Vi beskriver här ett protokoll för rening och karakterisering av växtproteinkomplex. Vi visar att genom immunoprecipitating ett enda protein i en komplex, så att vi kan identifiera dess post-translationella modifieringar och dess interagerande partners.
Växter snabbt anpassa sig till föränderliga miljöer på grund utarbeta perception och signalsystem. Under patogen attack, växter snabbt reagera på infektion via rekrytering och aktivering av immunkomplex. Aktiveringen av immunkomplex är associerad med posttranslationella modifieringar (PTMs) av proteiner, såsom fosforylering, glykosylering, eller ubikitinering. Att förstå hur dessa PTMs är koreograferade att leda till en bättre förståelse för hur motstånd uppnås.
Här beskriver vi en proteinreningsmetod för nukleotid-bindande leucinrik upprepning (NB-LRR)-interagerande proteiner och den efterföljande identifieringen av deras post-translationella modifieringar (PTMs). Med små modifieringar, kan protokollet tillämpas för rening av andra växtproteinkomplex. Metoden är baserad på uttrycket av en epitop-märkt version av proteinet av intresse, som därefter partiellt renad by immunoutfällning och utsätts för masspektrometri för identifiering av interagerande proteiner och PTMs.
Detta protokoll visar att: i). Dynamiska förändringar i PTMs såsom fosforylering kan detekteras genom masspektrometri, ii). Det är viktigt att ha tillräckliga mängder av proteinet av intresse, och detta kan kompensera för bristen på renheten av immunfällningen, iii). För att detektera PTMs av ett protein av intresse, har detta protein som skall immunoutfälldes att få en tillräcklig mängd av protein.
Immunvägar gripa olika posttranslationella modifieringar (PTMs) av proteiner för att snabbt omvandla signalerna och aktiverar immunsvar 1. PTMs är snabba, reversibla, och mycket specifika kemiska förändringar av proteinstrukturen som kan påverka proteinkonformation, aktivitet, stabilitet, lokaliserings-och protein-proteininteraktioner 2-4. I växter, har mer än 300 typer av PTMs identifierats inklusive ubiquitinering, sumoylation, sulfate, glykosylering och fosforylering 2,5. En växande mängd bevis belyser vikten av PTMs i olika aspekter av växt immunitet 1,5,6. Protein fosforylering, är reversibel fastsättning av en fosfatgrupp till ett serin-treonin-eller tyrosinrest en regulator av många cellulära funktioner och inte överraskande den mest studerade PTM i växters försvar signaleringskaskader 5-11. Fosforylering-beroende signalering är en integrerad del av anläggningen defense aktivering initieras efter cellulära uppfattning av mikrober av transmembranreceptorer, eller intracellulär erkännande av multidomain motstånds proteiner 5,8.
Vid invaderande växter, mikrober upptäcks av plasmamembranreceptorer som kallas mönsterigenkänningsreceptorer (PRRS) 12. Kända PRRs är antingen receptorliknande proteiner (RLPs) eller receptorliknande kinaser (RLKs), som båda bär en ligandbindande ektodomänen och en enkelpasstransmembrandomänen. I motsats till RLPs, RLKs har en intracellulär kinasdomän 13-15. Den ektodomän PRRS binder till bevarade mikrob elicitor molekyler som kallas patogen-associerade molekylära mönster (PAMPs) ledande, i fallet med RLKs, till autofosforylering och transfosforylering inom den intracellulära domänen 6, 16. Nedströms uppfattning-inducerade fosforylering av PRRs, efterföljande fosforylering av cytoplasmaproteiner inklusive kinaser 17, </sup> 18, ligaser E3 19, mitogen-aktiverade proteinkinaser (MAPK) 20, 21, kalcium-beroende proteinkinaser (CDPK) 22, 23, och transkriptionsfaktorer 24, 25 leder till PAMP triggad immunitet (PTI).
Utöver den extracellulära uppfattning PRRs är intracellulär erkännande av patogener uppnås genom cytoplasmatiska receptorer. Dessa multidomain resistansen (R)-proteiner innehåller en variabel N-terminal domän, en central nukleo-bindande (NB) motiv, och C-terminala leucinrika upprepningar (LRR) och därför kallas NB-LRR proteiner 26, 27. R-proteiner direkt eller indirekt känner igen patogen-härledda virulence molekyler som kallas effektorer, också kända för att rikta PRRs och andra noder i immunsystemet. Erkännande inducerar starka försvar som leder till effektor-utlöst immunitet (ETI) 28-31. NB-LRR proteiner har en requisite ATP-bindande motivet i den NB domän 30, 32, men de saknar en kinasdomän. Fosforylering av konserverade domäner av NB-Lrrs har rapporterats i en storskalig proteomik undersökning 33, men dess relevans för ETI är oklart. Likaså till PTI, aktivering av NB-LRR proteinerna leder till fosforylering av cytoplasmaproteiner inklusive MAPKs 34-37 och CDPKs 38-40. Viktigast kan effektor erkännande leda till fosforylering av tillbehör proteiner som interagerar direkt med NB-LRR proteiner 41. Några exempel RIN4 (Arabidopsis thaliana) och Pto (tomat, Solanum lycopersicum) proteiner som interagerar med NB-LRR proteiner RPM1 42, 43 och Prf 44, respektive. Vid infektion av Pseudomonas syringae bakterier, det effektorprotein AvrB inducerar RIN4 fosforylering, troligen av den receptorliknande kinas RIPK 45, <sup> 46. På motsvarande sätt i tomat P. syringae effekten AvrPto och AvrPtoB inducera fosforylering av Pto 47. I motsats till RIN4 som saknar en kinasdomän och måste trans fosforyleras, är Pto aktivt kinas kan auto-fosforylering 48 och trans-fosforylering av substrat 49, 50. Medan Pto kräver sin kinasaktivitet för effektor beroende initiering av signalering, kinasdöda Pto mutanter fortfarande kan signalera i en effektor oberoende sätt 51. Vi förklarade nyligen dessa observationer genom att visa att den Prf / Pto komplexet är oligomera, som innehåller flera Prf och Pto molekyler 52 och att Pto molekyler inom samma komplex kan trans fosforylera varandra 47. Vi föreslog en modell i vilken en molekyl av Pto (sensor) samverkar med effektor-proteinet, vilket orsakar en konformationsändring till NB-LRR protein (PRF), som i sin tur aktiverar en andra Pto molekyl (hjälpare) within komplexet. Därefter hjälpar Pto molekylen trans fosforylerar sensorn Pto leda till fullständig aktivering av motståndet komplex 47.
Dessa exempel visar att identifieringen av immuna komplexa komponenter och deras potentiella PTMs på effektor erkännande kan leda till en bättre förståelse för hur signaler omvandlade från effektor uppfattning till mål nedströms. Här beskriver vi en proteinreningsmetod för NB-LRR-interagerande proteiner och efterföljande identifiering av sina PTMs. Vi använder Nicotiana benthamiana och tomat Prf / Pto komplicerat som en modell, men samma protokoll kan lätt appliceras på RLKs från N. benthamiana och A. thaliana 53 med små ändringar som vi beskriver i protokollet.
Belysa mekanismen av receptoraktivering av PAMPs och effektenheter kan i hög grad bidra till vår förståelse av växt immunitet. Under de senaste 20 åren, har genetiska och jäst två-hybrid-skärmar varit avgörande för upptäckten av PRRs och NB-LRR proteiner. På senare tid har masspektrometri-baserade protokoll fastställts för identifiering av proteiner regleras differentiellt under immun signalering 55-58, deras PTMs 11,33,59,60, riktar sammansättningen av immunkomplex 61 och effektor 62. Här beskriver vi ett enkelt protokoll för identifieringen av PTMs reglerar aktiveringen av immunkomplex.
I jämförelse med tidigare beskrivna protokoll, möjliggör detaljerad identifiering av dynamiska förändringar av PTMs detta protokoll. Protokoll av storskaliga proteomik metoder kan identifiera PTMs av proteiner, men kan inte avslöja platsen plasticitet PTMs grund för att begränsaed mängder protein. I fallet med proteinfosforylering, storskaliga proteomik tillvägagångssätt typiskt endast identifiera de dominerande fosforyleringsställen 11,33,59. Den detaljerade karakteriseringen av en proteinfosforylering status kräver en betydande mängd protein som kan uppnås endast genom partiell rening av målproteinet 47. Protokollet som beskrivs här kopplar en proteinrening tillvägagångssätt som ger en avsevärd mängd av målproteinet, med massanalys av det renade proteinet spektrometri. Efter detta protokoll, var den enda fosforylering vid Pto hänföras främst till Ser-198 som tidigare beskrivits 52 men några masspektrometri spektra stödde också en fosforylering händelse på Thr-195 eller Thr-199. När dubbla fosforyleringshändelser av Pto observerades, den dominerande kombinationen av fosforylerade aminosyror var Ser-198 och Thr-199 även om kombinationer på andra webbplatser observerades också (Tabell 1). Dessa resultat visar tydligt den fosforyleringsställe plasticiteten hos proteinkinaser och förmågan hos det beskrivna protokollet för att karakterisera i detalj alla möjliga fosforyleringsställen.
De mest kritiska stegen i detta protokoll är: 1) tillräcklig utvinning av proteiner, 2) skydda PTMs, och 3) tillräcklig mängd målprotein. Först för tillräcklig extraktion av proteiner, är det viktigt att mala vävnaden i flytande kväve och därefter att använda en vävnadshomogenisator såsom beskrivet i protokollet. Om en vävnadshomogenisator inte är tillgänglig, kan användas av en mortel och mortelstöt. Det är också viktigt att använda ett förhållande av 02:59 (eller fyra) av gram vävnad till volym extraktionsbuffert. Denna vävnad för att buffra förhållande och hög styrka buffert som vi föreslår kommer att se till att pH kommer att förbli neutralt under extraheringen. Vi fann att detta är särskilt viktigt för A. thaliana och tomat extrasfunktione r 52. Skydd av PTMs kan uppnås genom att ta med i samtliga buffertar lämpliga inhibitorer av enzymer som kan avlägsna PTMs. Det är även kritiskt för att utföra samtliga steg vid 4 ° C och till prechill buffertar och instrument. Högre utbyten av målproteinet kan uppnås genom att använda växter som uttrycker proteinet i tillräckliga mängder och genom användning av höga mängder av vävnad (ca 20 g). Det mest avgörande steget för att få tillräckliga mängder av målprotein koncentrerar målproteinet genom direkt immunoutfällning. Betydelsen av detta steg markeras av vårt misslyckande att identifiera PTMs av Pto efter en Prf immunoutfällning på grund av den begränsade mängden coimmunoprecipitated Pto (Figur 2B). I motsats därtill direkt immunoutfällning av Pto gav väsentligt mer mätbara peptider (figur 2C) som leder till ca 80% täckning av den proteinsekvens och identifiering av PTMs (tabell 1). Vi också strongly rekommendera användning av epitop-taggar för proteinimmunfällning. I jämförelse med antikroppar riktade mot nativa proteiner epitop-taggar affinitetsmatris kan ge större mängder av partiellt renat protein. Genom användning av en antikropp som tagits fram mot nativt Pto protein 51 (Figur 2A) för immunoutfällning, kunde vi identifiera bara enstaka fosforylering av de två dominerande fosforyleringsställen av Pto.
Detta protokoll har främst utvecklats för partiell rening av N. benthamiana cytoplasma protein och efterföljande identifiering av deras fosforyleringssäten. Men med hjälp av de ändringar som beskrivs här, detta protokoll kan enkelt anpassas för A. thaliana-proteiner och membranbundna proteiner. Det huvudsakliga syftet med detta protokoll är att ge tillräckliga mängder av målproteinet för identifiering av PTMs och inte för att uppnå högsta renhet av komplexet. Om högre renhetav komplexet krävs ett andra reningssteg kan läggas till i detta protokoll 52. I detta fall kommer ett första steg tillåta eluering av målproteinet från affinitetsmatrisen utan användning av höga salterna eller-syra och efterföljande steg kan innebära en matris, som kräver hårda elueringsbetingelser. Det är viktigt att betona att vi endast har testat detta protokoll för identifiering av fosforyleringssäten och att vi för närvarande testar sin förmåga för detaljerad identifiering av ytterligare PTMs.
Våra representativa resultat visar klart fosforyleringssätet plasticiteten hos proteinkinaser och förmågan hos det beskrivna protokollet för att karakterisera fosforyleringsställen. Viktigast är att belysa de att identifiera fosforyleringsställen förlitar sig i låg mängd av proteiner genom masspektrometri och genom enstaka punktmutationer av auto-fosforyleringsställen kan ge förvirrande resultat. Vi visar här och tidigare 47 </sup> Att dubbel fosforylering av Pto på Ser-198 och Thr-199 är associerad med aktivering av Prf / Pto komplex. Däremot har tidigare publicerade resultat 47,63 visat att enstaka punktmutationer av Ser-198 och Thr-199 till alanin, som förhindrar fosforylering på dessa platser, har förmåga att signalera vilket tyder på att fosforylering av dessa platser är inte en förutsättning för komplex aktivering . Dessa resultat kan nu förklaras genom fosforylering av den sekundära platsen Thr-195. Liknande inblick i fosforyleringssätet plasticitet av andra proteinkinas kan erhållas efter detta protokoll. Dessutom, ett kombinerat tillvägagångssätt och använda fosforyleringsställen punktmutationer, proteiner som kan hämma specifika kinaser (manipulatorer) i kombination med protein immunoprecipitation och masspektrometrianalys kommer att leda till en bättre förståelse av den evolutionära betydelsen av fosforyleringssätet plasticitet av proteinkinaser.
The authors have nothing to disclose.
VN stöds av Royal Society. JPR är en Australian Research Council Future Fellow (FT0992129). Vi tackar Dr Miriam Gifford för kritiskt läsa manuskriptet.
MgCl2 | Sigma | M8266 | |
MES | Sigma | M8250 | |
Acetosyringone | Sigma | D134406 | toxic – 1 M stock in DMSO |
Syringe 1mL sterile | Terumo | ||
Syringe needle | Terumo | NN-2525R | |
Silwet L-77 (surfactant) | Lehle Seeds | VIS-01 | toxic |
MG-132 (Z-Leu-Leu-Leu-al) | Sigma | C2211 | 1 M stock in DMSO, store at -80 °C |
MS salts | Sigma | M5524 | oxidizing, toxic |
Sucrose | Sigma | 16104 | |
Trizma base | Sigma | T1503 | adjust pH with 1 N HCl to make 1 M Tris-HCl buffer |
NaCl | Sigma | S3014 | 5 M stock |
EDTA | Sigma | E6758 | toxic – 0.5 M stock |
EGTA | Sigma | E4378 | |
Glycerol | National Diagnostics | EC-606 | |
IGEPAL CA-630 | Sigma | I8896 | corrosive |
PVPP (polyvinylpolypyrrolidone) | Sigma | P5288 | do not confuse with PVP |
DTT (DL-dithiothreitol) | Sigma | 43815 | toxic – 1 M stock, store at -20 °C |
Plant protease inhibitor cocktail | Sigma | P9599 | do not freeze/thaw too many times |
PMSF (phenylmethylsulfonyl fluoride) | Sigma | P7626 | corrosive, toxic |
Calyculin A | Cell Signaling Technology | 9902 | |
Sodium Fluoride (NaF) | Sigma | S7920 | toxic – 1 M stock |
Sodium Molybdate (Na2MoO4) | Sigma | S6646 | 0.5 M stock |
Sodium orthovanadate (Na3VO4) | Sigma | 450243 | toxic – Prepare a 200 mM solution of sodium orthovanadate. Adjust the pH to 10.0 using either 1N NaOH or 1N HCl. The starting pH of the sodium orthovanadate solution may vary with lots of the chemical. At pH 10.0 the solution will be yellow. Boil the solution until it turns colorless (approximately 10 minutes). Cool to room temperature.Readjust the pH to 10.0 and repeat steps 3 and 4 until the solution remains colorless and the pH stabilizes at 10.0. |
Okadaic acid | Santa Cruz Biotechnology | sc-3513 | |
Kinematica Polytron tissue homogeniser | Fisher Scientific | 08-451-320 | |
Miracloth | Merck Millipore | 475855-1R | |
anti-FLAG M2 agarose | Sigma | A2220 | this matrix is recommended |
Streptavidin-agarose | Thermo-Scientific | 20347 | this matrix is recommended |
GFP-Trap_A | Chromotek | gta-20 | this matrix is recommended |
Anti-HA-Agarose | Sigma | A2095 | this matrix is recommended |
0.45 μm filter | VWR | 513-1902 | |
BSA | Sigma | A7906 | |
FLAG peptide | Sigma | F3290 | |
D-biotin | Sigma | 47868 | |
StrataClean resin | Agilent | 400714 | this absorption resin is recommended for protein precipitation |
Mini-PROTEAN Tetra Cell | Biorad | ||
PROTEAN II XL Cell | Biorad | ||
SimplyBlue SafeStain | Invitrogen | LC6060 | this stain is recommended |
Protein low-binding tubes (LoBind) | Eppendorf | 0030 108.116 | these tubes are recommended |
Ammonium bicarbonate (ABC) | Sigma | 9830 | toxic |
Acetonitrile | VWR | 83639 | toxic, flammable |
2-chloroacetamide | Sigma | 22790 | toxic |
Trypsin | Promega | V5280 | irritant, sensitizing |
Formic acid | Sigma | 14265 | toxic, corrosive |
Water-bath sonicator | Ultravawe | Ultra BT Ultrasonic Bath | |
LTQ-Orbitrap XL | Thermo-Scientific | ||
Trichostatin A | Sigma | T8552 | toxic |