Summary
우리는 여기에서 식물 단백질 복합체의 정제 및 특성에 대한 프로토콜을 설명합니다. 우리는 단지 내에 하나의 단백질을 immunoprecipitating에 의해, 그래서 우리는 그것의 번역 후 변형과 상호 작용하는 파트너를 식별 할 수있는 것을 보여줍니다.
Abstract
식물은 인식을 정교로 인한 환경 변화 및 시스템 신호에 신속하게 적응. 병원체 공격하는 동안, 식물이 빠르게 면역 복합체의 모집 및 활성화를 통해 감염에 반응한다. 면역 복합체의 활성화는 이러한 인산화, 당화, 또는 유비퀴틴 같은 단백질의 번역 후 변형 (PTMS)와 연결되어 있습니다. 이러한 PTMS가 안무하는 방법을 이해하는 것은 저항을 달성하는 방법의 더 나은 이해로 이어질 것입니다.
여기에서 우리는 염기 결합 류신이 풍부한 반복 (NB-LRR) - 상호 작용하는 단백질을 자신의 번역 후 변형 (PTMS)의 후속 식별을위한 단백질 정제 방법을 설명합니다. 작은 변형으로, 프로토콜은 다른 식물 단백질 복합체의 정제에 적용될 수있다. 이 방법은 이후에 부분적으로 정제 관심의 단백질, B의 에피토프 태그 버전의 표현을 기반으로Y의 면역과 상호 작용하는 단백질과 PTMS의 식별을위한 질량 분석을 실시.
이 프로토콜은 그 방법을 보여줍니다 : I). 이러한 인산화 등 PTMS의 동적 변경은 질량 분석법에 의해 검출 될 수 있으며, II). 그것은 또한 단백질의 충분한 양을 가지고, 이것은 면역 침전의 순도의 부족을 보상 할 수있는 것이 중요하다; III). 또한 단백질의 PTMS을 검출하기 위해,이 단백질은 단백질의 충분한 양을 얻을 면역 침전되어야한다.
Introduction
면역 경로를 신속하게 신호를 형질 도입 및 면역 반응 1을 활성화하는 단백질의 다양한 번역 후 변형 (PTMS)에 의존하고 있습니다. PTMS 단백질 형태, 활성, 안정성, 지역화 및 단백질 - 단백질 상호 작용에 영향을 미칠 수있는 2-4 단백질 구조의 급속한 리버시블, 높은 특정 화학 변화이다. 식물에서 PTMS의 300 개 이상의 종류가 유비퀴틴, sumoylation, 황산, 당화 및 인산화 2,5 등의 확인되었습니다. 증거의 성장 몸은 식물 면역 1,5,6의 다양한 측면에 PTMS의 중요성을 강조한다. 단백질 인산화는 세린에 인산염 그룹의 가역 첨부, 트레오닌 또는 티로신 잔류 물은 많은 세포 기능의 조절과 당연히 가장 높은 폭포에게 5-11 신호 식물 방어에 PTM을 공부했다. 인산화에 의존하는 신호는 식물 defe의 중요한 부분입니다NSE 활성화는 멀티 도메인 저항 단백질 5,8로 횡단 수용체에 의해 미생물의 세포인지, 또는 세포 내 인식 한 후 시작했습니다.
식물에 침입하면, 미생물은 패턴 인식 수용체 (PRRS) 12이라고 세포막 수용체에 의해 검출된다. 알려진 PRRS는 수용체와 같은 단백질 (RLPs) 또는 수용체 같은 키나제 (RLKs), 두 리간드 결합 ectodomain 들고와 싱글 패스 (single-pass) 횡단 도메인이 있습니다. RLPs 달리 RLKs는 세포 내 키나아제 도메인을 가지고 13-15. PRRS의 ectodomain는 RLKs의 경우, 세포 내 도메인 6, 16 내 인산화 및 transphosphorylation에, 병원체 - 관련 분자 패턴 (PAMPS) 선도라는 보존 된 미생물 elicitor 분자에 결합한다. PRRS의 인식에 의한 인산화의 하류, 키나제 (17)를 포함하여 세포질 단백질의 인산화 이후, 18 (P)는, E3 19 리가 제, 미토 겐 활성화 단백질 키나제 (MAPKs) 20, 21, 칼슘 - 의존성 단백질 키나제 (CDPK) PAMP 트리거 내성 (PTI) 22, 23, 전사 24 요인 25 리드.
PRRS에 의한 세포 인식 이외에, 병원체의 세포 인식은 세포질 수용체를 통해 달성된다. 이러한 멀티 도메인 저항 (R) 단백질이 변수 N-말단 도메인, 중앙 염기 결합 (NB) 모티브, 및 C-말단 류신 - 풍부 반복 (LRR)가 포함되어 있으므로 NB-LRR 단백질 (26, 27)라고. R 단백질이 직접 또는 간접적으로 또한 PRRS 및 면역 시스템의 다른 노드를 대상으로 공지 된 음향이라는 병원체 유래 독성 분자를 인식한다. 인식 이펙터 트리거 면역 (ETI) 28 ~ 31에 이르는 강력한 방어를 유도한다. NB-LRR 단백질은 requisi있을테 NB 도메인 (30, 32)에서 모티브를 ATP 결합하지만, 그들은 키나제 도메인이 부족합니다. NB-LRRs의 보존 된 도메인의 인산화는 대규모 프로테오믹스 조사 (33)에보고되었지만, ETI 대한 관련성은 명확하지 않다. 마찬가지로 PTI에, NB-LRR 단백질의 활성화는 MAPKs 34 ~ 37과 38 ~ 40 CDPKs 등의 세포질 단백질의 인산화에 이르게한다. 가장 중요한 것은, 음향 인식은 NB-LRR 단백질 (41)와 직접 상호 작용 액세서리 단백질의 인산화로 이어질 수 있습니다. 몇 가지 예는 NB-LRR 단백질과 상호 작용하는 단백질을 RIN4 (애기 장대)과 PTO (토마토, 까 lycopersicum)를 포함, RPM1 (42), (43)와 각각 같은 Prf 44. 모나스 syringae 세균에 의한 감염 동안, 이펙터 단백질 AvrB는 수용체 같은 키나제 RIPK (45)에 의해 대부분, RIN4 인산화를 유도
이러한 예는 이펙터의 인식 시점에 면역 복합체 구성 요소와 잠재적 PTMS의 식별 신호가 다운 스트림 대상에 이펙터 인식에서 형질 도입하는 방법의 더 나은 이해로 이어질 수 있다는 것을 보여줍니다. 여기에서 우리는 NB-LRR 상호 작용하는 단백질과 그들의 PTMS의 후속 식별을위한 단백질 정제 방법을 설명합니다. 우리 모델로는 담배 benthamiana 및 토마토 같은 Prf / PTO 착체를 사용하지만, 동일한 프로토콜 간단 N. RLKs에서 적용 할 수있다 benthamiana와 A. 작은 수정을 장대 (53) 우리는 프로토콜 내에서 기술하는.
Protocol
주 : 달리 명시하지 않는 한 모든 단계는 상온에서 수행됩니다.
1. 식물 재료 및 버퍼의 준비
- N.에 대한 benthamiana
- 아그로 박테 리움 (이 예에서는 PRF-FLAG, PRF-3xHA, PTO-FLAG 및 제어와 같은 빈 벡터) 28에서 액체 배양 (적절한 항생제 L 매체)에 (200 RPM)을 흔들어 일시적 발현에 대한 관심의 변종을 투메 파시 엔스 성장 고정상 때까지 C를 °.
- 수집하고 원심 분리 (5 분 3,000 XG)에 의해 아그로 박테리아 펠렛. 뜨는을 취소하고 침투 버퍼에 펠렛 아그로 박테리아를 재현 탁.
- 600 ㎚의 흡광도에서의 광학 밀도 (OD) 값 (ABS 600 NM)를 획득하여 아그로 박테리아의 양을 측정한다. 0.1 ~ 0.8에 박테리아의 OD를 조정합니다.
- 사주 오래된 N. 침투 한에 의한 아그로 박테리아와 benthamiana 공장 (22 ° C, 16 시간 등)(1 ㎖의 무 바늘 주사기) 또는 진공 (0.02 % V / V의 계면 활성제를 추가)로 D.
주 : 처음으로 거의 완전히 확장 잎을 사용하고, 가장 효과적인 단백질 발현에 대한 두 개의 즉시 오래된 잎. 유비퀴틴 또는 아세틸 화 단백질의 검출을 위해 100 nm의 MG-132 또는 100 NG / ML Trichostatin A, 각각 1에서 2 일째 침투와 잎에 침투. - 침투 잎 2~5일 후 침투와 액체 질소에 동결을 수확. -80 ° C 냉동고에 샘플을 저장합니다.
참고 : 미리 오일의 시간 과정을 통해 샘플을 채취하고 면역 블 롯팅에 의해 단백질 수준을 검출하여 그 단백질의 발현 수준을 결정 유용한.
- A.에 대한 장대 안정 유전자 변형 라인
- A. 성장 6 - 웰 플레이트에있는 장대 씨앗이 잘 당 액체 MS 배지 5 ㎖ (V 자당 / W 1 %)로 보충. 유전자 변형 라인의 다섯 씨앗 (살균 및 계층화)에 세 가지를 넣고관심이나 잘 당 변형되지 않은 제어 라인의. 성장 방에 접시를 전송하기 전에 이틀 동안 200 rpm으로 흔들어는 2 주 (22 ° C에서, 10 시간 등)에 둡니다.
- 수확 샘플 및 액체 질소에 동결.
참고 : 컨트롤로 관심의 단백질과 같은 태그로 관련이없는 단백질을 발현하는 형질 전환 라인을 사용할 수 있습니다.
- 버퍼
- 1 ~ 2 시간 동안 버퍼 A. 드 가스에게 버퍼를 준비합니다 (RLKs를 들어, 다른 막 결합 단백질과 핵 단백질, 1 %의 v / V의 IGEPAL CA-630 53 추가).
참고 : 무기한 4 ° C에서 버퍼를 유지할 수 있습니다. 당신은 트리톤 대신 IGEPAL CA-360 V / 1 % V를 사용할 수 있습니다. - 추출하기 전에 차가운 버퍼 B 적어도 1-2 시간의 80 ML을 준비합니다.
참고 : 추출 버퍼 대 조직의 이상적인 비율은 1:4 (W / V)입니다.
- 1 ~ 2 시간 동안 버퍼 A. 드 가스에게 버퍼를 준비합니다 (RLKs를 들어, 다른 막 결합 단백질과 핵 단백질, 1 %의 v / V의 IGEPAL CA-630 53 추가).
2. 단백질 추출
- 직전 추출에 찬 버퍼 C. 80 ML을 준비
- N. 20 g의 갈기 benthamiana 조직 (약 15 잎) 또는 A. 박격포와 유 봉을 사용하여 액체 질소에 장대 모종 (6 잘 플레이트 당 2~4g).
- 지상 조직의 20g에 찬 버퍼 C 80 mL를 넣고 잘 섞어 얼음에 해동.
참고 : 같은 시간 (이자 및 제어의 단백질)에서 모든 샘플을 갈기. - (4 ° C에서 prechilled) 조직의 균질화와 최고 속도로 10 초마다 3 버스트와 균질화. 4에서 30 분 동안 30,000 XG에 22 ~ 25 ㎛의 조직과 원심 분리기를 통해 필터 ° C.
참고 : 또한, 신선한 prechilled 박격포와 유 봉 균질화. - 선호도 행렬의 차단 및 세척 단계는 버퍼 D. 20 ㎖를 준비
- 4 ℃에서 5 분 동안 1 % BSA를 함유하는 냉각 버퍼 D 500 ㎖를 사용하여 적당한 친 화성 기질의 블록 100 ㎖ ° C.
참고 : 기본 AF를finity 행렬은 안티-FLAG M2 아가로 오스, 스트렙 타비 딘 아가로 오스, GFP-Trap_A 및 안티-HA 아가로 오스 (가) 있습니다. - 1 ㎖ 찬 버퍼 D. 씻을 배
- 얼음에 새 튜브에 0.45 μm의 주사기 필터를 통해 잎 추출물 및 필터의 상층 액을 제거합니다.
참고 : 추출 색깔은 녹색 또는 노란색이어야한다 샘플이 갈색 설정 한 경우, 삭제하고 다시 시작하십시오. - , 면역 블롯의 조 추출물의 분취 량을 5 배 SDS-PAGE 로딩 버퍼, 소용돌이를 추가하고 80 ~ 100에서 10 분 동안 끓는 샘플에 의해 변성 열 블록에 C를 °.
3. 단백질 면역 침전
- 두 개의 50 ㎖ 튜브에 단백질 추출물을 분할하고 각 튜브에 버퍼 D에 현탁 선호도 행렬의 50 μl를 추가합니다. 4 ℃에서 2 시간 동안 부드러운 회전을 품다
참고 : 긴 배양 수율을 증가 발견되지 않았습니다. - 에 추가하여 용출 버퍼 600 μL (친 화성 행렬의 6 배 비드 볼륨)를 준비버퍼 D (최종 농도) : 0.5 % BSA, (항-FLAG M2 아가를위한) 0.25 ㎎ / ㎖의 FLAG 펩티드 또는 (스트렙 타비 딘 아가를위한) 10 mM의 D-비오틴.
참고 : 용출은 GFP-Trap_A 및 안티-HA 행렬의 경우 사용하지 않는 것이 좋습니다, 그래서 1X SDS-PAGE 로딩 버퍼에 끓는 직접 진행, 3.11 단계. - 4 ° C (1,000 XG에서 5 분)에서 원심 분리하여 친 화성 기질을 침전.
- , 이뮤위한 언 바운드 추출물의 분액을 상청액의 나머지를 폐기, 튜브의 저부에 약 500 μl를두기.
- 넓은 구멍 팁 슬러리 용액을 재현 탁.
- 하나의 1.5 ML 튜브에 두 튜브의 혼합 슬러리 용액을 전송합니다.
참고 : 이제부터의 미세 튜브를 결합 1.5 ml의 낮은 단백질을 사용합니다. - 친 화성 기질을 침전 상층 액을 제거하는 벤치 탑 원심 분리기를 사용하여 5 초 동안 맥박 배.
- 세척 사이에 1 ㎖ 찬 버퍼 D.로 3 배 씻어 선호도 마트 리에게 침전X로 이전에 설명하고 상층 액을 버린다. 마지막 세척에 주사기의 바늘을 초과 버퍼 D를 제거합니다.
주 : 0.1 % IGEPAL와 버퍼 D를 사용하여, 최종 세척은 더 비특이적 결합을 감소시키기 위해 사용될 수있다. - 일정한 진탕 (항-FLAG M2 또는 스트렙 타비 딘 아가로 오스를 참조 단계 3.2) 적절한 용출 버퍼 200 μl의 3 배, 5 분으로 각각의 시간을 용출.
- 하나의 튜브에 3 용출액 해변. 흡수성 수지의 30 μl를 사용하여 단백질을 집중한다. 소용돌이, 5 분간 방치 수지 (10,000 XG에 2 분)을 침전 할 수 있습니다. 상층 액을 버린다.
참고 : GFP - Trap_A 및 안티-HA 아가로 오스를 들어, 단계 3.9와 3.10를 건너 뜁니다. - 침전 된 친 화성 기질 또는 흡수 수지에 1X SDS-PAGE 로딩 버퍼의 50 μl를 추가합니다. 80 ~ 10 분 동안 소용돌이 끓인다 열 블록에 C를 °.
- X g 만에 2 분 동안 삶은 친 화성 기질 또는 수지를 원심 분리기. supernatan의 나누어지는 5 μL면역 블롯을위한 T 및 ~ 10cm 길이 SDS-PAGE 겔 (그림 2)에 다른 분수를 실행합니다.
- 별도의 분리 (그림 2) 필요한 경우 질량 분석에 의한 분리 및 인산화 단백질의 식별을 위해, ~ 19 cm 길이 SDS-PAGE 겔에 나머지 45 μl를로드합니다.
주 : 빈 레인 시료의 오염을 감소시키기 위하여 모든 샘플 사이에 포함 할 수있다.
4. 단백질 소화
- 콜로이드 쿠마시 브릴리언트 블루 (CCBB) 얼룩 SDS-PAGE 젤 얼룩.
주 : 각질과 오염을 줄이기 위해 겔의 취급을 최소화. 장비 나 도구 중에 면역 블롯 또는 잔류 단백질 오염을 남아있는 수있는 다른 활동에 사용되지 않았 음을 확인합니다. - 물에 풍부한 세척, 바람직하게는 O / N.와 젤 Destain 깨끗한 면도날로 젤에서 관심의 밴드를 잘라.
주 : 면역 블롯과 젤을 맞 춥니 경우 necessa올바른 영역을 찾습니다 공예. 인산화는 SDS-PAGE에서 단백질의 이동을 지연시킬 수있는 바로 그 밴드의 위쪽과 아래쪽 영역을 잘라. - (이것은 젤 피펫 팁을 차단하지 않고 튜브의 솔루션에 포함되는 것을 보장) 2~4mm의 큐브로 겔 슬라이스를 주사위. 튜브에 넣습니다.
- 젤 잘 잠수를 유지하는 데 필요한 크기를 예측합니다. 유도체, 단백질 분해 효소와 펩타이드 추출과 배양이 금액을 사용하고 세탁 트리플 볼륨에 두 번을 사용합니다.
참고 : 일반적으로, 컷 젤 조각의 약 100 ㎕ 씩 소화 세탁을 500 μL 솔루션, 탈수 2 × 180 μL, 감소, 알킬화 120 μL, 소화 120 ㎕의 150 μl를 사용합니다. - (50 mM의 중탄산 암모늄, ABC의) 50 % 아세토 니트릴을 추가하여 젤 조각 2 X 20 분 (또는 탈 염색시킨까지)를 씻으십시오. 젤 조각을 제거하지 않도록주의하면서 솔루션을 피펫.
- 100 % 아세토와 탈수5 분 니트릴 무료 액체를 제거합니다.
참고 : 젤이 수축과 흰색 나타납니다. 파란색이 지속되면, 아세토 니트릴 / ABC 및 / 또는 높은 온도 (45 ~ 55 ℃)에서 더 이상 품어. - 물에 10 mM의 DTT를 첨가하여 단백질 이황화 결합을 감소 떨고으로 56 º C에서 30 ~ 45 분 동안 품어. 무료 액체를 제거합니다.
- 20 ~ 30 분 (실내 온도, 어두운)에 대한 (50 mM의 ABC에서) 55 밀리미터 클로로 아세트 아미드의 첨가에 의한 킬레이트 시스테인 잔기. 무료 액체를 제거합니다.
- (50 mM의 ABC에서) 50 % 아세토 니트릴로 젤 조각 2 × 10 분을 씻으십시오. 무료 액체를 제거합니다.
- 5 분 동안 100 % 아세토 니트릴로 젤 조각을 탈수 무료 액체를 제거합니다.
- 트립신의 경우, 소화 트립신 작업 용액 40 μL (소화 버퍼 트립신 100 NG : 50 mM의 ABC, 평균 매시 묻은 밴드 5 % 아세토 니트릴)를 추가합니다. 젤 조각을 10 분 동안 재수 할 수 있습니다. 필요한 경우 젤 조각을 충당하기 위해 소화 버퍼를 충분히 추가합니다. 37 º C에서 알을 품다O / N.
- 소화를 중지하고 젤 조각에서 펩타이드를 추출, 5 % 포름산 (50 % 아세토 니트릴) (소화 볼륨과 동일한 볼륨을 추가)를 추가합니다. 5 ~ 10 분 동안 초음파 처리. 새로운 튜브에 뜨는을 전송합니다. 추출 배를 반복합니다.
- 동결 건조 (권장) 또는 (예 : 속도-Vac 또는 학자 등) 진공 농축기에 의해 펩티드를 건조. -20 º C에서 저장
- 질량 분석을 위해 샘플을 제출합니다.
참고 : 우리는 세 인스 버리 연구소 (노리치, UK)에서 질량 분석 시설에 샘플을 제출했다. 질량 분석 시설에서 프로토콜은 상당히 다양하지만, 일반적으로 펩티드는 탠덤 질량 분석법을 스프레이보기 ELECTRO하도록 결합 된 액체 크로마토 그래피 시스템 상에 로딩하기 전에 2 % 아세토 니트릴과 0.2 % 트리 플루오로 아세트산에 용해 될 것이다.
Representative Results
우리는 안정적인 형질 전환 A.에서 태그 단백질의 정제를 위해 여기 프로토콜을 설명 장대 선 또는 N.에있는 단백질의 일시적 발현 후 benthamiana. 도 1에 나타낸 바와 같이 표적 단백질의 정제는 단백질과 상호 작용하는 표적 단백질의 PTMS의 식별을 허용하기 위하여 질량 분석계에 연결되어있다. 프로토콜은 식물 내성 및 그들의 PTMS의 식별에 관련된 단백질의 정제를 위해 설계되었지만 어떤 태그 식물 단백질의 정제에 적용될 수있다.
예를 들어 우리는 N.에서 같은 Prf / PTO 단지의 정화를 사용 benthamiana. 형질 전환 N. 35S을 표현 benthamiana 라인 38-12 (54) : PTO는 일시적 35S로 형질 전환 된 : PRF-FLAG하고 복잡한 안티-FLAG M2 아가로 오스 (그림 2A)로 면역 침전되었다. 그림 2A의 면역 블롯 (IB)대상 단백질 (같은 Prf)의 대부분이 면역 침전 된 것을 보여줍니다. PTO와 상호 작용하는 효과기 단백질 AvrPtoB는 같은 Prf로 copurified하고 (도 2A 및 2B) 항체 및 질량 분광 분석을 이용하여 검출 하였다. 은 AvrPto 및 35S : AvrPtoB (그림 2A)를 우리는 이펙터 35S를 구성과 함께 동시 발현 할 때 같은 Prf와 copurified PTO는 SDS-PAGE 젤에 느린 마이그레이션 것으로 나타났습니다. 두 이펙터 단백질은 PRF-상호 작용 PTO (그림 2A)의 느린 이동을 유도. 이 인산 (44)로 처리하여 제거 할 수 있기 때문에 PTO이 이펙터 인식 의존 느린 이주는 이전에 인산화에 기인했다. PTO의 느린 이동에 기여 인산화 사이트를 검출하기 위해, 우리는 질량 분광법 분석을 PRF copurifying PTO를 실시. PTO의 높은 발현과 면역 블롯과의 쉬운 탐지에도 불구하고 우리는 펩티드에게 C를 검색 할 수PTO 순서의 단지 57 %를 overing 우리는 어떤 인산화 사이트 (그림 2B)를 식별하는 데 실패했습니다.
그 후, 우리는 안티-FLAG. N.과 PTO 단백질을 표적으로하는 전략을 변경 PRF-3HA 및 35S : PTO-FLAG, 또는 35S없는 :은 AvrPto 및 35S : benthamiana WT 식물은 일시적 35S로 형질 전환 하였다. AvrPtoB PRF-복합체와 자유로운 형태를 모두 포함하는 PTO 단백질의 총량이 면역 침전했다 항-FLAG M2 아가로 오스와 SDS-PAGE 분별있는 젤 트립신 소화와 질량 분석 분석 (그림 2C)를 실시와 함께. 이 방법으로 우리는 순서의 약 80 %와 알 수없는 100 kDa의 단백질 상호 작용에 걸쳐 PTO 펩티드를 확인했다. 우리는 PTO 펩티드 187-202 및 188-202 (표 1)에 대한 단일 및 이중 인산화 사이트 집합을 확인했다. SER-198과 THR-199 주된 인산화 사이트 있지만, 다른 검사하고 있었다sphorylation 사이트도 검출되었다 (표 1). 빼앗아-198 및 THR-199에서 가장 중요한 두 인산화는 효과기 단백질 (표 1) 중 하나의 존재 확인되었다. 우리는 최근 PTO 인산화 사이트의 유사한 세트를 확인하고 47 신호에 대한 이중 인산화 이벤트의 중요성을 보여줍니다. 여기에 설명 된 프로토콜 다음 우리는 표적 단백질의 인산화 상태에서의 동적 변화를 식별 할 수 있었다.
그림 1. 일반 실험 설계. 표적 단백질 면역 (IP)에 대한이 일시적으로는 담배 benthamiana 또는 안정적으로 애기 장대에서, 란타에 태그를 표현한다. 단백질 추출에 따라표적 단백질은 친 화성 기질과 면역 침전된다. 단백질은 전기 영동으로 아크릴 아마이드 겔에서 분리된다. 젤 밴드는 절제되어있다. 단백질은 겔 밴드로부터 추출 및 질량 분석을 실시한다. 인산화 사이트와 상호 작용하는 단백질은 확인된다. 더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2. 같은 Prf 및 PTO의 면역. A). 구조 35S가 : PRF-FLAG가 일시적으로 38-12 라인 (35S : PTO)에 표현 된 빈 벡터 (EV)와 함께, 35S :은 AvrPto 또는 35S : AvrPtoB. 사흘 후 침투 같은 Prf는 항-FLAG 친 화성 기질을 사용하여 면역 침전되었다. 면역PRF : AvrPtoB과 PTO에 대한 noblots (IB)을 수행 하였다. PTO의 면역 블롯 패널의 맨 아래에있는 화살표가 가리키는 바와 같이,은 AvrPto 및 AvrPtoB)는 PTO. B의 느린 이동을 유도한다. 구조 35S가 : PRF-FLAG가 일시적으로 38-12 라인 (35S : PTO)에 표현 된 빈 벡터 (EV)와 함께, 35S :은 AvrPto 또는 35S : AvrPtoB. 사흘 후 침투 같은 Prf는 항-FLAG 아가로 오스를 사용하여 면역 침강 및 SDS-PAGE에서 분리 하였다. 젤 콜로이드 쿠마시 브릴리언트 블루 (CCBB)와 가시 같은 Prf로 염색하고, PTO 및 AvrPtoB 단백질 밴드는 겔에서 절제와 질량 분석기로 분석 하였다. 질량 분석에 의해 확인 PTO와 같은 Prf 시퀀스의 비율 펩타이드 범위가 표시됩니다. C를). 구조의 35S : PRF-3xHA 및 35S : PTO-FLAG는 일시적 35S와 함께 표현했다 : AvrPtoB, 35S :은 AvrPto 또는 N. 빈 벡터 (EV) benthamiana. 세 일 총 금액의 사후 침투PTO-FLAG는 아가 로스 안티 - 플래그를 사용하여 면역 침강 및 SDS-PAGE에 해결되었습니다. 가시 PTO 및 PTO-상호 작용 단백질 밴드는 겔로부터 절제 질량 분석법에 의해 분석 하였다. 같은 Prf가 (화살표로 표시된) 약간 덜 보이는 반면, PTO 및 100 kDa의 PTO 상호 작용하는 단백질 밴드, 콜로이드 쿠 매시 브릴리언트 블루 (CCBB) 스테인드 젤에 명확하게 볼 수 있습니다. IP : 면역 침전, IB : 면역 블롯, CBB : 쿠마시 브릴리언트 블루 염색, CCBB : 콜로이드 쿠마시 브릴리언트 블루 염색. 더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오.
| PRF | |||
| EV | 은 AvrPto | AvrPtoB | |
| PTO 펩타이드 188-202 | |||
| GTELDQ [P의 T 195] HLSTVVK | 1 | 0 | |
| GTELDQTHL [P의 S 198] TVVK | 10 | 7 | 5 |
| GTELDQTHLS [P의 T 199] VVK | 8 | 3 | 4 |
| G [P의 T 190] ELDQTHLS [P의 T 199] VVK | 0 | 1 | 2 |
| GTELDQTHL [P의 S 198] [P의 T 199] VVK | 0 | 8 | 4 |
| GTELDQTHLSTVVK | 46 | 26 | 48 |
| PTO 펩타이드 187-202 | |||
| KGTELDQ [P의 T 195] HLS TVVK에게 | 0 | 1 | 0 |
| KGTELDQTHL [P의 S 198] TVVK | 17 | 17 | 12 |
| KGTELDQTHLS [P의 T 199] VVK 4 | 2 | 2 | |
| KGTELDQ [P의 T 195] HLS [P의 T 199] VVK | 0 | 1 | 1 |
| KGTELDQTHL [P의 S 198] [P의 T 199] VVK | 0 | 7 | 5 |
| KGTELDQTHLSTVVK | 21 | 37 | 18 |
| 펩티드 187-202 및 188-202 | 83 | 88 | (50) |
| 두 인산화 이벤트와 펩티드의 비율 | 0 % | 26.9 % | 11.2 % |
| PTO 순서 적용 범위 | 78 % | 79 % | 82 % |
표 1 35S 신호의 활성화에 따라 PTO 펩타이드의 이중 인산화 :.. PRF-3xHA 및 35S를 : PTO-FLAG는 일시적으로 그들과 함께 표현했다PTY 벡터 (EV), 35S :은 AvrPto 또는 35S : N.에 AvrPtoB benthamiana. 사흘 후 침투 PTO-FLAG 단백질의 총량은 항-FLAG 친 화성 기질을 사용하여 면역 침강 및 SDS-PAGE에 해결되었습니다. 콜로이드 쿠 매시 화려한 푸른 스테인드 젤에 PTO의 가시 대역은 질량 분석기와 절제 분석 하였다. PTO를 0으로 식별 펩타이드, 1 및 2의 인산화 사건의 개수가 표시된다.
| 버퍼의 표 | ||
| L 매체 | 트립 톤 | 10g / L |
| 효모 추출물 | 5g / L | |
| 염화나트륨 | 5g / L | |
| D-글루코오스 | 1g / L | |
| 농업 침투 버퍼 | MgCl2를 | 10 mM의 |
| MES </ TD> | 10 mM의 | |
| pH를 5.5로 조정 | ||
| 아세토 시린 곤 (선택 사양) | 150 μM | |
| 버퍼 | 트리스 - 염산 pH를 7.5 | 150 밀리미터 |
| 염화나트륨 | 150 밀리미터 | |
| EDTA | 5 mM의 | |
| EGTA | 2 ㎜ | |
| 글리세린 | 5 % (V / V) | |
| 버퍼 B | 버퍼 | |
| PVPP | 2 % (W / V) | |
| 버퍼 C | 버퍼 B | |
| 디티 오 트레이 톨 (DTT) | 10 mM의 | |
| 식물 프로테아제 억제제 칵테일 | 1 % (V / V) | |
| 페닐 메틸 술 포닐 플루오 라이드 (PMSF) | 0.5 ㎜ | |
| 칼리 큐린 | 50 nM의 | |
| 불화 나트륨 (NaF로) | 50 mM의 | |
| 몰리브덴 산 나트륨 (나 2 무 4) | 10 mM의 | |
| 나트륨 오르토 바나 데이트 | 1 ㎜ | |
| Okadaic 산 | 100 nm의 | |
| 버퍼 D | 버퍼 C PVPP없이 | |
| 배 SDS-PAGE 로딩 버퍼 | 트리스 - 염산 pH를 6.8 | 60 mM의 |
| SDS | 2 % | |
| 글리세린 | 0.15 % | |
| 브로 모 페놀 블루 | 0.10 % | |
| DTT (사용 직전에 추가) | 50 mM의 |
표 2. 버퍼와 미디어 조리법.
Discussion
PAMPS과 음향에 의해 수용체 활성화의 메커니즘을 해명하는 식물 면역에 대한 우리의 이해에 크게 기여할 수있다. 지난 20 년 동안, 유전과 효모 두 하이브리드 화면은 PRRS와 NB-LRR 단백질의 발견을위한 수단이되고있다. 더 최근에, 질량 분석 기반 프로토콜은 55-58 시그널링 면역 그들의 PTMS 11,33,59,60 중에 차등 조절 단백질의 식별을 위해 설립 된, 면역 복합체 (61)와 음향의 조성물 (62)을 목표로한다. 여기에서 우리는 면역 복합체의 활성화를 조절 PTMS의 식별을위한 간단한 프로토콜을 설명합니다.
앞서 설명한 프로토콜과 비교하여, 프로토콜 PTMS의 동적 변화의 상세한 식별을 허용한다. 대규모 단백질 체학 접근 방식의 프로토콜은 단백질의 PTMS을 확인하지만 제한으로 인해 PTMS의 사이트 가소성을 공개 할 수없는 수ED는 단백질의 양은. 단백질 인산화의 경우, 대규모 프로테오믹스 접근법은 전형적으로 우세한 인산화 사이트 11,33,59 식별. 단백질 인산화 상태의 상세한 특성화는 목적 단백질의 정제 (47)의 부분을 통해 얻어 질 수있는 단백질의 상당한 양을 필요로한다. 프로토콜은 정제 된 단백질의 질량 분광법 분석으로, 커플 코코 표적 단백질의 상당한 양을 산출 단백질 정제 방법을 설명했다. 이 프로토콜에 따라, PTO의 단일 인산화 이벤트는 이전에 52 설명한대로 빼앗아-198에 주로 기인하지만, 일부 질량 분석 스펙트럼은 THR-195 또는 THR-199에 대한 하나의 인산화 이벤트를 지원했다. PTO의 이중 인산화 이벤트를 관찰 할 때 다른 사이트에 조합도 관찰되었다하더라도, 인산화 아미노산의 주된 조합 (SER-198과 THR-199이었다표 1). 이러한 결과는 명확 단백질 키나제의 인산화 사이트 가소성 및 세부에서 모든 가능한 인산화 사이트의 특성을 설명하는 프로토콜의 능력을 보여준다.
이 프로토콜의 가장 중요한 단계는 다음과 같습니다 : 단백질의 1) 충분한 추출, PTMS 2) 보호하고, 목적 단백질의 3) 충분한 양의. 우선, 단백질의 충분한 추출을 위해, 그것은 액체 질소에서 조직을 분쇄하고이어서 프로토콜에 설명 된대로 조직 균질화기를 사용하는 것이 중요하다. 조직의 균질화를 사용할 수없는 경우, 박격포와 유 봉 사용할 수 있습니다. 그것은 세 (또는 네) 추출 완충액 용적에 조직의 그램의 하나의 비를 사용하는 것 또한 중요하다. 비와 우리가 제안 고강도 버퍼를 버퍼링이 조직은 pH가 추출 과정 동안 중립 남아 있는지 확인한다. 우리는이 A.를 위해 특히 중요하다 발견 장대, 토마토 추가ctions 52. PTMS 보호는 모든 버퍼 PTMS를 제거하는 효소의 적절한 억제제에 포함시킴으로써 달성 될 수있다. 그것은 4 ° C에서 모든 단계를 수행하고 버퍼와 악기를 prechill하는 것이 중요합니다. 목적 단백질의 높은 수율은 충분한 양의 단백질을 발현하는 식물을 이용하여 조직 (약 20 g)의 많은 양을 사용함으로써 달성 될 수있다. 표적 단백질의 충분한 양을 획득하기위한 가장 중요한 단계는 직접 면역 침전에 의해 목적 단백질을 농축한다. 이 단계의 중요성으로 인해 coimmunoprecipitated PTO (그림 2B)의 제한된 양을 PRF 면역 후 PTO의 PTMS를 확인하는 우리의 실패에 의해 강조된다. 대조적으로, PTO의 직접적인 면역는 단백질 서열 및 PTMS (표 1)의 식별의 약 80 % 범위에 이르는 실질적으로 추가 측정 펩티드 (도 2c)를 수득 하였다. 우리는 또한 성rongly 단백질 면역에 대한 에피토프 태그의 사용을 추천합니다. 기본 단백질 에피토프 태그 친 화성 기질에 대해 제기 항체에 비해 부분적으로 정제 된 단백질의 높은 금액을 얻을 수 있습니다. 면역에 대한 기본 PTO 단백질 51 (그림 2A)에 대해 제기 항체를 사용하여, 우리는 PTO의 두 가지 주된 인산화 사이트의 단지 하나의 인산화를 식별 할 수 있었다.
이 프로토콜은 주로 N.의 부분 정제 개발되었다 benthamiana 세포질 단백질과 그들의 인산화 사이트의 후속 식별. 그러나, 본원에 기술 된 변형을 사용하여,이 프로토콜 A. 쉽게 적응 될 수있다 장대 단백질과 막 결합 단백질. 이 프로토콜의 주요 목적은 PTMS의 식별을위한 표적 단백질의 충분한 양을 수득하고 복합체의 높은 순도를 달성 할 수 없습니다. 만약 더 높은 순도복합체가 필요한 정제의 제 2 단계 (52)는이 프로토콜에 부가 될 수있다. 그 경우, 첫 번째 단계는 가혹한 용출 조건을 요구하는 높은 염 또는 산의 사용 및 후속 단계없이 친 화성 기질로부터 목적 단백질의 용출이 행렬을 수반 할 수있다. 그것은 우리가 단지 인산화 사이트의 식별을 위해이 프로토콜을 시험하고 우리는 현재 추가 PTMS의 자세한 식별 능력을 테스트하고 있다는 것을 강조하는 것이 중요하다.
우리의 대표적인 결과가 명확 단백질 키나제의 인산화 사이트 가소성 및 인산화 사이트의 특성을 설명하는 프로토콜의 능력을 보여준다. 가장 중요한 것은, 그들은 질량 분석에 의해 자동 인산화 사이트의 하나의 점 돌연변이에 의해 단백질의 적은 양에 의존하는 인산화 사이트의 식별이 혼란 결과를 얻을 수 있다는 것을 강조. 우리는 여기에서 이전에 보여 47 47,63가 빼앗아-198과 THR-199의 단일 점 돌연변이 (point mutation)가 복잡한 활성화를위한 전제 조건이 사이트의 인산화를 제안 신호 할 수있다,이 사이트에 인산화되지 않도록하는, 알라닌하는 것으로 나타났습니다 . 이 결과는 지금 차 사이트의 Thr-195의 인산화에 의해 설명 될 수있다. 다른 단백질 키나아제의 인산화 사이트 가소성에 비슷한 통찰력이 프로토콜 다음을 얻을 수있다. 또한, 인산화 사이트를 사용하여 결합 방법은 돌연변이, 단백질 키나아제의 인산화 사이트 가소성의 진화 의미의 더 나은 이해로 이어질 것입니다 단백질의 면역 및 질량 분석 분석과 함께 특정 키나제 (음향)를 억제 할 수있는 단백질을 가리 킵니다.
Disclosures
저자는 (금융 또는 기타) 더 경쟁의 이익이 없다는 것을 선언합니다.
Acknowledgments
VN은 왕립 학회에 의해 지원됩니다. JPR은 호주 연구위원회 미래 연구원 (FT0992129)입니다. 우리는 비판적으로 원고를 읽는 박사 미리 암 포드 감사합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MgCl2 | Sigma | M8266 | |
| MES | Sigma | M8250 | |
| Acetosyringone | Sigma | D134406 | toxic - 1 M stock in DMSO |
| Syringe 1 ml sterile | Terumo | ||
| Syringe needle | Terumo | NN-2525R | |
| Silwet L-77 (surfactant) | Lehle Seeds | VIS-01 | toxic |
| MG-132 (Z-Leu-Leu-Leu-al) | Sigma | C2211 | 1 M stock in DMSO, store at -80 °C |
| MS salts | Sigma | M5524 | oxidizing, toxic |
| Sucrose | Sigma | 16104 | |
| Trizma base | Sigma | T1503 | adjust pH with 1 N HCl to make 1 M Tris-HCl buffer |
| NaCl | Sigma | S3014 | 5 M stock |
| EDTA | Sigma | E6758 | toxic - 0.5 M stock |
| EGTA | Sigma | E4378 | |
| Glycerol | National Diagnostics | EC-606 | |
| IGEPAL CA-630 | Sigma | I8896 | corrosive |
| PVPP (polyvinylpolypyrrolidone) | Sigma | P5288 | do not confuse with PVP |
| DTT (DL-dithiothreitol) | Sigma | 43815 | toxic - 1 M stock, store at -20 °C |
| Plant protease inhibitor cocktail | Sigma | P9599 | do not freeze/thaw too many times |
| PMSF (phenylmethylsulfonyl fluoride) | Sigma | P7626 | corrosive, toxic |
| Calyculin A | Cell Signaling Technology | 9902 | |
| Sodium Fluoride (NaF) | Sigma | S7920 | toxic - 1 M stock |
| Sodium Molybdate (Na2MoO4) | Sigma | S6646 | 0.5 M stock |
| Sodium orthovanadate (Na3VO4) | Sigma | 450243 | toxic - Prepare a 200 mM solution of sodium orthovanadate. Adjust the pH to 10.0 using either 1 N NaOH or 1 N HCl. The starting pH of the sodium orthovanadate solution may vary with lots of the chemical. At pH 10.0 the solution will be yellow. Boil the solution until it turns colorless (approximately 10 min). Cool to room temperature.Readjust the pH to 10.0 and repeat steps 3 and 4 until the solution remains colorless and the pH stabilizes at 10.0. |
| Okadaic acid | Santa Cruz Biotechnology | sc-3513 | |
| Kinematica Polytron tissue homogeniser | Fisher Scientific | 08-451-320 | |
| Miracloth | Merck Millipore | 475855-1R | |
| anti-FLAG M2 agarose | Sigma | A2220 | this matrix is recommended |
| Streptavidin-agarose | Thermo-Scientific | 20347 | this matrix is recommended |
| GFP-Trap_A | Chromotek | gta-20 | this matrix is recommended |
| Anti-HA-Agarose | Sigma | A2095 | this matrix is recommended |
| 0.45 μm filter | VWR | 513-1902 | |
| BSA | Sigma | A7906 | |
| FLAG peptide | Sigma | F3290 | |
| D-biotin | Sigma | 47868 | |
| StrataClean resin | Agilent | 400714 | this absorption resin is recommended for protein precipitation |
| Mini-PROTEAN Tetra Cell | Biorad | ||
| PROTEAN II XL Cell | Biorad | ||
| SimplyBlue SafeStain | Invitrogen | LC6060 | this stain is recommended |
| Protein low-binding tubes (LoBind) | Eppendorf | 0030 108.116 | these tubes are recommended |
| Ammonium bicarbonate (ABC) | Sigma | 9830 | toxic |
| Acetonitrile | VWR | 83639 | toxic, flammable |
| 2-chloroacetamide | Sigma | 22790 | toxic |
| Trypsin | Promega | V5280 | irritant, sensitizing |
| Formic acid | Sigma | 14265 | toxic, corrosive |
| Water-bath sonicator | Ultravawe | Ultra BT Ultrasonic Bath | |
| LTQ-Orbitrap XL | Thermo-Scientific | ||
| Trichostatin A | Sigma | T8552 | toxic |
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