Summary
タイムラプス顕微鏡は、発生過程の可視化を可能にする。画像取得中に成長または試料のドリフトが正確に従うと開発中の細胞の動きを測定する能力を低下させる。我々は、時間をかけて、三次元試料ドリフトを補正するためのオープンソースの画像処理ソフトウェアの使用を記載している。
Abstract
4次元（4D）、共焦点データセットの生成;時間をかけて3D画像配列からなる;発生過程に関与する細胞の挙動をキャプチャするための優れた方法論を提供します。細胞の動きを追跡し、追跡する能力は、画像取得時に試料又は、場合によっては、成長中に発生するドリフトによる試料の移動によって制限される。ドリフトおよび/または増殖の影響を受けたデータセットで追跡する細胞は、細胞の位置の任意の分析にこれらの動きを組み込む。これは、サンプル内の静的な構造の見かけの動きになることがあります。そのため前細胞追跡するには、任意のサンプルドリフトを修正する必要があります。 ImageJの2,3のオープンソースフィジー分布1と組み込まれた遺伝子座のツール4を使用して、我々は、共焦点データセットに誤ったサンプルの動きを削除するために正しい3Dドリフトプラグインを開発しました。このプロトコルは、効果的に焦点POのサンプル翻訳や変更を補正長時間経過実験にわたって細胞の動きを視覚化し、測定する能力を維持しながら、四次元共焦点データセットの各時点を登録するために、位相相関を利用してsition。
Introduction
共焦点イメージングは広く形態の細胞の動きや変化に追従するために、細胞および発生生物学で使用されています。異なる焦点面で光一連のセクションをキャプチャすることができ、次いで、3Dデータセットの経時系列を作成することにより、四次元（4D）に拡張することができ、試料の3次元（3D）モデルを生成する。 4Dデータセットの生成は細胞の動きや行動の詳細な測定を可能にします。長期経時実験では、試料の動きを観察することが一般的である。これは、ハードウェア制御の段階と焦点位置のわずかな不正確によって引き起こされる場合があります。他の例では、ドリフトは、サンプルの取り付けメディア内のサンプルの伸びや柔軟性によって誘発される運動の結果ですが。方法はシステムを中心に、ハードウェアの改善を含め、これらの動きを補正するか、制限するために存在し、封入剤の剛性を増加させた。しかしながら、これらのアプローチは、撮像sに多くの場合には適用できないらアップサンプルの維持および増殖に適した条件を提供するために必要。オープンソースのソフトウェア·ソリューションは、ImageJのか、フィジーでSTACKREGとTurboReg（http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/stackreg/）5プラグインを使用することで、時間をかけて、2次元の動きを補正するために存在しないが、これらはできない4Dデータセットに適用される。
サンプルドリフトを補正するために、我々はオープンソースの画像処理プラットフォーム、フィジー1を利用するプラグイン（正しい3Dドリフト）を開発した。我々のプラグインは、三次元の時間経過実験において、試料ドリフトの結果として生じる動きを補正する位相相関の登録を行うことができる。位相相関6は、画像間の変換を決定するための計算上効率的な方法である。プラグインは、ここで説明するには、Preibisch らが開発した位相相関ライブラリを利用しています。7。マルチチャンネル実験において、プラグインはdetermiに一つのチャンネルを利用する必要な補正ね。この補正は、次いで、4Dデータセットの登録をもたらす任意の追加のチャネルに適用される。
ゼブラフィッシュモデル系において、多くの時間、あるいは数日の期間にわたって8タイムラプス撮影を行うことができる。ゼブラフィッシュを取り付けるための一般的な方法は、その動きを規制9-11、低融点アガロース（0.8から1.5パーセント）で麻酔し、ライブ胚を埋め込 むことである。移動が規制されながら、試料の成長が依然として位置をずらす視野内の細胞を生じ、発生した。胚内の細胞の移動に追従するためには、まず、試料全体の動きを補正することが必要である。このプロトコルは、ゼブラフィッシュの標本で現像し、画像12体節の開発に利用されているが、任意の共焦点4Dデータセットに適用することができる。
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Protocol
1。4Dタイムラプスイメージング実験
画像取得のために使用される設定は、使用する機器に応じて異なります。励起波長、ピンホールサイズ、対物レンズの開口数、サンプルが埋め込まれたサンプルおよび媒体の屈折率：光学部の共焦点顕微鏡の能力試料は、多数の要因に依存する。選択された共焦点ピンホールのサイズは、収集された光学部の厚さを決定する。小さなピンホールは、より薄い光学部のz軸の解像度を増加させるしかし、捕捉された光の量を減少を生じる。大きいピンホールは、z軸の解像度を低減しかし捕捉された光の量を増加させる、光学部の厚さを増加させる。
補正前の4Dデータの収集の際に考慮すべき追加的な要因は次のとおりです。
- 削除するには、スキャン速度を最適化する、または制限、Dドリフトシングル時点の捕獲をuring。そこで画像収集にかかる時間は、タイム点の間隔のごく一部である必要があります。
- それは、必要な補正を決定することは不可能であるように、完全に反復構造又は格子は、登録のための構造体として適していない。ランダムに分布ビーズや凹凸構造が明確な登録ができるようになります。
- ドリフトが予想される場合、関心領域は、画像スタック内に留まる確実にするために、走査領域と上下フォーカスリミットを増加させる。
- 確保に加えて、関心対象の構造を解決するため研究されて動的イベントに対する時間分解能を提供するためにサンプリングレートを設定するための適切な空間分解能がある。
注意：画像の時点間の時間がありますので定期的な繰り返しイベントの間に、少なくとも半分の時間間隔も不規則なイベントのために減少するはずである。
2。共焦点Dを開くataset
オープンソースパッケージフィジーは顕微鏡実験から収集されたデータに多数のプロセスを実行するために事前にインストールされているプラグインが含まれているImageJのプログラム、の分布である。このソフトウェアは簡単にプラグインの更新アーキテクチャを提供し、正しい3Dドリフトプラグインは、このプロトコルで使用のコピーが含まれています。ソフトウェアはオープン顕微鏡環境のバイオフォーマットのインポートプラグインを使用することにより、独自の顕微鏡画像フォーマットの広大な配列のインポートをサポートしています。
- フィジーのプログラムをインストール（http://fiji.sc/Downloads）。
- LOCIバイオフォーマットインポータープラグインを使用して取得したデータセットをロードします。
- データセットは、プログラムに割り当てられたメモリよりも大きい場合は、メモリ管理部内の「使用する仮想スタックオプション」を選択します。
3。後処理で3Dオブジェクトのドリフトを補正する
長時間タイムラプスの過程埋め込まれた場合でも、試料が移動することが実験する。任意の動きを補正し、撮像されたマイグレーション·イベントを分析できるように、画像の後処理を行うことができる。すべての画像後処理は明らかに、この作品から派生した分析の方法論で説明しなければならない。
- データセットがロードされると、正しい3Dドリフトプラグインを実行します。
- 複数の画像チャネルがある場合、画像を登録するために使用するチャンネルを選択する。これは理想的ではなく任意の渡り鳥やモバイル要素よりサンプル内の静的な構造を表している必要があります。これが不可能な場合は、少なくとも運動のチャネルが選択されるべきである。
- この分析に使用されるシステムで使用可能なRAMが元のデータセットの倍未満のサイズであれば、使用する仮想スタック]オプションを選択します。これは、画像シーケンスとしてではなく、RAMにファイルを保存するよりも、登録されhyperstackを格納します。
- 出力にプラグイン用のフォルダを選択し、個々のIMA修正GESファイル。個別の画像ファイルは、各z位置において各チャンネル毎に作成される。
- プラグインは次いで、データセットに適用される必要な補正を決定するために、各時点の間のペアワイズ位相相関分析を行う。
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Representative Results
13 -開発ゼブラフィッシュでは、速筋細胞は19時間後に受精（節期20）から多核繊維に融合。核の動き、我々は筋肉の全てを標識するために、骨格α-アクチンプロモーターの制御下で緑色蛍光タンパク質（GFP）で表現したトランスジェニック株を用いて4D共焦点タイムラプス撮影を行った筋細胞との融合を可視化するためにセル14とmCherryが核を標識するために、核局在化配列でタグ付け赤色蛍光タンパク質をコードするRNAを注入した。注入されたトランスジェニック胚を低融点アガロースおよび2時間の期間にわたって2.0μmの間隔を20分毎に71で撮像光学切片からなる画像シーケンスにマウントした。約7ミクロンのサンプルドリフトが重なった画像（ 図1A）およびNUCLの見かけの動きのブレで、その結果、タイムラプス実験の過程で観察された時間をかけてEI（ 図1B）。プラグインの適用は、登録された画像シーケンス（ 図1Cおよび1D）をもたらすことが分かる。
図1：プロトコルは、三次元空間での画像取得筋特異的GFP発現（A）およびmCherry（B）に融合した核局在化配列を示す未補正データセットの各時点からの最大突出部の平均投影画像中のサンプルの移動を整流する 。この移動の程度は、筋肉核との融合を追跡する能力を低下させ、GFP画像のボケが明らかである。得られた補正された画像は、データセットの登録を実証し、（C）及び（D）に示されている。
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Discussion
拡張タイムラプス顕微鏡実験に由来するデータセットのサンプルのドリフトを補正するために後処理ソフトウェアを使用する我々の能力は、多くの要因によって制限される。サンプルの渡り鳥の移動に対するドリフトを識別する能力は、使用される細胞マーカーに依存している。どちら広くサンプル内で発現しているか、画像取得中回遊イベントに関与していない細胞マーカーは、ドリフト補正のための最高のソースを提供。プラグインは、時点間の移動を登録する単一のチャネルを使用してから収集された画像のすべてのチャネルにこの登録を適用します。したがって、関心のあるサンプル中の二つの蛍光マーカーを使用することが有利であり得る。実験中に離れてドリフト拡散すると予想されていない構造を標識する細胞や構造物に追跡され、第二のマーカー用のマーカー。登録は番目の大部分は、単一のチャネルでのデータセットではなく、もしそうであれば行うことができるEデータを移動することが期待ごく一部の画像で静止しなければなりません。画像の大部分は、運動が測定された運動の低下をもたらす、任意のドリフトに加えて、補正されるであろう時点との間に移動した場合。
本稿では確立されたプロトコルは動きが、個々の時点の最初と最後の光学部との間に存在しないことを前提としています。これは、スキャンされているオブジェクトの形状に関して仮定を行うことなく、単一の時点内で発生する可能性がドリフトを補正することはできません。理想的には画像収集のために使用される実験パラメータは、キャプチャされ、各時点内で発生する動きの可能性を制限することになる。このように画像シーケンスをキャプチャするのに要する時間はできるだけ短くすべきである。単一の時間ポイント集録の合計時間は、タイム点の間隔のごく一部である必要があります。
位相相関法、その手順の基礎を形成し、[次へ]で1時点を揃えるために必要な変換を決定します。重要なことにのみ並進運動が補正されるので、軸（x、y、z）の任意のまわりの回転が補正されない。このような焦点ドリフト、ステージ位置の変動としてドリフトの原因の多くは、翻訳が完全に動作を説明する。サンプルの動きは回転が含まれている場合ただし、翻訳が必要な修正を記述することができません。位相相関は依然として最も類似する位置を決定することを可能にし、登録中にいくつかの改善をもたらす、最高の翻訳を利用するが、画像中のランドマークの使用を可能にする重要な回転代替的な方法論があった場合に、より適しているであろう。
プラグインは、使用可能なメモリを超えるサイズのファイルの閲覧と登録を可能に仮想スタックで動作するように設計されています。ファイルはREAですディスクからdの分析に必要と登録の結果は、画像シーケンスではなく、単一の画像ファイルとしてディスクに保存されている。これは、データ·セットの合計サイズより小さいのRAMを搭載したコンピュータの使用は、データセットの最大サイズは代わりにハードディスク空き容量によって制限されることができます。各時点で、その後の時点と整列するようにコンピュータが2時点を開き、位相相関分析を完了するための十分なメモリを持っている必要があります。限られた資源を持つシステム上で、自由に利用できるソフトウェアを使用して事前登録し、サンプル補正分析を実行する機能は、より広い科学的な聴衆に洗練された後処理の能力を開きます。
我々は、ゼブラフィッシュ共焦データセット内のドリフトを補正するためのプロトコルの使用を記載しているが、手法は、任意の試料の種類や3D撮像システムを用いて得られた結果に適用することができる。将来的にはその結果、この技術はまた、可能性が磁気共鳴画像法、光学投影断層撮影法、X線コンピュータ断層撮影、及び光学シート顕微鏡法、および他の新興のイメージング技術を用いて得られたデータセットにpplied。
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Disclosures
著者は、彼らが競合する経済的利益を持っていないことを宣言します。
Acknowledgments
私たちは、ギャビー·マルティンスと、この作品が始まったとフィジーとImageJのプロジェクトへの貢献者のすべてEMBO2010 3D発達イメージングワークショップの主催者に感謝したいと思います。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate (Tricaine) | Sigma-Aldrich | A5040 | |
| Low gelling temperature agarose | Sigma-Aldrich | A9414-25G | |
| Dumont #4 Forceps | Electron Microscopy Sciences | 0208-4-PO | |
| Disposable 3 ml graduated | Samco | 212 | |
| Polyethylene transfer pipette | |||
| 9cm bacterial grade Petri dishes | Greiner Bio One | 632180 | |
| Fluorinated ethylene propylene (FEP) tubing | Bola | S1815-04 | |
| Zeiss LSM-710 Confocal microscope | Zeiss | ||
| W Plan-Apochromat 20x/1.0 DIC Objective | Zeiss | 421452-9600-000 |
References
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