן מדויק ולמדוד תנועות תא במהלך פיתוח. אנו מתארים את השימוש בתוכנת עיבוד תמונה בקוד פתוח לתיקון לשלושה להיסחף מדגם ממדי לאורך זמן.
Abstract
הדור של מערכי נתונים confocal (4D) ארבעת ממדים; בהיקף של רצפי תמונת 3D לאורך זמן; מספק מתודולוגיה מעולה כדי ללכוד התנהגויות הסלולר מעורבות בתהליכי התפתחות. היכולת לעקוב ולעקוב אחר תנועות תא היא מוגבלת על ידי תנועות מדגם המתרחשות עקב סחיפה של המדגם או, במקרים מסוימים, צמיחה במהלך רכישת תמונה. תאי מעקב במערכי נתונים מושפעים מסחף ו / או צמיחה ישלבו התנועות הללו לכל ניתוח של מצב תא. זה עלול לגרום לתנועה לכאורה של מבנים סטטיים בתוך המדגם. לכן לפני המעקב סלולרי, צריך להיות מתוקן כל להיסחף מדגם. שימוש בקוד פתוח הפצת פיג'י 1 של ImageJ 2,3 והכלים לוקוסים שילבו 4, פיתחנו את סחף התוספת 3D הנכונה כדי להסיר תנועת מדגם שגויה במערכי נתוני confocal. פרוטוקול זה מפצה באופן יעיל לתרגום מדגם או שינויים בפו המוקדsition ידי ניצול מתאם שלב לרשום בכל פעם נקודה של מערכי נתונים confocal ארבעה ממדים תוך שמירה על היכולת לחזות ולמדוד תנועות תא מעל ניסויי הזמן לשגות מורחבים.
Introduction
confocal הדמיה נעשתה שימוש נרחב בתא וביולוגיה התפתחותית לעקוב תנועות תא ושינויים במורפולוגיה. לכידת סדרה של סעיפים אופטיים במטוסי מוקד שונים מאפשרת את הדור של מודל תלת ממדי (3D) של מדגם, אשר לאחר מכן ניתן להרחיב לארבעה ממדים (4D) על ידי יצירת סדרת הזמן לשגות של מערכי נתונים 3D. הדור של מערכי נתונים 4D מאפשר מדידה מפורטת של תנועות תא והתנהגויות. בניסויי הזמן לשגות לטווח ארוך זה נפוץ לצפות בתנועה לדוגמא. זה יכול להיגרם על ידי אי דיוקים קלים בשלב השליטה החומרה ועמדות מוקד. בעוד שבמקרים אחרים, סחיפה היא תוצאה של תנועות הנגרמות על ידי צמיחת מדגם או גמישות בתוך מדגם תקשורת ההרכבה. שיטות קיימות כדי לפצות או להגביל את תנועות אלה כוללים שיפורים במערכות התמקדות חומרה וקשיחות מוגברת של ההרכבה בינונית. עם זאת, לא ניתן להחיל גישות אלה במקרים רבים עקב של ההדמיהet הנדרש כדי לספק תנאים מתאימים לשימור הדגימות והצמיחה. פתרונות תוכנת קוד פתוח קיימים לתיקון התנועה ב2D לאורך זמן, באמצעות השימוש בStackReg וTurboReg (http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/stackreg/) 5 התוספים בImageJ או פיג'י, אבל לא יכולים אלה להיות מיושם על מערכי נתונים 4D.
כדי לתקן את סחיפת המדגם שפיתחנו plug-in (להיסחף 3D נכון) לנצל את פלטפורמת עיבוד ההדמיה קוד הפתוח, 1 פיג'י. התוספת שלנו היא מסוגלת לבצע רישום מתאם שלב לתקן תנועה המתרחשת כתוצאה מסחיפת מדגם בניסויי הזמן לשגות בתלת ממד. מתאם שלב 6 הוא שיטה יעילה חישובית כדי לקבוע תרגום בין תמונות. Plug-in שתואר כאן מנצל את ספריית שלב המתאם שפותחה על ידי Preibisch et al. 7. בניסויים רב ערוצית, התוספת מנצלת ערוץ אחד לdetermine התיקון הנדרש. תיקון זה הוא אז מיושם על כל ערוצים נוספים וכתוצאה מכך הרישום של בסיס נתוני 4D.
במערכת מודל דג הזברה זה אפשרי לבצע הדמיה הזמן לשגות על פני תקופה של שעות רבות, או אפילו כמה ימים 8. שיטה נפוצה להרכבת דג הזברה היא להטביע את העובר החי מורדם בagarose נקודת התכה הנמוך (.8-1.5%), המגביל את תנועתה 9-11. בעוד תנועה מוגבלת צמיחה של המדגם עדיין מתרחשת, וכתוצאה מכך התאים בתוך שדה ראיית הסטת עמדה. על מנת לעקוב אחר תנועתם של התאים בתוך העובר יש צורך תחילה לתקן את תנועה של המדגם כולו. פרוטוקול זה פותח עם דגימות דג הזברה, ונוצל לפיתוח somite התמונה 12 אבל יכול להיות מיושם על כל מערך נתונים confocal 4D.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. ניסויי ההדמיה 4D הזמן לשגות
ההגדרות המשמשות לרכישת תמונה תהיה שונות בהתאם לציוד המשמש. היכולת של מיקרוסקופיה confocal סעיף אופטי מדגם תלוי במספר הגורמים: אורך הגל של עירור, גודל חריר, צמצם מספרי של המטרה, השבירה של המדגם והמדיום שבו המדגם הוא משובץ. גודל חריר confocal נבחר יקבע את העובי של הסעיף האופטי שנאסף. חריר קטן יותר יפיק סעיף אופטי דק יותר הגדלת הרזולוציה Z-הציר, אבל להפחית את כמות האור שנתפס. חריר גדול יותר יגדיל את העובי של הסעיף האופטי, הקטנת רזולוציה Z-ציר, אלא מגביר את כמות האור שנתפס.
גורמים נוספים שיש לשקול בעת איסוף נתוני 4D לפני התיקון כוללים:
- לייעל את מהירות סריקה כדי להסיר, או מגבלה, להיסחף דuring לכידתו של זמן בנקודה אחת. לכן הזמן שלוקח לאוסף התמונה צריך להיות חלק קטן של המרווח בין נקודות זמן.
- מבנים בצורה מושלמת החוזרים, או רשתות, אינם מתאימים כמבנים לרישום כפי שלא ניתן לקבוע את התיקון הנדרש. חרוזים מתפזרים באופן אקראי או מבנים לא אחידים יאפשר רישום חד משמעי.
- אם להיסחף צפוי, להגדיל את שטח הסריקה וגבולות מוקד עליון ותחתונים על מנת להבטיח את השטח של עניין נשאר בתוך ערימת התמונה.
- בנוסף להבטחה שיש רזולוציה מרחבית מתאימה כדי לפתור את המבנים של עניין, להגדיר את קצב הדגימה על מנת לספק פתרון זמני לאירועים הדינמיים הנלמדים.
הערה: הזמן בין נקודות זמן תמונה ולכן צריך להיות לפחות חצי בזמן ההפסקה בין אירועים חוזרים הרגילים ולהקטין לאירועים חריגים.
2. פתיחת Confocal Dataset
חבילת הקוד הפתוחה פיג'י היא הפצה של תכנית ImageJ, המכילה תוספות מותקנות מראש לביצוע תהליכים רבים על נתונים שנאספו מניסויים במיקרוסקופ. התוכנה מספקת ארכיטקטורת עדכון התוספת קלה וכוללת עותק של התוספת להיסחף הנכונה 3D המשמשת לפרוטוקול זה. התוכנה תומכת ביבוא של מגוון רחב של פורמטים של תמונות מיקרוסקופיה קניינית באמצעות השימוש בביו פורמטי יבוא plug-in של מיקרוסקופית פתח הסביבה.
- התקן את תכנית פיג'י (http://fiji.sc/Downloads).
- טען את בסיס הנתונים נרכשו באמצעות תוסף יבואן לוקוסים Bio-הפורמטים.
- אם בסיס הנתונים גדול יותר מהזיכרון שהוקצה לתכנית, בחר באפשרות "השימוש וירטואלית הערימה" בתוך קטע ניהול זיכרון.
3. תיקון הסחף של אובייקט 3D בהודעת עיבוד
במהלך זמן לשגות מורחבלהתנסות מדגם עשוי לעבור גם כאשר משובץ. כדי לתקן את כל תנועה ולאפשר לאירועי ההגירה צילמו להיות מנותחים, שלאחר עיבוד של תמונות ניתן לבצע. כל ההודעה תמונת העיבוד חייב להיות מתואר באופן ברור במתודולוגיה של כל ניתוח הנגזר מעבודה זו.
- ברגע שהבסיס הנתונים נטען, להפעיל את התוסף להיסחף 3D הנכון.
- אם יש ערוצי תמונה מרובים, בחר את הערוץ שישמש לרשום את התמונות. זה אידיאלי צריך לייצג את מבנה סטטי בתוך המדגם ולא כל אלמנטים נודדים או ניידים. עם זאת, אם זה לא אפשרי יש לבחור את הערוץ עם התנועה לפחות.
- אם זיכרון RAM הזמינים במערכת המשמשת לניתוח זה הוא פחות מכפול בגודל של בסיס הנתונים המקוריים, בחר באפשרות הערימה הווירטואלית השימוש. זה יהיה לאחסן hyperstack הרשום כתמונה ברצף, ולא לשמור את הקובץ ל-RAM.
- בחר תיקייה לתוספת לאדם פלט מתוקן הר"יקבצי GES. קובץ תמונה נפרד יופק עבור כל ערוץ בכל עמדת z.
- לאחר מכן התוסף יערוך ניתוח מתאם שלב זוג חכם בין כל נקודת זמן כדי לקבוע את התיקון הנדרש אשר לאחר מכן מוחל על בסיס הנתונים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
בדג הזברה מתפתחת, תאי שריר מהירים למזג לתוך סיבי multinucleated מ19 שעות לאחר הפריה (20 - שלב somite) 13. על מנת להמחיש את תנועתם של גרעינים ואיחוי של תאי שריר שבוצעו זמן לשגות הדמיה confocal 4D באמצעות זן מהונדס המבטא את החלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) תחת השליטה של אמרגן α-אקטין השלד לתייג את כל השרירים תאים 14 והזריק RNA המקודד את חלבון הניאון האדום mCherry מתויג עם רצף לוקליזציה גרעיני, לתייג את הגרעינים. עוברים מהונדסים הוחדרו היו רכובים בagarose התכה הנמוך ונקודת רצף תמונה מורכבת מ71 סעיפים אופטיים שנתפסו ב2.0 מיקרומטר מרווחים כל 20 דקות על תקופת זמן 2 שעה. להיסחף מדגם של כ 7 מיקרומטר נצפה במהלך ניסוי הזמן לשגות, וכתוצאה מכך לטשטוש התמונות החופפות (איור 1 א) ותנועה לכאורה של nuclei לאורך זמן (איור 1). יישום של התוסף ניתן לראות לגרום לתמונה ברצף רשום (1C דמויות ו1D).
איור 1: הפרוטוקול מתקן תנועת מדגם במהלך רכישת תמונה בחלל תלת ממדי תמונת ההיטל ממוצעת של תחזיות המרביות מכל נקודה של בסיס הנתונים המתוקנים מראים ביטוי שרירים ספציפי GFP () ורצף לוקליזציה גרעיני התמזגו mCherry (ב ') זמן.. של תנועה זו במידה מפחיתה את היכולת לעקוב אחר גרעיני השריר ואיחוי, והטשטוש של תמונת ה-GFP הוא מאליו. התמונות תוקנו וכתוצאה מכך מוצגות ב( ג) ו (ד '), הוכיחו את הרישום של בסיס הנתונים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
היכולת שלנו להשתמש בתוכנה שלאחר עיבוד כדי לתקן להיסחף מדגם של מערכי נתונים הנגזרים מניסויים מיקרוסקופיה זמן לשגות מורחבים מוגבלת על ידי מספר הגורמים. היכולת להבחין להיסחף לעומת תנועת נדידה של מדגם תלויה בסמנים הסלולריים בשימוש. סמנים נייד שהם גם הביעו נרחב בתוך מדגם או אינם מעורבים באירועים נודדים במהלך רכישת תמונה לספק את המקור הטוב ביותר לתיקון להיסחף. התוסף משתמש בערוץ אחד כדי לרשום את התנועה בין נקודות זמן ולאחר מכן חל רישום זה לכל הערוצים של התמונה שנאסף. לכן, זה עשוי להיות יתרון לשימוש בשני סמני ניאון בדגימות של עניין. סמן אחת עבור התאים או מבנים שיהיה תחת מעקב וסמן שני, למבני תווית שאינם צפויים להעביר מלבד להיסחף במהלך הניסוי. רישום יכול להתנהל על מערכי נתונים עם ערוץ אחד, אבל אם כל כך המכריע של הנתוני דואר צריכים להיות נייחים בתמונה עם רק חלק קטן צפוי לעבור. אם חלק גדול של התמונה נע בין נקודות זמן שהתנועה תתוקן ל, בנוסף לכל להיסחף, וכתוצאה מכך לירידה בתנועה המדודה.
הפרוטוקול המבוסס בכתב יד זה מבוסס על ההנחה שאין תנועה בין המקטע האופטי הראשון והאחרון של כל נקודת זמן בודדת. לא ניתן לתקן לסחיפה שעלולה להתרחש בתוך זמן נקודה אחת מבלי לעשות הנחות לגבי הצורה של האובייקט שנסרק. באופן אידיאלי הפרמטרים הניסיוניים המשמשים לאיסוף תמונה יגבילו את הפוטנציאל לתנועה להתרחש בתוך כל נקודת זמן בשבי. כך את הזמן שנדרש כדי ללכוד את התמונה ברצף צריך להיות קצר ככל האפשר. הזמן הכולל של רכישת זמן נקודה אחת צריך להיות חלק קטן של המרווח בין נקודות זמן.
שיטת מתאם השלב, שבומהווה את הבסיס של ההליך, קובע את התרגום הנדרש כדי ליישר נקודת זמן אחת עם השנייה. תנועות translational חשוב לציין רק מתוקנות וללכן סיבוב סביב כל אחד מהצירים (x, y, z) לא יתוקן. עבור רבים מהגורמים האפשריים לסחף, כגון נדידת המוקדים, וריאציה עמדת במה, תרגום יהיה מושלם לתאר את התנועה. עם זאת, אם תנועת המדגם כוללת סיבוב תרגום לא תוכל לתאר את התיקון הדרוש. שלב המתאם עדיין יאפשר העמדות דומות ביותר שיקבעו ולנצל את התרגום הטוב ביותר, וכתוצאה מכך שיפור מסוים ברישום, אבל אם היו מתודולוגיות חלופי רוטציה משמעותיות המאפשרות את השימוש בציוני הדרך בתמונה, יהיה מתאים יותר.
התוספת תוכננה לעבוד עם ערימות וירטואליות המאפשרות הצפייה והרישום של קבצים גדולים יותר הזיכרון זמין. קבצים הם ריאהד מדיסק כפי שנדרש לצורך הניתוח והתוצאות של הרישום נשמר בדיסק כתמונה ברצף, ולא קובץ תמונה בודד. זה מאפשר שימוש במחשב עם פחות זיכרון RAM מהגודל הכולל של ערכת הנתונים, בגודל המקסימאלי של בסיס הנתונים במקום להיות מוגבל על ידי השטח הפנוי בדיסק הקשיח. כמו בכל פעם נקודה מיושרת עם זמן הנקודה שלאחר מכן המחשב חייב להיות מספיק זיכרון פנוי כדי לפתוח שתי נקודות זמן ולהשלים את ניתוח מתאם שלב. היכולת לבצע רישום מתקדם ומדגם ניתוח תיקון באמצעות תוכנה זמינה באופן חופשי, במערכות עם משאבים מוגבלים, פותחת את היכולת של שלאחר עיבוד מתוחכם לקהל רחב הרבה יותר מדעי.
שתארנו את השימוש בפרוטוקול כדי לתקן סחיפה במערכי נתוני confocal דג הזברה אבל הגישה יכולה להיות מיושמת על תוצאות המתקבלות באמצעות כל סוג של מדגם או מערכת ההדמיה 3D. כתוצאה מכך בעתיד בטכניקה זו גם יכולה להיותpplied למערכי נתונים שהושגו באמצעות הדמיה בתהודה מגנטית, טומוגרפיה הקרנה אופטית, טומוגרפיה ממוחשבת של x-ray, ומיקרוסקופיה גיליון אור, וטכניקות הדמיה המתעוררות אחרות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.
Acknowledgments
ברצוננו להודות גבי מרטינס ומארגני סדנת EMBO2010 3D התפתחותית ההדמיה שבו עבודה זו החלה ואת כל התורמים לפרויקטי פיג'י וImageJ.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate (Tricaine) | Sigma-Aldrich | A5040 | |
| Low gelling temperature agarose | Sigma-Aldrich | A9414-25G | |
| Dumont #4 Forceps | Electron Microscopy Sciences | 0208-4-PO | |
| Disposable 3 ml graduated | Samco | 212 | |
| Polyethylene transfer pipette | |||
| 9cm bacterial grade Petri dishes | Greiner Bio One | 632180 | |
| Fluorinated ethylene propylene (FEP) tubing | Bola | S1815-04 | |
| Zeiss LSM-710 Confocal microscope | Zeiss | ||
| W Plan-Apochromat 20x/1.0 DIC Objective | Zeiss | 421452-9600-000 |
References
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Abramoff, M. D., Magalhaes, P. J., Ram, S. J. Image Processing with ImageJ. Biophotonics International. 11 (7), 42-42 (2004).
- Collins, T. J. ImageJ for Microscopy. BioTechniques. 43 (S1), 25-30 (2007).
- Linkert, M., et al. Metadata matters: access to image data in the real world. The Journal of Cell Biology. 189 (5), 777-782 (2010).
- Thévenaz, P., Ruttimann, U. E., Unser, M. A pyramid approach to subpixel registration based on intensity. IEEE transactions on image processing : a publication of the IEEE Signal Processing Society. 7 (1), 27-41 (1998).
- Kuglin, C. D., Hines, D. C. The phase correlation image alignment method. Proceedings of the IEEE, International Conference on Cybernetics and Society. , 163-165 (1975).
- Preibisch, S., Saalfeld, S., Tomancak, P. Globally optimal stitching of tiled 3D microscopic image acquisitions. Bioinformatics. 25 (11), Oxford, England. 1463-1465 (2009).
- Kaufmann, A., Mickoleit, M., Weber, M., Huisken, J. Multilayer mounting enables long-term imaging of zebrafish development in a light sheet microscope. Development. 139 (17), Cambridge, England. 3242-3247 (2012).
- Andersen, E., Asuri, N., Clay, M., Halloran, M. Live imaging of cell motility and actin cytoskeleton of individual neurons and neural crest cells in zebrafish embryos. J VIs. Exp. (36), (2010).
- Eisenhoffer, G. T., Rosenblatt, J. Live imaging of cell extrusion from the epidermis of developing zebrafish. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (52), (2011).
- Benard, E. L., vander Sar, A. M., Ellett, F., Lieschke, G. J., Spaink, H. P., Meijer, A. H. Infection of zebrafish embryos with intracellular bacterial pathogens. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (61), (2012).
- Nguyen-Chi, M. E., et al. Morphogenesis and Cell Fate Determination within the Adaxial Cell Equivalence Group of the Zebrafish Myotome. PLoS Genetics. 8 (10), (2012).
- Moore, C. A., Parkin, C. A., Bidet, Y., Ingham, P. W. A role for the Myoblast city homologues Dock1 and Dock5 and the adaptor proteins Crk and Crk-like in zebrafish myoblast fusion. Development. 134 (17), Cambridge, England. 3145-3153 (2007).
- Higashijima, S., Okamoto, H., Ueno, N., Hotta, Y., Eguchi, G. High-frequency generation of transgenic zebrafish which reliably express GFP in whole muscles or the whole body by using promoters of zebrafish origin. Developmental Biology. 192 (2), 289-299 (1997).
