Summary
시간 경과 현미경은 개발 프로세스의 시각화를 할 수 있습니다. 화상 취득 동안에 성장 또는 샘플의 드리프트가 정확하게 따르고 개발 중에 세포의 움직임을 측정하는 능력을 감소시킨다. 우리는 시간에 따른 입체 샘플 드리프트 보정하기 위해 오픈 소스 이미지 처리 소프트웨어를 사용하는 방법을 설명한다.
Abstract
사차원 (4D) 공 초점 데이터 세트의 생성; 시간이 지남에 따라 3D 이미지 시퀀스로 구성된; 발달 과정에 관여 세포의 동작을 캡처 할 수있는 훌륭한 방법을 제공합니다. 세포의 움직임을 추적하고, 수행하는 기능은 화상 획득 동안에 샘플의 드리프트 또는 어떤 경우에는 증가로 인해 발생하는 샘플의 움직임에 의해 제한된다. 드리프트 및 / 또는 성장에 의해 영향을받는 데이터 세트에서 추적 셀은 셀 위치의 분석으로이 운동을 통합 할 것입니다. 이 샘플 내에서 정적 구조의 명백한 움직임의 원인이 될 수 있습니다. 따라서 이전의 세포 추적에 대한 모든 샘플 드리프트 수정해야합니다. ImageJ에 2,3의 오픈 소스 피지 분배 (1)과 통합 궤적 도구 4를 사용하여, 우리는 공 초점 데이터 세트에서 잘못된 샘플의 움직임을 제거 할 수있는 올바른 3D 드리프트 플러그인을 개발했다. 이 프로토콜은 효율적으로 초점 포에 샘플 번역 또는 변경에 대한 보상연장 된 시간 경과 실험을 통해 세포의 움직임을 시각화하고 측정하는 능력을 유지하면서 사차원 촛점 데이터 세트마다 포인트를 등록하는 단계 상관을 이용함으로써 구성비.
Introduction
공 촛점 이미징 널리 형태의 세포의 움직임과 변화를 따라 세포 및 발달 생물학에 사용됩니다. 다른 초점면에 광학 섹션의 일련 캡처 허용 후 3D 데이터 세트의 시간 경과 시리즈를 생성하여 네 차원 (4D)으로 확장 될 수있는 샘플의 3 차원 (3D) 모델의 생성. 4D 데이터 세트의 생성은 세포의 움직임과 행동의 상세한 측정을 할 수 있습니다. 장기간의 시간 경과 실험에서는 샘플의 움직임을 관찰하는 것이 일반적입니다. 이는 하드웨어 제어 단계와 초점 위치에서 약간의 부정확으로 인해 발생할 수 있습니다. 다른 사람의 경우, 드리프트 샘플 장착 미디어 내에서 샘플 성장과 유연성에 의해 유도 된 운동의 결과이지만. 방법은 하드웨어를 중심으로 시스템을 개선하고 설치 매체의 증가 강성 등의 이러한 움직임을 보상하거나 제한하기 위해 존재한다. 그러나, 이러한 접근법에 의한 촬상으로의 많은 경우에 적용 할 수 없다등 최대 샘플 유지 보수 및 성장에 적합한 조건을 제공해야합니다. 오픈 소스 소프트웨어 솔루션은 ImageJ에 또는 피지 StackReg 및 TurboReg (http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/stackreg/) 5 플러그인을 사용하여, 시간이 지남에 따라 2 차원 운동의 보정을 위해 존재하지만, 이들은 수 없습니다 4D 데이터 세트에 적용 할.
샘플의 드리프트를 교정하기 위해 우리는 오픈 소스 영상 처리 플랫폼, 피지 1을 활용하는 플러그인 (올바른 3D 드리프트)를 개발했습니다. 우리의 플러그인은 입체 시간 경과 실험 샘플 드리프트의 결과로서 발생하는 움직임을 보정하기 위해 위상 상관 등록을 수행 할 수있다. 위상 상관 관계 (6) 이미지 사이의 변환을 결정하는 계산 효율적인 방법입니다. 여기에 설명 플러그인 Preibisch 외. (7)에 의해 개발 된 위상 - 상관 라이브러리를 이용한다. 멀티 채널 실험에서, 플러그인은 determi에 하나의 채널을 이용필요한 보정 NE. 이 보정은 다음 4D 데이터 세트의 등록 결과 추가적인 채널에 적용된다.
제브라 피쉬 모델 시스템에서 많은 시간, 심지어 며칠 8의 기간 동안 시간 경과 촬상을 행할 수있다. 제브라 피쉬를 장착하기위한 일반적인 방법은 운동 9-11을 제한, 저 융점 아가 로스 (0.8 ~ 1.5 %)에서 마취 라이브 배아를 포함하는 것입니다. 이동이 규제되는 동안 샘플의 성장이 정지 한 위치를 이동 시야 내의 세포의 결과 발생한다. 배아에서 세포의 이동을 수행하기 위해 먼저 전체 샘플의 움직임을 보정 할 필요가있다. 이 프로토콜은 제브라 시험편으로 개발되었고, 화상 체절 개발 (12)에 이용되었지만 어떠한 4D 촛점 집합에 적용될 수있다.
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Protocol
1. 4D 시간 경과 이미징 실험
화상 획득을 위해 사용되는 설정은 사용되는 장비에 따라 달라질 것이다. 여기, 핀홀 크기, 대물의 개구, 시료의 굴절률과 시료가 내장 된 매체의 파장 : 광학 부 샘플 공 초점 현미경의 능력은 여러 가지 요인에 의존한다. 선택된 공 촛점 핀홀 사이즈 채집 광학 부재의 두께를 결정한다. 작은 핀홀이 얇은 광학적 부분 z 축 해상도를 증가하지만 캡처 빛의 양을 감소를 일으킬 것이다. 큰 핀홀이 Z 축 해상도를 감소하지만 캡처되는 광량을 증가 광학 부재의 두께를 증가시킬 것이다.
이전의 교정에 4D 데이터를 수집하는 동안 고려해야 할 추가 요소는 다음과 같습니다 :
- D를 제거하거나 제한 표류 스캔 속도를 최적화단일 시간 지점의 캡처를 uring. 따라서 이미지 수집을위한 시간은 시간 점 사이의 간격의 작은 분획이어야한다.
- 그것은 필요한 보정을 확인할 수는 없습니다로 완벽하게 반복 구조, 또는 그리드, 등록을위한 구조로서 적합하지 않다. 무작위로 배포 구슬 또는 고르지 구조는 모호 등록을 허용합니다.
- 드리프트가 예상되는 경우, 그 영역은 화상 스택 내에 남아 있도록하기 위해 스캐닝 영역과 상하 초점 한계를 증가시킨다.
- 확보에 더하여, 그 구조를 해결 연구되고 동적 이벤트의 시간 해상도를 제공하기 위해 샘플링 레이트를 설정하기위한 적절한 공간 해상도가있다.
참고 : 이미지의 시간 점 사이의 시간 따라서 정기적으로 반복 이벤트 사이의 최소 절반 시간 간격하고 불규칙한 이벤트를 감소해야한다.
2. 공 촛점 D 열기ataset
오픈 소스 패키지 피지 현미경 실험에서 수집 된 데이터를 다수의 프로세스를 수행하기위한 사전 설치된 플러그인을 포함하는 ImageJ에 프로그램의 분포입니다. 소프트웨어는 쉽게 플러그인 업데이트 아키텍처를 제공하고,이 프로토콜에 사용되는 정확한 3D 드리프트 플러그인의 복사본을 포함한다. 이 소프트웨어는 오픈 현미경 환경의 바이오 형식의 가져 오기 플러그인의 사용을 통해 독점 현미경 이미지 포맷의 광대 한 배열의 가져 오기를 지원합니다.
- 피지 프로그램을 설치합니다 (http://fiji.sc/Downloads).
- 궤적 바이오 형식 가져 오기 플러그인을 사용하여 획득 한 데이터 집합을로드합니다.
- 데이터 세트는 프로그램에 할당 된 메모리보다 큰 경우, 메모리 관리부 내에 "사용하는 가상 스택 옵션"을 선택한다.
3. 후 처리에 3D 개체의 드리프트 보정
오랜 시간이 경과하는 과정에서임베디드 때에도 샘플 이동할 수 실험. 어떤 움직임을 보정하고 묘화 이주 이벤트를 분석 할 수 있도록, 화상의 후 처리가 수행 될 수있다. 모든 이미지 후 처리는 명확하게이 작품에서 파생 된 분석의 방법에서 기술되어야한다.
- 데이터 집합이로드되면, 올바른 3D 드리프트 플러그인을 실행합니다.
- 여러 콘텐츠 채널이있는 경우, 이미지를 등록하는 데 사용되는 채널을 선택한다. 이 이상적으로 오히려 어떤 철새 나 모바일 요소보다 샘플 내에서 정적 구조를 표현한다. 이것이 가능하지 않은 경우, 최소한의 움직임 채널 선택해야합니다.
- 이 분석에 사용되는 시스템에서 사용 가능한 RAM 원래 데이터 세트의 적은 배 이상의 크기 인 경우, 사용하는 가상 스택 옵션을 선택한다. 이는 오히려 RAM으로 파일을 저장하는 것보다 화상 시퀀스로서 등록 hyperstack를 저장할 것이다.
- 출력 각각에 플러그인의 폴더를 선택합니다 - 지금 수정GES 파일. 별도의 이미지 파일은 각 Z 위치에서 각 채널에 대해 생성됩니다.
- 플러그인은 다음 데이터 집합에 적용되는 필요한 보정을 결정하기 위해 각 시간 점 사이의 쌍대 위상 상관 관계 분석을 실시한다.
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Representative Results
13 - 개발 제브라 피쉬에서 빠른 근육 세포는 19시간 후 수정 (체절 단계 20)에서 다핵 섬유로 융합. 핵의 움직임과 우리가 근육의 모든 레이블을하는 골격 α-액틴 프로모터의 통제하에 녹색 형광 단백질 (GFP)을 발현하는 형질 전환 균주를 사용하여 4D 공 촛점 시간 경과 이미징을 실시 근육 세포의 융합을 시각화하기 위해 전지 (14)과 mCherry이 핵을 레이블, 핵 이행 순서로 태그 적색 형광 단백질을 코딩 RNA를 주입했다. 주입 된 형질 전환 배아는 저 융점 아가로 오스 및 2 시간의 기간에 걸쳐 2.0 ㎛의 간격으로 20 분 간격으로 촬영 된 광 (71) 부분으로 구성된 이미지 시퀀스에 장착 하였다. 약 7 ㎛, 샘플 드리프트는 중첩 된 이미지의 (그림 1A)와 nucl의 명백한 움직임을 흔들림의 결과로, 시간 경과 실험의 과정을 통해 관찰되었다에이 시간에 (그림 1B). 플러그인의 응용 프로그램이 등록 된 이미지 시퀀스 (그림 1C 및 1D)의 결과로 볼 수있다.
그림 1. 프로토콜은 3 차원 공간에서 이미지 획득 근육 특정 GFP 식 (A) 및 mCherry (B)에 융합 된 핵 이행 수순을 나타내는 수정되지 않은 데이터 집합의 각 시점에서의 최대 돌기의 평균 투영 화상 중에 샘플 움직임을 정류한다. 이 운동의 정도는 근육 및 핵 융합을 추적 할 수있는 능력을 감소 시키며, GFP 화상의 치우침은 분명하다. 얻어진 보정 된 이미지는 데이터 집합의 등록을 설명하는, (C) 및 (D)에 나타낸다.
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Discussion
오랜 시간 경과 현미경 실험에서 파생 된 데이터 세트의 샘플 드리프트를 해결하기 위해 후 처리 소프트웨어를 사용하는 우리의 능력은 요인에 의해 제한됩니다. 샘플의 철새 이동 대 드리프트를 식별 할 수있는 기능은 사용 된 세포 마커에 따라 달라집니다. 어느 널리 샘플 내에서 표현이나 이미지 수집하는 동안 철새 이벤트에 관련되지 않은 세포 마커 드리프트 보정을위한 최고의 소스를 제공합니다. 플러그인은 시간 포인트 간의 이동을 등록하는 단일 채널을 사용하고 수집 한 이미지의 모든 채널이 등록을 적용한다. 따라서, 그 샘플에서이 형광 마커를 사용하는 것이 유리할 수있다. 실험 기간 동안 떨어져 드리프트에서 이동 될 것으로 예상되지 않습니다 라벨 구조에 대한 하나의 추적 할 셀이나 구조에 대한 마커 및 제 표식. 등록은 하나의 채널 데이터 세트에서 수행 할 수 있지만, 만약 그렇다면 일의 대부분전자 데이터가 이동할 것으로 예상 단지 작은 비율로 이미지에 고정해야합니다. 화상의 큰 비율이 이동은 측정 된 움직임의 감소의 결과로, 어떤 드리프트 외에, 보정 될 시간 점 사이에서 이동하는 경우.
이 원고에 설립 프로토콜은 움직임이 각각의 시간 점의 첫 번째와 마지막 광학 부 사이가없는 것으로 간주합니다. 이 스캔되는 물체의 형상과 같은 가정을하지 않고 단일 시간 시점에서 발생할 수 드리프트를 보정하는 것은 불가능하다. 이상적으로 이미지 수집을 위해 사용되는 실험 매개 변수는 움직임이 포착마다 포인트 내에서 발생하는 가능성을 제한하는 것입니다. 따라서 이미지 시퀀스를 캡처하는 데 걸리는 시간은 가능한 한 짧아야한다. 단일 타임 포인트 수집의 총 시간은 시간 점 사이의 간격의 작은 분획이어야한다.
위상 상관 법, 어느절차의 기초를 형성한다 다음으로 한 번 포인트를 정렬하는 데 필요한 변환을 결정한다. 중요한 것은 단지 병진 운동에 대해 보정되고, 따라서 축 (x, y, z)의 주변 주위는 정정되지 않을 것이다. 이러한 초점 드리프트, 스테이지 위치 변화로 드리프트의 가능한 원인의 많은 경우, 번역은 완벽 움직임을 설명 할 것이다. 샘플 운동이 회전을 포함하는 경우에는 번역에 필요한 보정을 설명 할 수 없습니다. 위상 - 상관이 여전히 가장 유사한 위치가 결정될 수 있도록 등록의 일부 개선 결과, 최고의 번역을 활용하지만, 화상의 랜드 마크의 사용을 허용 상당한 회전 대체 방법론이 있다면, 더 적당 할 것이다.
이 플러그인은 사용 가능한 메모리보다 파일의보기 및 등록이 큰 수 있도록 가상 스택과 함께 작동하도록 설계되었습니다. 파일 REA 있습니다분석 오히려 단일 이미지 파일보다 이미지 시퀀스로서 디스크에 저장 등록 결과를 위해 요구되는 디스크 D. 이것은 데이터 세트의 전체 크기보다 더 적은 RAM 가진 컴퓨터의 사용은, 데이터 집합의 최대 크기가 대신 제공되는 하드 디스크 공간에 의해 제한되고 있습니다. 마다 포인트가 이후의 시간 지점과 정렬로 컴퓨터가 두 시간이 지점을 열고 위상 상관 관계 분석을 완료하는 데 사용할 수있는 충분한 메모리가 있어야합니다. 한정된 자원을 사용하는 시스템에 자유롭게 사용할 수있는 소프트웨어를 사용하여 고급 등록 및 샘플 정정 분석을 수행 할 수있는 능력은, 훨씬 더 넓은 과학적 청중에게 정교한 후 처리의 능력을 연다.
우리는 제브라 촛점 데이터 세트에서 드리프트를 수정하기위한 프로토콜의 사용을 설명했지만 접근법은 모든 샘플의 분류 또는 3D 이미징 시스템을 사용하여 얻은 결과에 적용될 수있다. 미래에 따라서이 기술은 또한 수 있었다자기 공명 영상, 광학 투영 단층 엑스레이 컴퓨터 단층 촬영 및 광 시트 현미경 및 기타 새로운 이미징 기술을 사용하여 얻은 데이터 세트에 pplied.
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Disclosures
저자는 더 경쟁 재정적 이익이 없다는 것을 선언합니다.
Acknowledgments
우리는 가비 마틴이 작업을 시작하고 피지와 ImageJ에 프로젝트 참여자의 모든 EMBO2010 3D 발달 이미징 워크숍의 주최자에게 감사의 말씀을 전합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate (Tricaine) | Sigma-Aldrich | A5040 | |
| Low gelling temperature agarose | Sigma-Aldrich | A9414-25G | |
| Dumont #4 Forceps | Electron Microscopy Sciences | 0208-4-PO | |
| Disposable 3 ml graduated | Samco | 212 | |
| Polyethylene transfer pipette | |||
| 9cm bacterial grade Petri dishes | Greiner Bio One | 632180 | |
| Fluorinated ethylene propylene (FEP) tubing | Bola | S1815-04 | |
| Zeiss LSM-710 Confocal microscope | Zeiss | ||
| W Plan-Apochromat 20x/1.0 DIC Objective | Zeiss | 421452-9600-000 |
References
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