Hier beschreiben wir ein Protokoll für die Reinigung und Charakterisierung von Pflanzenproteinkomplexen. Wir zeigen, dass durch Immunpräzipitation ein einzelnes Protein in einem Komplex, so können wir seine post-translationale Modifikationen und seinen Interaktionspartner zu identifizieren.
Pflanzen passen sich rasch an wechselnde Umgebungen aufgrund von Wahrnehmung und Signalanlagen zu erarbeiten. Während Erreger angreifen, schnell Pflanzen, um eine Infektion über die Rekrutierung und Aktivierung von Immunkomplexen zu reagieren. Aktivierung von Immunkomplexen wird mit post-translationalen Modifikationen (PTM) von Proteinen, wie Phosphorylierung, Glycosylierung, Ubiquitinierung oder verbunden. Verstehen, wie diese PTMs choreografiert werden zu einem besseren Verständnis, wie Widerstand erreicht führen.
Hier beschreiben wir ein Verfahren zur Proteinreinigung Nukleotid-bindenden leucine-rich repeat (NB-LRR)-interagierende Proteine und die anschließende Identifizierung der post-translationalen Modifikationen (PTM). Mit kleinen Modifikationen kann das Protokoll für die Reinigung von anderen pflanzlichen Proteinkomplexen eingesetzt werden. Das Verfahren beruht auf der Expression eines Epitop markierte Version des Proteins von Interesse, das anschließend teilweise gereinigt wird b basierendy Immunpräzipitation und Massenspektrometrie zur Identifizierung von interagierenden Proteinen und PTMs unterzogen.
Dieses Protokoll zeigt, dass: i). Dynamische Änderungen in PTMs wie Phosphorylierung kann durch Massenspektrometrie nachgewiesen werden, ii). Es ist wichtig, ausreichende Mengen des Proteins von Interesse, und dies kann für den Mangel an Reinheit des Immunpräzipitats kompensieren; iii). Um PTMs eines Proteins von Interesse zu erfassen, hat dieses Protein immunpräzipitiert werden, um eine ausreichende Menge an Protein zu erhalten.
Immunwege beruhen auf verschiedenen post-translationalen Modifikationen (PTM) von Proteinen schnell übertragen Signale und aktiviert Immunantworten 1. PTMs sind schnell, reversibel und sehr spezifische chemische Veränderungen der Proteinstruktur, die Protein-Konformation, Aktivität, Stabilität, Lokalisierung und Protein-Protein-Wechselwirkungen 04.02 beeinflussen können. In Pflanzen mehr als 300 Arten von PTM wurden identifiziert, einschließlich Ubiquitinierung sumoylation, Sulfatierung, Glycosylierung, Phosphorylierung und 2,5. Eine wachsende Zahl von Hinweisen unterstreicht die Bedeutung der PTMs in verschiedene Aspekte der Anlagen Immunität 1,5,6. Protein-Phosphorylierung, die reversible Befestigung einer Phosphatgruppe an ein Serin, Threonin oder Tyrosin-Rest ein Regulator von vielen Zellfunktionen und nicht überraschend die sehr sucht PTM im Pflanzenabwehrsignalkaskaden 5-11. Phosphorylierungsabhängige Signalisierung ist ein integraler Bestandteil der Anlage Defensense Aktivierung initiiert nach extrazellulären Wahrnehmung von Mikroben durch Transmembranrezeptoren oder intrazelluläre Erkennung von Multidomänen-Resistenzproteine 5,8.
Nach der Invasion Pflanzen, Mikroben, werden durch Plasmamembran-Rezeptoren genannt pattern recognition receptors (PRR) 12 erfasst. Bekannt KFVs entweder Rezeptor-ähnliche Proteine (RLP) oder Rezeptor-ähnliche Kinase (RLKs), beide, der eine Liganden-Bindungs Ektodomäne und einem Single-Pass-Transmembrandomäne. Im Gegensatz zu RLPs haben RLKs eine intrazelluläre Kinase-Domäne 13-15. Die Ektodomäne von PRRS bindet an konservierte Mikrobe Elicitor Moleküle genannt pathogen-associated molecular patterns (PAMPs) führenden, im Falle RLKs, Autophosphorylierung und Transphosphorylierungs innerhalb der intrazellulären Domäne 6, 16. Stromabwärts der Wahrnehmung-induzierte Phosphorylierung von PRRs anschließende Phosphorylierung von Zytoplasma-Proteinen, einschließlich Kinasen 17, </sup> 18, E3-Ligasen 19, Mitogen-aktivierten Proteinkinasen (MAPK) 20, 21, Calcium-abhängigen Proteinkinasen (CDPK) 22, 23 und Transkriptionsfaktoren 24, 25 zu PAMP-Immunität ausgelöst (PTI).
Zusätzlich zu extrazellulären Wahrnehmung KFVs wird intrazelluläre Erkennung von Pathogenen durch zytoplasmatische Rezeptoren erzielt. Diese Multidomänen Widerstand (R)-Proteine enthalten eine variable N-terminale Domäne, eine zentrale Nukleotid-Bindung (NB)-Motiv, und C-terminalen Leucin-reichen Wiederholungen (LRR) und damit NB-LRR Proteinen 26, 27 bezeichnet. R-Proteinen, die direkt oder indirekt erkennen pathogen-abgeleiteten Moleküle genannt Virulenz Effektoren bekannt PRRS und andere Knoten des Immunsystems Ziel. Anerkennung induziert starke Verteidigung, die zu-Effektor-Immunität ausgelöst (ETI) 28-31. NB-LRR-Proteine haben eine requisite ATP-Bindungsmotiv im NB-Domäne 30, 32, aber es fehlt eine Kinase-Domäne. Die Phosphorylierung von konservierten Domänen von NB-LRR hat in einer groß angelegten Umfrage Proteom-33 berichtet worden, aber ihre Bedeutung für die ETI, ist unklar. Ähnlich wie PTI, Aktivierung der NB-LRR-Proteine führt zu Phosphorylierung von Zytoplasma-Proteinen, einschließlich MAPK 34-37 und 38-40 CDPKs. Vor allem aber können Effektor Anerkennung Phosphorylierung von akzessorischen Proteinen, die direkt interagieren mit den NB-LRR-Proteine 41 führen. Einige Beispiele sind RIN4 (Arabidopsis thaliana) und Pto (Tomaten, Solanum lycopersicum) Proteine, die mit NB-LRR-Proteine interagieren, RPM1 42, 43 und Prf 44. Während der Infektion durch Pseudomonas syringae Bakterien, die Effektor-Protein induziert AVRB RIN4 Phosphorylierung, durch den Rezeptor-ähnliche Kinase RIPK 45 wahrscheinlich, <sup> 46. Auch in der Tomaten P. syringae Effektoren AvrPto und AvrPtoB induzieren die Phosphorylierung von Pto 47. Im Gegensatz zu RIN4, die eine Kinase-Domäne fehlt und muss trans-phosphoryliert werden, ist eine aktive Pto-Kinase in der Lage, Auto-Phosphorylierung 48 und trans-Phosphorylierung der Substrate 49, 50. Während Pto benötigt seine Kinase-Aktivität für die Effektor-abhängigen Initiation der Signalisierung sind Kinase-dead Pto Mutanten noch in der Lage, in einem Effektor-unabhängigen Weg 51 zu signalisieren. Wir haben vor kurzem erklärt, diese Beobachtungen durch den Nachweis, dass die Prf / Pto oligomeren Komplex ist, mit mehreren Prf und Pto Moleküle 52 und Pto Moleküle innerhalb der gleichen Komplex trans-phosphorylieren seitig 47. Wir ein Modell vorgeschlagen, in dem ein Molekül Pto (Sensor) mit dem Effektor-Protein, was eine Konformationsänderung an das NB-LRR-Protein (Prf), das wiederum aktiviert einen zweiten PTO-Molekül (Helfer) witHin die Anlage. Anschließend Molekül trans-phosphoryliert der Helfer den Sensor Pto Pto die volle Aktivierung der Widerstand Komplex 47 führt.
Diese Beispiele zeigen, dass die Identifizierung der Immunkomplex-Komponenten und deren Potential PTM bei der Effekterkennung kann zu einem besseren Verständnis der Signale von Effektor Wahrnehmung nachgeschalteten Ziele transduzierte führen. Hier beschreiben wir eine Methode zur Proteinreinigung NB-LRR-Proteine interagieren und der anschließenden Identifizierung ihrer PTMs. Wir verwenden Nicotiana benthamiana und das Tomaten Prf / Pto Komplex als Modell, aber das gleiche Protokoll kann leicht zu RLKs von N. angewendet werden benthamiana und A. thaliana 53 mit kleinen Änderungen, wie wir innerhalb des Protokolls zu beschreiben.
Die Aufklärung des Mechanismus der Rezeptoraktivierung durch PAMPs und Effektoren können wesentlich zum Verständnis von Pflanzen Immunität beitragen. In den letzten 20 Jahren haben genetische und Hefe-Zwei-Hybrid-Screens war maßgeblich für die Entdeckung des KFV und NB-LRR-Proteine. Kürzlich wurden Massenspektrometrie-basierte Protokolle für die Identifizierung von Proteinen in Immun differentiell Signalisierungs 55-58, deren PTMs 11,33,59,60 geregelt etabliert, die Zusammensetzung der Immunkomplexe 61 und 62 richtet Effektor. Hier beschreiben wir ein einfaches Protokoll für die Identifizierung von PTMs Regulierung der Aktivierung von Immunkomplexen.
Im Vergleich mit den zuvor beschriebenen Protokolle ermöglicht dieses Protokoll die detaillierte Ermittlung der dynamischen Veränderungen PTMs. Protokolle von Groß Proteomik Ansätze können PTMs der Proteine zu identifizieren, sind aber nicht in der Lage, die Website Plastizität PTMs aufgrund begrenzen zeigened Proteinmengen. Bei der Protein-Phosphorylierung, Groß Proteomik Ansätze in der Regel nur identifizieren die vorherrschende Phosphorylierungsstellen 11,33,59. Die detaillierte Charakterisierung eines Proteins Phosphorylierungsstatus erfordert eine erhebliche Menge an Protein, die nur durch teilweise Reinigung des Zielproteins 47 erhalten werden können. Das hier beschriebene Protokoll Paare eine Proteinreinigung Ansatz, der eine wesentliche Menge des Zielproteins führt, mit der Massenspektrometrie-Analyse des gereinigten Proteins. Nach diesem Protokoll wurde die Einzel Phosphorylierung von Puerto überwiegend an Ser-198 zugeschrieben, wie zuvor beschrieben, aber einige 52-Massenspektrometrie Spektren auch eine einzelne Phosphorylierung an Thr-195 oder Thr-199 unterstützt. Wenn Doppel Phosphorylierungsereignisse von Puerto beobachtet wurden, die vorherrschende Kombination von Aminosäuren phosphoryliert war Ser-198 und Thr-199, obwohl Kombinationen auf anderen Websites wurden ebenfalls beobachtet (Tabelle 1). Diese Ergebnisse zeigen deutlich die Phosphorylierungsstelle Plastizität von Proteinkinasen und die Fähigkeit des beschriebenen Protokolls, im Detail beschreiben sämtliche möglichen Phosphorylierungsstellen.
Die wichtigsten Schritte dieses Protokolls sind: 1) ausreichende Extraktion von Proteinen, 2) Schutz des PTMs, und 3) ausreichende Menge an Zielprotein. Erste, für eine ausreichende Extraktion von Proteinen, ist es wichtig, das Gewebe in flüssigem Stickstoff zermahlen und anschließend in ein Gewebe-Homogenisator verwendet, wie im Protokoll beschrieben. Wenn ein Gewebe-Homogenisator nicht verfügbar ist, kann ein Mörser und Pistill verwendet werden. Es ist auch wichtig, ein Verhältnis von eins zu drei (oder vier) Gramm Gewebe zu Volumen Extraktionspuffer verwenden. Dieses Gewebe-Verhältnis und die hohe Festigkeit Puffer, die wir vorschlagen Puffer stellt sicher, dass der pH-Wert während der Extraktion neutral bleiben. Wir fanden, dass dies ist von besonderer Bedeutung für A. thaliana und Tomate Extractions 52. Schutz der PTM kann, indem in allen Puffern geeignete Inhibitoren von Enzymen, die PTM zu entfernen, kann erreicht werden. Es ist auch wichtig, um alle Schritte bei 4 ° C durchzuführen und Puffer und Instrumente Vorkühlung. Höhere Ausbeuten an Zielprotein kann durch die Verwendung von Pflanzen, die das Protein exprimieren, in ausreichenden Mengen und unter Verwendung von hohen Mengen an Gewebe (etwa 20 g) erreicht werden. Der entscheidende Schritt für den Erhalt von ausreichenden Mengen an Zielprotein Konzentration des Zielproteins durch direkte Immunopräzipitation. Die Bedeutung dieses Schrittes durch unser Versagen, PTMs von Pto nach einer Immunpräzipitation Prf aufgrund der begrenzten Menge an co-immunpräzipitiert Pto (2B) identifizieren hervorgehoben. Im Gegensatz direkte Immunopräzipitation von Pto ergab deutlich mehr messbar Peptide (Fig. 2C), die zu etwa 80% Abdeckung der Proteinsequenz und Identifizierung von PTM (Tabelle 1). Wir haben auch strongly empfehlen die Verwendung von Epitop-Tags für Protein Immunpräzipitation. Im Vergleich zu Antikörpern gegen native Proteine Epitop-Tags Affinitätsmatrix angehoben werden können, höhere Mengen an teilweise gereinigten Protein zu erhalten. Durch die Verwendung eines Antikörpers gegen Mutter Pto Protein 51 (2A) für die Immunpräzipitation erhoben, konnten wir nur einzelne Phosphorylierung der beiden vorherrschenden Phosphorylierungsstellen von Puerto identifizieren.
Dieses Protokoll wurde in erster Linie für die partielle Reinigung von N. entwickelt benthamiana Zytoplasma-Proteinen und anschließende Identifizierung der Phosphorylierungsstellen. jedoch unter Verwendung der hier beschriebenen Änderungen, dieses Protokoll kann leicht angepasst werden, für A. thaliana Proteine und membrangebundenen Proteinen. Das Hauptziel dieses Protokolls ist, ausreichende Mengen des Zielproteins für die Identifizierung von PTMs Ausbeute und die höchste Reinheit des Komplexes nicht zu erreichen. Wenn höhere Reinheitdes Komplexes benötigt einen zweiten Schritt der Reinigung kann dieses Protokoll 52 hinzugefügt werden. In diesem Fall wird der erste Schritt ermöglicht die Elution des Zielproteins von der Affinitätsmatrix ohne die Verwendung von hohen Salzen oder Säure und dem nachfolgenden Schritt kann eine Matrix beinhalten, welche harte Elutionsbedingungen erfordert. Es ist wichtig zu betonen, dass wir nur dieses Protokoll getestet, für die Identifizierung von Phosphorylierungsstellen und dass wir testen derzeit ihre Fähigkeit zur detaillierten Ermittlung der zusätzlichen PTMs.
Unsere repräsentative Ergebnisse zeigen deutlich die Phosphorylierungsstelle Plastizität von Proteinkinasen und die Fähigkeit des beschriebenen Protokolls zu Phosphorylierungsstellen charakterisieren. Am wichtigsten ist, markieren Sie sie, dass die Identifizierung von Phosphorylierungsstellen die sich in geringen Menge von Proteinen durch Massenspektrometrie und durch einzelne Punktmutationen von Auto-Phosphorylierungsstellen kann verwirrend Ergebnisse. Wir zeigen hier und zuvor 47 </sup> Doppel, dass die Phosphorylierung von Pto auf Ser-198 und Thr-199 ist mit der Aktivierung des Prf / Pto Komplex assoziiert. Dagegen bisher veröffentlichten Ergebnisse zeigen, dass 47,63 Einzelpunktmutationen von Ser-198 und Thr-199 zu Alanin, die Phosphorylierung an diesen Stellen eine Voraussetzung für komplexe Aktivierung zu verhindern, sind in der Lage von Signalisierungs darauf hindeutet, dass die Phosphorylierung dieser Seiten ist nicht . Diese Ergebnisse können nun durch Phosphorylierung des sekundären Standorts Thr-195 erläutert. Ähnliche Einblick in die Phosphorylierungsstelle Plastizität von anderen Proteinkinase kann nach diesem Protokoll erhalten werden. Ferner ist ein kombinierter Ansatz aus Phosphorylierungsstellen Punktmutationen, Proteine, die spezifische Kinasen (Effektoren), die mit Protein-Immunpräzipitation und Massenspektrometrie-Analyse zu hemmen, kann zu einem besseren Verständnis der Bedeutung der Evolutions Phosphorylierungsstelle Plastizität von Protein-Kinasen führen.
The authors have nothing to disclose.
VN wird von der Royal Society unterstützt. JPR ist ein Zukunfts Fellow (FT0992129) Australian Research Council. Wir danken Dr. Miriam Gifford für das Manuskript kritisch zu lesen.
MgCl2 | Sigma | M8266 | |
MES | Sigma | M8250 | |
Acetosyringone | Sigma | D134406 | toxic – 1 M stock in DMSO |
Syringe 1mL sterile | Terumo | ||
Syringe needle | Terumo | NN-2525R | |
Silwet L-77 (surfactant) | Lehle Seeds | VIS-01 | toxic |
MG-132 (Z-Leu-Leu-Leu-al) | Sigma | C2211 | 1 M stock in DMSO, store at -80 °C |
MS salts | Sigma | M5524 | oxidizing, toxic |
Sucrose | Sigma | 16104 | |
Trizma base | Sigma | T1503 | adjust pH with 1 N HCl to make 1 M Tris-HCl buffer |
NaCl | Sigma | S3014 | 5 M stock |
EDTA | Sigma | E6758 | toxic – 0.5 M stock |
EGTA | Sigma | E4378 | |
Glycerol | National Diagnostics | EC-606 | |
IGEPAL CA-630 | Sigma | I8896 | corrosive |
PVPP (polyvinylpolypyrrolidone) | Sigma | P5288 | do not confuse with PVP |
DTT (DL-dithiothreitol) | Sigma | 43815 | toxic – 1 M stock, store at -20 °C |
Plant protease inhibitor cocktail | Sigma | P9599 | do not freeze/thaw too many times |
PMSF (phenylmethylsulfonyl fluoride) | Sigma | P7626 | corrosive, toxic |
Calyculin A | Cell Signaling Technology | 9902 | |
Sodium Fluoride (NaF) | Sigma | S7920 | toxic – 1 M stock |
Sodium Molybdate (Na2MoO4) | Sigma | S6646 | 0.5 M stock |
Sodium orthovanadate (Na3VO4) | Sigma | 450243 | toxic – Prepare a 200 mM solution of sodium orthovanadate. Adjust the pH to 10.0 using either 1N NaOH or 1N HCl. The starting pH of the sodium orthovanadate solution may vary with lots of the chemical. At pH 10.0 the solution will be yellow. Boil the solution until it turns colorless (approximately 10 minutes). Cool to room temperature.Readjust the pH to 10.0 and repeat steps 3 and 4 until the solution remains colorless and the pH stabilizes at 10.0. |
Okadaic acid | Santa Cruz Biotechnology | sc-3513 | |
Kinematica Polytron tissue homogeniser | Fisher Scientific | 08-451-320 | |
Miracloth | Merck Millipore | 475855-1R | |
anti-FLAG M2 agarose | Sigma | A2220 | this matrix is recommended |
Streptavidin-agarose | Thermo-Scientific | 20347 | this matrix is recommended |
GFP-Trap_A | Chromotek | gta-20 | this matrix is recommended |
Anti-HA-Agarose | Sigma | A2095 | this matrix is recommended |
0.45 μm filter | VWR | 513-1902 | |
BSA | Sigma | A7906 | |
FLAG peptide | Sigma | F3290 | |
D-biotin | Sigma | 47868 | |
StrataClean resin | Agilent | 400714 | this absorption resin is recommended for protein precipitation |
Mini-PROTEAN Tetra Cell | Biorad | ||
PROTEAN II XL Cell | Biorad | ||
SimplyBlue SafeStain | Invitrogen | LC6060 | this stain is recommended |
Protein low-binding tubes (LoBind) | Eppendorf | 0030 108.116 | these tubes are recommended |
Ammonium bicarbonate (ABC) | Sigma | 9830 | toxic |
Acetonitrile | VWR | 83639 | toxic, flammable |
2-chloroacetamide | Sigma | 22790 | toxic |
Trypsin | Promega | V5280 | irritant, sensitizing |
Formic acid | Sigma | 14265 | toxic, corrosive |
Water-bath sonicator | Ultravawe | Ultra BT Ultrasonic Bath | |
LTQ-Orbitrap XL | Thermo-Scientific | ||
Trichostatin A | Sigma | T8552 | toxic |