Vi etablerade en fluorescent in situ hybridisering protokoll för detektion av en ihållande DNA-virusgenom i vävnadssnitt från djurmodeller. Detta protokoll möjliggör att studera infektionsprocessen genom codetection av det virala genomet, dess RNA-produkter, och virala eller cellulära proteiner i enstaka celler.
Single cell codetection av en gen, är dess RNA-produkt och cellulära regulatoriska proteiner kritiska för att studera genuttryck reglering. Detta är en utmaning inom virologi, särskilt för kärnrepliker ihållande DNA-virus som involverar djurmodeller för deras studie. Herpes simplex virus typ 1 (HSV-1) fastställs en livslång latent infektion i perifera nervceller. Latent virus fungerar som reservoar, från vilken den reaktiverar och framkallar en ny herpetic episod. Den cellbiologi av HSV-1 latens fortfarande dåligt kända, delvis på grund av att det saknas metoder för att påvisa HSV-1-genom in situ i djurmodeller. Vi beskriver en DNA-fluorescent in situ hybridisering (FISH) tillvägagångssätt effektivt upptäcka låg-kopierings virala genom inom delar av neuronala vävnader från infekterade djurmodeller. Metoden bygger på värmebaserad antigen avslöjande, och direkt märkta hemgjorda DNA-prober, eller kommersiellt tillgängliga sonder. Vi utvecklade en trippel staining metod som kombinerar DNA-FISH med RNA-FISH och immunofluorescens, med hjälp av peroxidas baserad signalförstärkning för att tillgodose varje färgningsbehov. En stor förbättring är möjligheten att få, inom 10 um vävnadssnitt, låg-bakgrundssignaler som kan avbildas med hög upplösning genom konfokalmikroskopi och brett fält konventionell epifluorescence. Dessutom fungerade trippelfärgning med ett brett spektrum av antikroppar riktade mot cellulära och virala proteiner. Det kompletta protokollet tar 2,5 dagar att rymma antikropp och sond penetration i vävnaden.
Herpes simplex virus typ 1 (HSV-1) är en ihållande mänsklig neurotrop virus, upprättande av en långsiktig latent infektion i nervceller i trigeminala ganglier (TG) i det perifera nervsystemet, från vilket det aktiverar jämna mellanrum för att replikera och spridning. HSV-1-genomet är en 150 kb dsDNA Lokalisera i kärnan av den mottagande neuron där det förblir så multikopie chromatinized plasmider, som inte integreras i värdcellsgenomet 1,2. Under latens är HSV-1 replikativa cykeln genetiska programmet starkt undertryckt, och genuttryck begränsas till den latens-associerad transkript (LAT)-lokuset, från latens anläggning till initiering av reaktive 3. LAT producerar en lång 8,5 kb icke-kodande RNA bearbetas till en stor 2 kb stabil lariat, och flera miRNA 4-7. HSV-1 latens är således kännetecknas av närvaron av det virala genom-DNA, LAT-RNA, och frånvaro av detekterbara replikativa cykelproteiner.
ontent "> Djurmodeller, främst mus och kanin, är experimentella modeller rekapitulera flera funktioner i latens i människa. En av de viktigaste intressena för dessa modeller är att de tillåter att studera fysiologiska aspekter av HSV-1 latens i immunkompetenta värdar. Under de senaste decennierna , många experimentella verktyg, såsom genetiskt modifierade virus och möss, har utvecklats för att studera fysiologi, genetik och cellbiologi av HSV-1 latens, från djurvävnader. Hittills har virala genom-DNA detekteras och kvantifieras genom Southern blöt och qPCR från dissocierade TGs. Det finns dock för närvarande ingen metod tillgänglig för att påvisa HSV-1-genomet med in situ hybridisering på vävnadssnitt 8. Följaktligen latens rutinmässigt bedömts histologiska sektioner genom detektering av LAT RNA av RNA in situ hybridisering snarare än virusgenom upptäckt. Eftersom det har varit omöjligt att karakterisera infekterade celler baserat på förekomst av virusgenom, this teknisk begränsning har varit en stor nackdel för analysen av många aspekter av värd-virusinteraktioner, såsom förhållandet mellan det virala genomet och cellulär och viral genuttryck eller värdcellförmedlade immunsvar 9,10.Viktigast cell-till-cell heterogenitet av latent infektion är relativt outforskat och har visat sig vara en viktig del av latens i möss och i mänskliga sensoriska ganglieneuroner implanteras i SCID-möss 11-17. Typiskt visades det genom qPCR att HSV-1-genomet kopietal per cell varierar från 5 till flera hundra. Även LAT visas som en viktig regulator av latens och reaktivering, qPCR uppgifter om isolerade nervceller och in situ-PCR visade att endast en delmängd av latent infekterade nervceller, så lite som 30%, uttrycker LAT locus 11,12,18-21. Hur värdcellen och den cellulära miljön inuti vävnaden påverkar viruset latens upprättande ochviral genuttryck är fortfarande oklart. Här beskriver vi ett robust fluorescent in situ hybridisering (FISH) metod för effektiv detektion av låg-kopia HSV-1 iskt DNA inom djur neuronala vävnadssnitt. Denna metod har utformats och används av oss för att få tillgång till hög upplösning mikroskopi avbildning som är nödvändig för att studera interaktionen av det virala genomet med värdcell inom nukleära komponenter 22. Dessutom beskriver vi ett flertal färgningsmetod för samtidig detektion av det virala DNA: t med RNA och proteiner, vilket är ett unikt verktyg för att beskriva virus-värd interaktioner som reglerar viral genexpression. Metoden kan också användas för ett brett spektrum av analyser som kräver detektion av HSV-1 latenta genomet, till exempel kvantifiera smittade nervceller i stort antal avsnitt. Ett viktigt steg är att applicera antigenåtervinning behandling för att göra den virala DNA tillgängliga för hybridisering. Således kan detta protokoll också vara effektivt för att upptäckaav andra dsDNA virus, som för närvarande inte upptäckas med konventionella DNA-FISH metoder inom djurvävnader.
Protokollet som beskrivs här medger detektion av HSV-1 latent genomet inom neuroner i mus neuronala vävnadssektioner. Vår förståelse av de signalvägar som reglerar viral genuttryck har begränsats av bristen på metod för att påvisa HSV-1 iskt DNA på plats inom neuronala vävnader. Information om genomet kopior antal och andel infekterade nervceller kom främst från PCR-analys på dissocierade nervceller 11,12. Vid belysa rollen värd-cellkärnor arkitektur på HSV-1 latens, vi satt att bes…
The authors have nothing to disclose.
Vi tackar N. Sawtell (Cincinnati Childrens Hospital Medical Center, Cincinnati, Ohio, USA), S. Efstathiou (University of Cambridge, Storbritannien) och James Hill (LSU Health Sciences Center, New Orleans, USA) för att tillhandahålla prover från HSV-1 -infekterade möss och kaniner, respektive, och för reagens, H. Masumoto (Kazusa DNA Research Institute, Chiba, Japan) och S. Khochbin (Institut Albert Bonniot, Grenoble, Frankrike) för bra diskussioner.
Detta arbete har finansierats genom anslag från Centrum National de la Recherche Scientifique (CNRS) (ASPETS program, till PL, http://www.cnrs.fr), det franska nationella forskningsinstitut (ANR) (ANR-05-MIIM- 008-01, CENTROLAT, http://www.agencenationale-recherche.fr ), varvid FINOVI Foundation ( http://www.finovi.org/:fr:start ), varvid Labex DEVweCAN (ANR-10-LabX-61 ) av Université de Lyon, inom programmet "Investissements d'Avenir "(ANR-11-IDEX-0007) som drivs av ANR ( http://www.agence-nationale-recherche.fr ), l'Association pour la Recherche contre le Cancer (ARC-7979 och ARC- 4910, http://www.arc-cancer.net ), la Ligue Nationale Contre le Cancer (LNCC, http://www.ligue-cancer.net ) och Inca (EPIPRO programmet http://www.e -cancer.fr ). FC och PL är CNRS forskare.
Balb/c mice | Janvier, France | 6 week-old females | |
HSV-1 strains | SC16 strain (wild type) | See Labetoule, M. et al. (2003) Invest Ophthalmol Vis Sci 44: 217–225, for details on HSV-1 strain and virus stock preparation. | |
Ketamine hydrochloride | Sigma | K2753 | Intraperitoneal injection of a solution containing Ketamine (100mg/kg) and Xylazine (10mg/kg) |
Xylazine hydrochloride | Sigma | X1251 | |
Paraformaldehyde (PFA) | Sigma | 158127 | Suspend 4g of PFA in 90mL of water. Add 50µL of 1N NaOH, and heat at 60°C in a water bath with agitation. PFA dissolves in about 30min. Add 10mL of 10X PBS. This solution can be prepared in advance and stored at -20 °C in 5mL tubes. Caution. Manipulate under a fume hood. |
Physiological Saline | Sigma | 07982-100TAB-F | |
1X PBS, pH 7.4 (sterile) | Life Technologies | 10010-015 | |
Sucrose | Sigma | 84100 | Prepare a 20% sucrose solution in 1X PBS. |
Cryosectionning embedding medium – Tissue-Tek OCT Compound – | SAKURA | 4583 | |
Large vector DNA purification kit | Qiagen | 12462 | To purify Cosmid or BAC vector containing HSV-1 genome and store at -20°C |
Nick translation kit | Roche Applied Sciences | 10 976 776 001 | |
Cy3-dCTP | GE Healthcare | PA53021 | Protect from light |
0.5M EDTA | Sigma | E6758 | |
G50 Mini spin column | GE Healthcare | 27-5330-01 | |
Salmon sperm DNA 10mg/mL | Invitrogen / Life Technologies | 15632-011 | |
Ethanol molecular biology grade | Sigma | 87047 | Prepare a 70% solution |
Salmon sperm DNA | Invitrogen / Life Technologies | 15632-011 | |
Formamid Molecular biology grade | Sigma | F9037 | Caution. Manipulate under fume hood. |
HSV-1 biotinylated commercial probe | Enzo Life Sciences | ENZ-40838 | |
ImmEdge hydrophobic pen | Vector Laboratories | H-4000 | |
20X Saline Sodium Citrate (SSC) | Sigma | S6639 | Prepare a 2X SSC solution in ddH20. |
Triton X-100 | Sigma | T8787 | Prepare a 10% stock solution in water and store at +4°C. Prepare the 0.5% solution in 1X PBS right before use. |
10mM sodium citrate pH 6.0 | Sigma | S1804 | Prepare a 100mM stock solution (10X). Weigh 10,5g of citric acid (MW 210.14. Caution, irritant and toxic, wear appropriate mask and gloves), and dissolve in 400mL water. Adjust pH at 6.0 with 1N NaOH (caution, irritant, wear gloves). Adjust to 500mL with distilled water. Dilute 10 times in distilled water before use. |
Acetic Acid | Sigma | 320099 | |
Methanol, molecular biology grade | Sigma | 322415 | |
Dextran sulfate – MW 500 000 | Euromedex | EU0606-A | |
Denhardt's solution (100X) | Euromedex | 1020-A | |
Rubber Cement "FixoGum" | Marabut | 290110000 | |
DNA purification kit – Qiaquick PCR purification kit – | Qiagen | 28104 | |
T7 in vitro transcription kit | Ambion / Life Technologies | AM1314 | |
Biotin-16-UTP | Roche Applied Sciences | 11388908910 | |
RNA purification mini-column | Qiagen | 73404 | |
Ribonucleoside Vanadyl Complex | New England Biolabs | S1402S | |
H2O2 | Sigma | H3410 | Prepare a 3% solution in distilled water. Store at +4 °C and protect from light. |
Yeast tRNA | Invitrogen | 15401011 | prepare a 10mg/mL solution in RNAse free water |
Normal Goat Serum | Invitrogen | PCN5000 | |
Primary antibodies | Any supplier | The following primary antibodies were used in the result section: anti-mouse CENP-A (rabbit mAb C51A7, Cell Signaling Technologies), and anti-ATRX H-300 (Santa Cruz Biotechnology) | |
Secondary fluorescent antibodies | Invitrogen / Life Technologies | The fluorescent secondary antibodies routinely used in our protocol are AlexaFluor labeled goat antibodies (IgG H+L). The antibody used in the result section is an anti-rabbit goat antibody labaled with AlexaFluor 488 (reference A11001) | |
Tyramide Signal Amplification (TSA) kit – Streptavidin + AlexaFluor 350 (blue fluorescence) | Invitrogen / Life Technologies | #T20937 | TSA kits are also available from Perkin Elmer |
Tyramide Signal Amplification (TSA) kit – Streptavidin + AlexaFluor 488 (green fluorescence) | Invitrogen / Life Technologies | #T20932 | |
Hoechst 33342 | Invitrogen / Life Technologies | H3570 | Prepare a 0.5µg/mL solution in 1X PBS immediatly before use. Discard the remaining solution. |
22x50mm coverslip. n°1.5 glass. | Electron Microscopy Sciences | 72204-04 | |
Mounting medium with anti-fading agent – Vectashield – | Vector Laboratories | H-1000 | Another conventional product is Fluoromount G from electron microscopy Science |
Superfrost glass slides | FisherScientific | 12-550-15 | |
EQUIPMENT | |||
Equipment / material | Company | Reference | Note |
Needle for infection | Glass micropipette hot drawn. Home made. | ||
Dissection equipement | Moria, France | Microsurgical scissors and forceps | |
Peristaltic pump | Cole Palmer Instruments | Easyload Masterflex | |
Micro-syringe pump device (Nano Pump) | kdScientific | KDS310 | |
Cryostat | Leica France | CM 1510-1 | |
-80 °C freezer | Sanyo | Ultra Low -80°C | |
Domestic microwave oven | |||
Dry block heater | Eppendorf | 022670204 | |
Incubator Slide moat | Boekel Scientific | 240000 | |
Coplin Jar | Dominique Dutscher | 68512 | |
Staining glass container | Dominique Dutscher | 68506 | |
Fluorescent microscope | Zeiss | The images presented in the result section were collected with a Zeiss AxioObserver with objective x40 LD NeoFluor N.A 0.6, and x100 PlanApochromat N.A 1.3. Filter set #38, #43 and #43. HXP 120 fluorescence light source. Photometrics CoolSNAP HQ2 CCD camera. Signal will be more easily observed on a recent high efficiency microscope such as Zeiss AxioImager/AxioObserver series, Nikon Ti-E/Ni-E series or Leica DM/DMI6000 series |