Summary
Microscopie time-lapse permet la visualisation des processus de développement. La croissance ou la dérive d'échantillons lors de l'acquisition d'image réduit la capacité de suivre et de mesurer les mouvements de cellules au cours du développement de précision. Nous décrivons l'utilisation de logiciels open source de traitement d'image pour corriger la dérive en trois dimensions de l'échantillon au cours du temps.
Abstract
La génération de quatre dimensions (4D) ensembles de données confocale; constitué de séquences d'images 3D au fil du temps; fournit une excellente méthode pour capturer les comportements cellulaires impliqués dans les processus de développement. La capacité de suivre et de suivre les mouvements cellulaires est limitée par les mouvements échantillons qui se produisent en raison de la dérive de l'échantillon ou, dans certains cas, la croissance lors de l'acquisition de l'image. Cellules de suivi dans des ensembles de données touchées par la dérive et / ou la croissance sera d'intégrer ces mouvements dans toute analyse de la position de la cellule. Cela peut entraîner le mouvement apparent de structures statiques au sein de l'échantillon. Donc avant de suivi de la cellule, toute dérive de l'échantillon doit être corrigée. Utilisation de l'open source Fidji répartition 1 de 2,3 ImageJ et les outils de LOCI incorporés 4, nous avons développé la 3D correcte dérive plug-in pour supprimer le mouvement de l'échantillon erroné dans les ensembles de données confocale. Ce protocole compense efficacement traduction de l'échantillon ou des modifications de po focaltion en utilisant la corrélation de phase d'enregistrer chaque point de temps d'un à quatre dimensions des ensembles de données confocale tout en conservant la possibilité de visualiser et mesurer les mouvements cellulaires sur de longues expériences time-lapse.
Introduction
L'imagerie confocale est largement utilisé en biologie cellulaire et du développement de suivre les mouvements et les changements de cellules de morphologie. Capture d'une série de sections optiques à différents plans focaux permet la génération d'un modèle en trois dimensions (3D) d'un échantillon, qui peut ensuite être étendue à quatre dimensions (4D) en créant une série time-lapse d'ensembles de données 3D. La génération d'ensembles de données 4D permet la mesure détaillée des mouvements et des comportements cellulaires. Dans les expériences time-lapse à long terme, il est fréquent d'observer le mouvement de l'échantillon. Cela peut être causé par de légères imprécisions dans la phase de contrôle de matériel et positions focales. Alors que dans les autres cas, la dérive est une suite de mouvements provoqués par la croissance de l'échantillon ou de la flexibilité dans le support de montage de l'échantillon. Il existe des méthodes pour compenser ou de limiter ces mouvements, y compris des améliorations aux systèmes de focalisation de matériel et une rigidité accrue du milieu de montage. Cependant, ces approches ne peuvent pas être appliqués dans de nombreux cas en raison de la formation d'image set jusqu'à tenu de fournir des conditions adéquates pour le maintien des échantillons et de la croissance. Solutions logicielles open source existent pour la correction de mouvement en 2D au fil du temps, grâce à l'utilisation des StackReg et TurboReg (http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/stackreg/) 5 plugins dans ImageJ ou Fidji, mais ceux-ci ne peuvent pas être appliquée à des ensembles de données 4D.
Pour corriger la dérive de l'échantillon, nous avons développé un plug-in (dérive Corriger 3D) d'utiliser la plate-forme open-source de traitement de l'imagerie, Fidji 1. Notre plug-in est capable d'effectuer l'enregistrement de corrélation de phase pour corriger le mouvement qui se produit en raison de la dérive de l'échantillon en trois dimensions expériences time-lapse. Corrélation de phase 6 est une méthode efficace de calcul pour déterminer la traduction entre les images. Le plug-in décrit ici utilise la bibliothèque de corrélation de phase développé par Preibisch et al. 7. Dans des expériences multi-canal, le plug-in utilise un canal de déterminationne la correction nécessaire. Cette correction est ensuite appliquée à tous les canaux supplémentaires résultant de l'enregistrement de l'ensemble de données 4D.
Dans le système de modèle de poisson-zèbre, il est possible de procéder à l'imagerie time-lapse sur une période de plusieurs heures, voire plusieurs jours 8. Une méthode commune pour le montage du poisson zèbre est d'intégrer l'embryon vivant anesthésié en agarose à bas point de fusion (0,8-1,5%), de limiter son mouvement 9-11. La croissance de l'échantillon tandis que le mouvement est restreint se produit encore, ce qui entraîne dans les cellules à l'intérieur du champ de vue de la position de décalage. Afin de suivre le déplacement des cellules à l'intérieur de l'embryon, il est nécessaire d'abord pour corriger le mouvement de l'ensemble de l'échantillon. Ce protocole a été élaboré avec des échantillons de poisson zèbre, et a été utilisée pour le développement d'image de somites 12 mais peut être appliquée à n'importe quel ensemble de données 4D confocale.
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Protocol
1. 4D time-lapse expériences d'imagerie
Les paramètres utilisés pour l'acquisition d'image diffèrent en fonction de l'équipement utilisé. La capacité de la microscopie confocale à section optique d'un échantillon dépend d'un certain nombre de facteurs: la longueur d'onde d'excitation, la taille de trou d'épingle, l'ouverture numérique de l'objectif, l'indice de réfraction de l'échantillon et du milieu dans lequel l'échantillon est noyé. La taille du trou d'épingle confocal sélectionné va déterminer l'épaisseur de la coupe optique collecté. Un petit trou d'épingle produira une section plus mince optique d'augmenter la résolution de l'axe z, mais en réduisant la quantité de lumière captée. Un trou d'épingle supérieure, augmenter l'épaisseur de la partie optique, ce qui réduit la résolution de l'axe z mais en augmentant la quantité de lumière captée.
D'autres facteurs à prendre en considération lors de la collecte de données 4D avant correction comprennent:
- Optimiser la vitesse de balayage de supprimer ou de limiter la dérive du cours de la capture d'un seul point dans le temps. Par conséquent, le temps nécessaire pour que la collection d'images devrait être une petite fraction de l'intervalle entre les points de temps.
- Structures parfaitement récurrents, ou de grilles, ne sont pas appropriés en tant que structures d'enregistrement car il n'est pas possible de déterminer la correction nécessaire. Perles au hasard distribués ou structures inégales permettront enregistrement sans ambiguïté.
- Si la dérive est prévu, d'augmenter la surface de balayage et de réflexion limites supérieure et inférieure afin d'assurer la zone d'intérêt à l'intérieur de la pile reste de l'image.
- En plus d'assurer qu'il ya une résolution spatiale appropriée pour résoudre les structures d'intérêt, régler le taux d'échantillonnage pour fournir une résolution temporelle pour les événements dynamiques à l'étude.
Remarque: Le temps entre l'image points de temps doit donc être au moins la moitié l'intervalle de temps entre les événements réguliers de répétition et diminuer pour les événements irréguliers.
2. Ouverture de la confocale Dataset
Le package open source Fidji est une distribution du programme ImageJ, qui contient des plug-ins pré-installés pour effectuer de nombreux processus sur les données recueillies à partir des expériences de microscopie. Le logiciel fournit plus facile la mise à jour de l'architecture de plug-in et inclut une copie de la 3D dérive plug-in correct utilisé pour ce protocole. Le logiciel prend en charge l'importation d'un vaste éventail de propriétaires formats d'image de microscopie grâce à l'utilisation de Bio-formats importation plug-in de l'environnement ouvert de microscopie.
- Installez le programme Fidji (http://fiji.sc/Downloads).
- Chargez le jeu de données acquises à l'aide de l'importateur Plugin LOCI Bio-formats.
- Si l'ensemble est plus grand que la mémoire allouée au programme, sélectionnez l'option "pile virtuelle utilisation" dans la section de gestion de la mémoire.
3. Correction dérive d'un objet 3D en post-traitement
Au cours d'un laps de temps prolongéexpérimenter un échantillon peut se déplacer, même lorsqu'il est incorporé. Pour corriger tout mouvement et de permettre aux événements de migration imagées à analyser, le post-traitement des images peut être effectuée. Tout traitement d'image de poste doit être clairement décrit dans la méthodologie d'une analyse tirée de ce travail.
- Une fois l'ensemble de données a été chargé, exécutez la correcte plugin dérive 3D.
- S'il existe plusieurs canaux d'image, sélectionnez le canal à utiliser pour enregistrer les images. Cela devrait idéalement représenter une structure statique dans l'échantillon plutôt que des éléments migratoires ou mobiles. Toutefois, si cela n'est pas possible avec le canal moins le mouvement doit être choisi.
- Si la RAM disponible sur le système utilisé pour cette analyse est inférieure à deux fois la taille de l'ensemble de données d'origine, sélectionnez l'option de pile virtuelle d'utilisation. Cela stocker le HyperStack enregistré comme une séquence d'images, plutôt que d'enregistrer le fichier à la RAM.
- Sélectionnez un dossier pour le plug-in de sortie individuelle corrigé imafichiers ges. Un fichier image séparé sera créé pour chaque canal à chaque position z.
- Le plugin sera ensuite procéder à une analyse de corrélation de phase paires entre chaque point de temps pour déterminer la correction requise qui est ensuite appliquée à l'ensemble de données.
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Representative Results
Dans le poisson zèbre en développement, les cellules musculaires rapides fusionnent en fibres multinucléées à partir de 19 heures après la fécondation (20 - stade somites) 13. Afin de visualiser le mouvement des noyaux et la fusion des cellules musculaires que nous avons menées 4D imagerie confocale time-lapse en utilisant une souche transgénique qui exprime la protéine fluorescente verte (GFP) sous le contrôle du promoteur α-actine squelettique d'étiqueter tous les muscles les cellules 14 et injecté de l'ARN codant pour la protéine fluorescente rouge mCherry étiqueté avec une séquence de localisation nucléaire, pour marquer les noyaux. Embryons transgéniques injectées ont été montés dans le point de fusion bas agarose et une séquence d'image constituée de 71 sections optiques capturées à 2,0 um intervalles toutes les 20 minutes sur une période de temps deux heures. dérive de l'échantillon d'environ 7 pm a été observée au cours de l'expérience time-lapse, résultant dans le flou des images qui se chevauchent (figure 1A) et le mouvement apparent du nuclei au fil du temps (figure 1B). Application du greffon peut être vue d'aboutir à une séquence d'images enregistrée (figures 1C et 1D).
Figure 1: Le protocole rectifie mouvement de l'échantillon lors de l'acquisition de l'image dans l'espace en trois dimensions l'image moyenne de projection de projections maximales de chaque point de l'ensemble de données non corrigées montrant l'expression musculaire spécifique de la GFP (A) et la séquence de localisation nucléaire fusionné à mCherry (B) temps.. L'ampleur de ce mouvement permet de réduire la capacité de suivre les noyaux musculaires et fusion, et de flou de l'image de la GFP est évidente. Les images corrigées obtenues sont présentées dans (C) et (D), ce qui démontre l'enregistrement de l'ensemble de données.
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Discussion
Notre capacité à utiliser un logiciel de post-traitement pour corriger la dérive échantillon d'ensembles de données provenant de longues expériences de microscopie time-lapse est limitée par un certain nombre de facteurs. La capacité de discerner la dérive par rapport à un mouvement migratoire d'un échantillon dépend des marqueurs cellulaires utilisés. Les marqueurs cellulaires qui sont soit largement exprimés dans un échantillon ou ne sont pas impliqués dans les événements migrateurs lors de l'acquisition d'image offrent la meilleure source pour la correction de la dérive. Le plugin utilise un seul canal à enregistrer le mouvement entre les points dans le temps et s'applique cet enregistrement de tous les canaux de l'image recueillie. Par conséquent, il peut être avantageux d'utiliser deux marqueurs fluorescents dans les échantillons d'intérêt. Un marqueur pour les cellules ou les structures qui seront suivis et un second marqueur, aux structures d'étiquettes qui ne sont pas susceptibles de migrer en dehors de la dérive pendant l'expérience. L'enregistrement peut être effectué sur des ensembles de données avec un seul canal, mais si c'est le cas la plupart des edonnées électroniques doivent être stationnaire dans l'image avec seulement une petite proportion attendue de se déplacer. Si une grande partie de l'image se déplace entre les points de temps que le mouvement sera corrigée pour, en plus de toute dérive, résultant en une réduction de la circulation mesurée.
Le protocole établi dans ce manuscrit suppose qu'il n'y a pas de mouvement entre la première et la dernière section optique de chaque point dans le temps individuel. Il n'est pas possible de corriger la dérive qui peut se produire dans un seul point dans le temps sans faire des hypothèses quant à la forme de l'objet en cours de numérisation. Les paramètres expérimentaux utilisés pour la collecte d'image Idéalement limiteraient les possibilités de déplacement pour se produire au sein de chaque point dans le temps capturé. Ainsi, le temps pris pour capturer la séquence d'images doit être aussi court que possible. Le temps total d'une acquisition unique point de temps devrait être une petite fraction de l'intervalle entre les points de temps.
La méthode de corrélation de phase, quiforme la base de la procédure, détermine la traduction requise pour aligner une fois avec le point suivant. Il est important que des mouvements de translation sont corrigées, et donc pour la rotation autour de l'axe tout (x, y, z) ne seront pas corrigées. Pour la plupart des causes possibles de la dérive, tels que la dérive focale, variation de la position de l'étape, une traduction sera parfaitement décrire le mouvement. Cependant, si le mouvement de l'échantillon comprend la rotation d'une traduction ne sera pas en mesure de décrire la correction nécessaire. La corrélation de phase permettra toujours les positions les plus similaires à déterminer et utiliser la meilleure traduction, ce qui entraîne une certaine amélioration de l'enregistrement, mais s'il y avait d'importantes rotation alternatifs méthodologies permettant l'utilisation de points de repère dans l'image, serait plus approprié.
Le plug-in a été conçu pour fonctionner avec des piles virtuelles permettant la visualisation et l'enregistrement des fichiers de plus de la mémoire disponible. Les fichiers sont read de disque nécessaire pour l'analyse et les résultats de l'enregistrement enregistré sur le disque comme une séquence d'images, plutôt que d'un seul fichier image. Ceci permet l'utilisation d'un ordinateur avec moins de mémoire vive que la taille totale de l'ensemble de données, la taille maximale de l'ensemble de données au lieu d'être limité par l'espace disque disponible. Comme à chaque fois de point est aligné avec le temps-point suivant de l'ordinateur doit avoir suffisamment de mémoire pour ouvrir deux points de temps et de compléter l'analyse de corrélation de phase. La possibilité d'effectuer l'enregistrement et l'analyse avancées de correction de l'échantillon en utilisant un logiciel disponible gratuitement, sur des systèmes avec des ressources limitées, ouvre la possibilité de post-traitement sophistiqué à un public scientifique beaucoup plus large.
Nous avons décrit l'utilisation du protocole de corriger la dérive dans les ensembles de données confocale poisson zèbre, mais l'approche peut être appliquée aux résultats obtenus en utilisant n'importe quel type d'échantillon ou d'un système d'imagerie 3D. En conséquence dans l'avenir de cette technique peut aussi être unpplied aux ensembles de données obtenus en utilisant l'imagerie par résonance magnétique, tomographie à projection optique, x-ray tomographie par ordinateur, et la microscopie nappe de lumière, et d'autres techniques émergentes d'imagerie.
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Disclosures
Les auteurs déclarent qu'ils n'ont aucun intérêt financier concurrents.
Acknowledgments
Nous tenons à remercier Gaby Martins et les organisateurs de l'atelier EMBO2010 3D Imaging développement où ce travail a commencé et tous les contributeurs aux projets Fidji et ImageJ.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate (Tricaine) | Sigma-Aldrich | A5040 | |
| Low gelling temperature agarose | Sigma-Aldrich | A9414-25G | |
| Dumont #4 Forceps | Electron Microscopy Sciences | 0208-4-PO | |
| Disposable 3 ml graduated | Samco | 212 | |
| Polyethylene transfer pipette | |||
| 9cm bacterial grade Petri dishes | Greiner Bio One | 632180 | |
| Fluorinated ethylene propylene (FEP) tubing | Bola | S1815-04 | |
| Zeiss LSM-710 Confocal microscope | Zeiss | ||
| W Plan-Apochromat 20x/1.0 DIC Objective | Zeiss | 421452-9600-000 |
References
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