Vi beskriver her en protokoll for rensing og karakterisering av planteproteinkomplekser. Vi viser at ved å immunoutfeller et enkelt protein i et kompleks, slik at vi kan identifisere de post-translasjonelle modifikasjoner og dens samvirkende partnere.
Planter rask tilpasning til skiftende miljøer på grunn utdype oppfatning og signalanlegg. Under patogen angrep, planter raskt svare på smitte via rekruttering og aktivering av immunkomplekser. Aktiveringen av immunkomplekser er forbundet med post-translasjonelle modifikasjoner (PTMs) med proteiner, slik som fosforylering, glykosylering eller ubiquitinering. Forstå hvordan disse PTMs er koreografert vil føre til en bedre forståelse av hvordan motstanden er oppnådd.
Her beskriver vi en proteinrensemetode for nukleotid-bindende leucin-rik repeat (NB-LRR)-interagerende proteiner, og den påfølgende identifikasjon av de post-translasjonelle modifikasjoner (PTMs). Med små modifikasjoner, kan protokollen brukes for rensing av andre plante protein komplekser. Fremgangsmåten er basert på ekspresjonen av et epitop-merket versjon av proteinet av interesse, som deretter delvis renset by immunoutfelling og underkastet massespektrometri for identifisering av interagerende proteiner og PTMs.
Denne protokollen viser at: i). Dynamiske endringer i PTMs eksempel fosforylering kan påvises ved massespektrometri, ii). Det er viktig å ha tilstrekkelige mengder av proteinet av interesse, og dette kan kompensere for manglende renhet av immunoprecipitatet, iii). For å oppdage PTMs av et protein av interesse, har dette proteinet som skal immunoutfelt for å få en tilstrekkelig mengde av protein.
Immun trasé avhengige av forskjellige post-translasjonelle modifikasjoner (PTMs) av proteiner til hurtig transduce-signaler og aktivere immunresponser en. PTMs er raske, reversible, og svært spesifikke kjemiske forandringer av proteinstruktur som kan påvirke protein konformasjon, aktivitet, stabilitet, lokalisering, og protein-protein interaksjoner 2-4. I planter, har mer enn 300 typer av PTMs blitt identifisert inkludert ubiquitinering, sumoylation, sulfatering, glykosylering, og fosforylering 2,5. En økende mengde bevis fremhever viktigheten av PTMs i ulike aspekter av plante immunitet 1,5,6. Protein fosforylering, er reversibel festing av en fosfatgruppe til et serin, threonin eller tyrosin er rester en regulator for mange cellulære funksjoner og ikke overraskende den mest studerte PTM i planteforsvar signaleringskaskader 5-11. Fosforylering-avhengig signalisering er en integrert del av anlegget defeNSE aktivering initiert etter ekstracellulære oppfatning av mikrober ved transmembrane reseptorer, eller intracellulær anerkjennelse av multidomain motstand proteiner 5,8.
Ved invaderende planter, er mikrober oppdaget av plasmamembranreseptorer kalt mønstergjenkjenning reseptorer (PRRs) 12. Kjente PRRs er enten reseptor-lignende proteiner (RLPs) eller reseptor-lignende kinase (RLKs), som begge bærer en ligand-bindende ektodomenet og en enkelt-pass-transmembran-domenet. I motsetning til RLPs, RLKs har en intracellulær kinase domene 13-15. Den ektodomenet av PRRs binder seg til konserverte mikrobe elicitor molekyler kalt patogen-assosiert molekylære mønstre (PAMPs) ledende, i tilfelle av RLKs, til autophosphorylation og transphosphorylation innenfor den intracellulære domenet 6, 16. Nedstrøms av persepsjon-indusert fosforylering av PRRs, påfølgende fosforylering av cytoplasmatiske proteiner inkludert kinaser 17, </sup> 18, ligaser E3 19, mitogenaktiverte protein kinaser (MAPKs) 20, 21, kalsium-avhengige protein kinaser (CDPK) 22, 23, og transkripsjonsfaktorer 24, 25 fører til PAMP-utløst immunitet (PTI).
I tillegg til det ekstracellulære persepsjon ved PRRs, er intracellulær gjenkjennelse av patogene bakterier oppnådd gjennom cytoplasmiske reseptorer. Disse multidomain motstand (R) proteiner inneholder et variabelt N-terminale domene, et sentralt nukleotid-bindende (NB) motiv, og C-terminale leucin-rik gjentar (LRR), og derfor kalles NB-LRR proteiner 26, 27. R-proteiner direkte eller indirekte gjenkjenne patogen-avledet virulens molekyler kalt effektorer, også kjent å målrette PRRs og andre noder i immunsystemet. Anerkjennelse fremkaller sterke forsvar fører til effektor-utløst immunitet (ETI) 28-31. NB-LRR proteiner har en requisite ATP-bindende motiv innen NB domene 30, 32, men de mangler en kinase domene. Fosforylering av konserverte domener av NB-LRRs har blitt rapportert i en storstilt proteomikk undersøkelsen 33, men dens relevans for ETI er uklart. Tilsvar til PTI, aktivering av NB-LRR proteiner fører til fosforylering av cytoplasmatiske proteiner inkludert MAPKs 34-37 og CDPKs 38-40. Viktigst, kan effektor anerkjennelse føre til fosforylering av tilbehørs proteiner som samhandler direkte med NB-LRR proteiner 41. Noen eksempler er RIN4 (Arabidopsis thaliana) og Pto (tomat, Solanum lycopersicum) proteiner som samhandler med NB-LRR proteiner, RPM1 42, 43 og Prf 44, hhv. Under infeksjon med Pseudo syringae bakterier, effektor protein AvrB induserer RIN4 fosforylering, mest sannsynlig av reseptor-lignende kinase RIPK 45, <sup> 46. Tilsvarende, i tomat P. syringae effektorer AvrPto og AvrPtoB indusere fosforylering av Pto 47. I motsetning til RIN4 som mangler et kinase domene og må være trans-fosforylert, er Pto en aktiv kinase i stand til auto-fosforylering 48 og trans-fosforylering av substratene 49, 50. Mens Pto krever sin kinase aktivitet for effector avhengige oppstart av signalering, kinase-dead Pto mutanter er fortsatt i stand til å signalisere i en effektor-uavhengig måte 51. Vi har nylig forklart disse observasjonene ved å demonstrere at Prf / Pto komplekset er oligomeric, som inneholder flere Prf og Pto molekyler 52 og at Pto molekyler innenfor samme kompleks kan trans-phosphorylate hverandre 47. Vi foreslått en modell hvor ett molekyl av Pto (sensor) samvirker med effektor protein, forårsaker en konformasjon endring av NB-LRR protein (Prf) som i sin tur aktiverer en andre Pto molekyl (hjelper) within komplekset. Deretter hjelperen Pto molekyl trans-fosforylerer sensoren Pto fører til full aktivering av motstanden komplekset 47..
Disse eksemplene viser at identifiseringen av immunkomplekskomponenter og deres potensielle PTMs ved effektor gjenkjenning kan føre til en bedre forståelse av hvordan signalene omformet fra effektor oppfatningen til nedstrøms mål. Her beskriver vi et protein rensing metode for NB-LRR-samspill proteiner og den påfølgende identifisering av sine PTMs. Vi bruker Nicotiana benthamiana og tomat Prf / Pto komplisert som en modell, men den samme protokollen kan lett brukes på RLKs fra N. benthamiana og A. thaliana 53 med små modifikasjoner som vi beskriver i protokollen.
Belyse den mekanismen av reseptor aktivering av PAMPs og effektbokser kan i stor grad bidra til vår forståelse av plante immunitet. I de siste 20 årene, har genetiske og gjær to-hybrid-skjermer vært medvirkende for oppdagelsen av PRRs og NB-LRR proteiner. Mer nylig har massespektrometri-baserte protokoller er etablert for identifisering av proteiner regulert forskjellig i løpet av immunsignale 55-58, deres PTMs 11,33,59,60, mål sammensetningen av immunkomplekser 61 og effektor 62. Her beskriver vi en enkel protokoll for identifisering av PTMs regulerer aktiveringen av immunkomplekser.
Sammenlignet med tidligere beskrevet protokoller, gjør denne protokollen detaljert identifisering av dynamiske endringer av PTMs. Protokoller av store proteomikk tilnærminger kan identifisere PTMs av proteiner, men er ikke i stand til å avsløre nettstedet plastisitet PTMs grunn til å begrenseed mengder protein. I tilfellet med protein-fosforylering, storskala proteomikk metoder vanligvis bare identifisere de dominerende fosforylering områder 11,33,59. Den detaljert karakterisering av et protein phosphorylation status krever en betydelig mengde protein som kan oppnås bare ved delvis rensing av målproteinet 47.. Protokollen er beskrevet her par en proteinrensing tilnærming som gir en vesentlig mengde av målproteinet, med massespektrometri-analyse av det rensede protein. Etter denne protokollen, ble singelen fosforylering ved Pto tilskrives hovedsakelig til Ser-198 som tidligere beskrevet 52, men noen massespektrometri spektra også støttet en enkelt fosforylering hendelse på Thr-195 eller Thr-199. Når doble fosforylering hendelsene i Pto ble observert, den dominerende kombinasjon av fosforylerte aminosyrer var Ser-198 og Thr-199 selv om kombinasjoner på andre nettsteder ble også observert (Tabell 1). Disse resultatene viser klart den fosforyleringssetet plastisitet av proteinkinaser, og evnen av den beskrevne protokoll for å karakterisere i detaljer alle mulige fosforylering områder.
De mest kritiske trinn av denne protokoll er: 1) tilstrekkelig til utvinning av proteiner, 2) beskyttelse av PTMs, og 3) tilstrekkelig mengde av målproteinet. Først, for tilstrekkelig utvinning av proteiner, er det viktig å slipe vevet i flytende nitrogen, og deretter å benytte en vev-homogenisator som beskrevet i protokollen. Hvis en vevshomogenisator ikke er tilgjengelig, kan en morter benyttes. Det er også viktig å benytte et forhold på 2:59 (eller fire) av gram vev til volum av ekstraksjonsbuffer. Dette vevet til buffer-forhold og høy styrke buffer som foreslår vi vil sikre at pH-verdien forblir nøytral under utpakkingen. Vi har funnet at dette er av spesiell betydning for A. thaliana og tomat ekstractions 52. Beskyttelse av PTMs kan oppnås ved å inkludere i alle buffere egnede inhibitorer for enzymer som kan fjerne PTMs. Det er også viktig å utføre alle trinnene ved 4 ° C, og for å prechill buffere og instrumenter. Høyere utbytter av målprotein kan oppnås ved hjelp av planter som uttrykker proteinet i tilstrekkelige mengder, og ved å bruke store mengder av vev (ca. 20 g). Den mest avgjørende trinn for oppnåelse av tilstrekkelige mengder av målproteinet konsentrerer målproteinet ved direkte immunoutfelling. Betydningen av dette trinnet er markert med vår manglende evne til å identifisere PTMs til kraftuttaket etter en Prf immunoprecipitation grunn av den begrensede mengden av coimmunoprecipitated Pto (figur 2B). I motsetning til dette direkte immunoutfelling av Pto ga vesentlig mer målbare peptider (figur 2C) som fører til omtrent 80% dekning av proteinsekvensen og identifisering av PTMs (tabell 1). Vi har også strongly anbefaler bruk av epitop-koder for protein immunoprecipitation. Sammenlignet med antistoffer dannet mot naturlig proteiner epitop-merker affinitet matrise kan gi høyere mengder av delvis renset protein. Ved å bruke et antistoff reist mot innfødte Pto protein 51 (Figur 2A) for immunoprecipitation, var vi i stand til å identifisere bare én fosforylering av de to dominerende fosforylering områder av Pto.
Denne protokollen er primært utviklet for delvis rensing av N. benthamiana cytoplasmatisk protein og påfølgende identifisering av sine fosforylering sider. Men ved hjelp av modifikasjoner som er beskrevet her, denne protokollen kan enkelt tilpasses for A. thaliana proteiner og membran bundet proteiner. Hovedmålet med denne protokollen er å gi tilstrekkelige mengder av målproteinet for identifikasjon av PTMs og ikke for å oppnå den høyeste renhet av komplekset. Hvis høyere renhetav komplekset kreves et andre trinn av rensing kan bli lagt til denne protokoll 52. I så fall vil et første trinn tillater eluering av målprotein fra affinitet matrisen uten bruk av høye salter eller syre og den etterfølgende trinnet kan medføre en matrise, som krever sterke eluering forhold. Det er viktig å understreke at vi kun har testet denne protokollen for identifisering av fosforylering områder og at vi tester nå sin evne til detaljert identifisering av ytterligere PTMs.
Våre representative resultater viser klart den fosforyleringssetet plastisitet av proteinkinaser, og evnen av den beskrevne protokoll for å karakter fosforylering sider. Det viktigste er å markere de at identifisering av fosforylering sider er avhengige i lav mengde av proteiner ved massespektrometri og ved enkeltpunktmutasjoner i auto-fosforylering områder kan gi forvirrende resultater. Vi viser her og tidligere 47 </sup> Som dobbel fosforylering av Pto i Ser-198 og Thr-199 er forbundet med aktiveringen av Prf / Pto kompleks. I kontrast, har tidligere publiserte resultater 47,63 vist at enslige punktmutasjoner av Ser-198 og Thr-199 til alanine, som hindrer fosforylering på disse nettstedene, er i stand til å signalisere noe som tyder på at fosforylering av disse nettstedene er ikke en forutsetning for kompleks aktivering . Disse resultatene kan nå forklares ved fosforylering av sekundærside Thr-195. Lignende innsikt i fosforyleringssetet plastisitet av andre protein-kinase kan bli oppnådd ved å følge denne protokoll. Videre er en kombinert metode ved hjelp av fosforylering sider punktmutasjoner, proteiner som inhiberer spesifikke kinaser (effektorer) kombinert med protein immunoutfelling og massespektrometri-analyse vil føre til en bedre forståelse av den evolusjonære betydning fosforyleringssetet plastisitet hos proteinkinaser.
The authors have nothing to disclose.
VN er støttet av Royal Society. JPR er en australsk Forskningsrådet Future Fellow (FT0992129). Vi takker Dr. Miriam Gifford for kritisk lesing av manuskriptet.
MgCl2 | Sigma | M8266 | |
MES | Sigma | M8250 | |
Acetosyringone | Sigma | D134406 | toxic – 1 M stock in DMSO |
Syringe 1mL sterile | Terumo | ||
Syringe needle | Terumo | NN-2525R | |
Silwet L-77 (surfactant) | Lehle Seeds | VIS-01 | toxic |
MG-132 (Z-Leu-Leu-Leu-al) | Sigma | C2211 | 1 M stock in DMSO, store at -80 °C |
MS salts | Sigma | M5524 | oxidizing, toxic |
Sucrose | Sigma | 16104 | |
Trizma base | Sigma | T1503 | adjust pH with 1 N HCl to make 1 M Tris-HCl buffer |
NaCl | Sigma | S3014 | 5 M stock |
EDTA | Sigma | E6758 | toxic – 0.5 M stock |
EGTA | Sigma | E4378 | |
Glycerol | National Diagnostics | EC-606 | |
IGEPAL CA-630 | Sigma | I8896 | corrosive |
PVPP (polyvinylpolypyrrolidone) | Sigma | P5288 | do not confuse with PVP |
DTT (DL-dithiothreitol) | Sigma | 43815 | toxic – 1 M stock, store at -20 °C |
Plant protease inhibitor cocktail | Sigma | P9599 | do not freeze/thaw too many times |
PMSF (phenylmethylsulfonyl fluoride) | Sigma | P7626 | corrosive, toxic |
Calyculin A | Cell Signaling Technology | 9902 | |
Sodium Fluoride (NaF) | Sigma | S7920 | toxic – 1 M stock |
Sodium Molybdate (Na2MoO4) | Sigma | S6646 | 0.5 M stock |
Sodium orthovanadate (Na3VO4) | Sigma | 450243 | toxic – Prepare a 200 mM solution of sodium orthovanadate. Adjust the pH to 10.0 using either 1N NaOH or 1N HCl. The starting pH of the sodium orthovanadate solution may vary with lots of the chemical. At pH 10.0 the solution will be yellow. Boil the solution until it turns colorless (approximately 10 minutes). Cool to room temperature.Readjust the pH to 10.0 and repeat steps 3 and 4 until the solution remains colorless and the pH stabilizes at 10.0. |
Okadaic acid | Santa Cruz Biotechnology | sc-3513 | |
Kinematica Polytron tissue homogeniser | Fisher Scientific | 08-451-320 | |
Miracloth | Merck Millipore | 475855-1R | |
anti-FLAG M2 agarose | Sigma | A2220 | this matrix is recommended |
Streptavidin-agarose | Thermo-Scientific | 20347 | this matrix is recommended |
GFP-Trap_A | Chromotek | gta-20 | this matrix is recommended |
Anti-HA-Agarose | Sigma | A2095 | this matrix is recommended |
0.45 μm filter | VWR | 513-1902 | |
BSA | Sigma | A7906 | |
FLAG peptide | Sigma | F3290 | |
D-biotin | Sigma | 47868 | |
StrataClean resin | Agilent | 400714 | this absorption resin is recommended for protein precipitation |
Mini-PROTEAN Tetra Cell | Biorad | ||
PROTEAN II XL Cell | Biorad | ||
SimplyBlue SafeStain | Invitrogen | LC6060 | this stain is recommended |
Protein low-binding tubes (LoBind) | Eppendorf | 0030 108.116 | these tubes are recommended |
Ammonium bicarbonate (ABC) | Sigma | 9830 | toxic |
Acetonitrile | VWR | 83639 | toxic, flammable |
2-chloroacetamide | Sigma | 22790 | toxic |
Trypsin | Promega | V5280 | irritant, sensitizing |
Formic acid | Sigma | 14265 | toxic, corrosive |
Water-bath sonicator | Ultravawe | Ultra BT Ultrasonic Bath | |
LTQ-Orbitrap XL | Thermo-Scientific | ||
Trichostatin A | Sigma | T8552 | toxic |