微細加工チャネルにおける細胞移動の研究

Summary

一次元閉じ込められた微小環境における細胞の自発的な遊走を研究するための定量的方法が記載されている。この方法は、微細加工されたチャネルを利用し、単一の実験では、異なる条件下で多数の細胞の遊走を研​​究するために使用することができる。

Abstract

ここで説明する方法は、1次元での閉じ込め下で細胞遊走の研究を可能にする。これは、物理的な制約によって細胞に偏光された表現型を与える微細加工されたチャネルの使用に基づいている。前後に移動：内部のチャンネルと、細胞は2つの可能性を持っている。指向性が制限され、この簡略化は、細胞遊走の自動追跡および細胞移動を説明するための定量的なパラメータの抽出を容易にする。これらのパラメータは、運動中の細胞の速度、方向の変化、一時停止が含まれる。マイクロチャネルはまた、蛍光マーカーの使用と互換性があり、したがって、高解像度での細胞移動の際に細胞内小器官及び構造の局在化を研究するのに適している。最後に、チャネルの表面は、チャネルまたは走触性の研究の粘着特性の制御を可能にする、異なる基質で官能化することができる。要約すると、システム時間記載やがては独立した実験の標準化と再現性を容易にする、幾何学的形状と環境の生化学的性質の両方が制御された条件で大細胞数の移動を分析することを意図している。

Introduction

マイグレーションは、開発、免疫応答および組織再生を含む多細胞生物における多くの生理学的プロセスに重要である複雑な細胞機能である。また、このような腫瘍の浸潤および転移などの特定の病的状態は、細胞運動性¹に依存している。これらの理由から、細胞遊走、基本および翻訳の両方の研究との関連で研究の主要な分野となっている。 インビボでは 、ほとんどの組織が ​​豊富な細胞外マトリックスおよび高細胞密度によって特徴付けられる。細胞移動は、従って、生理的条件下で、複雑な閉じ込められた環境で発生する。古典的には、最も可能性の高い歴史的な理由や技術的な限界のために、細胞移動は、監禁などの組織に見られる環境プロパティの多くを再現していないフラットな2D系で研究されている。また、2Dでの運動性のために必須である細胞接着などの要因は、最近necessaではないことを示したされていますRILY 2Dにし、他の環境での細胞運動を支配する機構は²異なっていることを示唆し、 生体内でまたはゲルの内部移行に必要。いくつかのシステムは、細胞外マトリックス組成物³の特性をrecapitulating目指す組織の複雑な性質、最も有名なものコラーゲンゲルを模倣するために開発されている。ここでは、限られた環境下で1次元での研究細胞移動を可能にする簡単な補完的な方法として、マイクロチャネルを提案する。

このシステムでは細胞は、それらが自然に入るその中にマイクロチャネルに沿って移動する。遊走細胞はその後、おそらくそれらの極性を強化管状ジオメトリを採用し、チャンネルの形状を取得する。チャネル内のセルの直線運動は、自動細胞追跡実験からの定量パラメータの抽出を可能にする。技術的な観点から、このシステムは、簡単で柔軟性があります。 coatinチャネル壁のgを操作することができ、チャネルのサイズおよび形状を適合させることができ、多数のセルは、単一の実験で分析することができる。このシステムはまた、スケールアップすることができる細胞の運動性に関与する分子の中距離スクリーン解析を実行する。ここで説明するプロトコルは、細胞モデルとして樹状細胞（DC）を用いて標準化されている。彼らは^4。 インビトロ 、DCは自然発生的に限られた環境の中を移動することが示されている特異的な免疫応答の開始と維持に参加し、したがって、マイクロチャネル^5,6に細胞運動を研究するための優れたモデルであるように、これらの細胞は、免疫システムの鍵となる。重要なことに、このシステムは、Tリンパ球、好中球、または腫瘍細胞を^7-9などの他の運動性の細胞型の遊走を分析するために拡張することができる。

Protocol

重要な注意：このプロトコルは、希望するマイクロチャネルのための形状を含む、型が既に行われていることを前提としています。金型の調製に関するさらなる情報は既に^10を出版されました。このプロトコルはまた、骨髄DCは文化が知られていることを前提としています。

1。チップ製造

1. プラスチックカップ中の重量比10:1でPDMS油及び硬化剤を混合する。徹底的に両方の化合物を混ぜて。
2. 金型ベアリングマイクロチャネル上でミックスをキャスト。全体の高さは0.5〜1センチメートルの間でなければなりません。
3. 1時間の間に真空ジャーベルで気泡を除去。
4. 65℃で2時間オーブンで後者を配置することによって、金型で硬化PDMS
5. PDMSは、室温であると、外科用ブレードを用いて構造の周りに大きな部分をカットして、金型（ 図1A）からそれをはがす。
6. 細胞は（通常は2ミリメートル）を注入し、PDMSのサイズを変更されるドリル穴移行が評価されるであろうガラスボトムディッシュ（ 図1B）のサイズに合わせて、外科ブレード。先に進む前に、レンズクリーニングペーパーを使って皿から残っている埃を取り除きます。これは、ステップ1.10に記載のガラスへのPDMSの結合を促進する。
7. 構造側に粘着テープを貼り付けし、剥離することによりチャネルを含むサイズ変更PDMSチップを清掃してください。
8. 粉塵及びPDMS小粒子を除去するために70％エタノール中でPDMS片を30秒間超音波処理する。きれいな空気を吹き付けて、その後すぐにそれらを乾燥させます。
9. 300トルで30秒の間にプラズマ処理空気（または酸素）によって、PDMS（上向き構造体）と培養皿をアクティブにします。
10. 恒久的に基板に、PDMSを固執する接触の両方で活性化された表面に置きます。必要に応じて、ポリマーおよびディッシュ（ 図1C）のガラスとの間の接触を強制的にPDMSの上に少し押して、金属鉗子を使用しています。
11. 65°CのFOのオーブンでチップをインキュベート結合を強化するため、R 1時間。

2。マイクロチャネルのコーティング

1. 1分間300トルで空気プラズマにより全体構成をアクティブにします。これは次のステップのチャンネルへの液体の侵入を推進していきます。
2. 水中で10μg/ mlので急速にフィブロネクチンとチップのエントリ穴を埋める。例えば、PEGのような他の基質は、チャネル壁への細胞接着を修飾するために使用することができる。液体は全体の構造全体に広がることを注意してください。これは簡単に、通常の光の下または通常の明視野顕微鏡を用いて目で確認することができます。
   NOTE：拡散が困難になっている、非常に小さい構造では、チャネル内の液体の侵入を少なくとも15分の間に真空ジャーベル構造を配置することによって強制することができる。コーティング蛍光基質の効率を検証する（ 図2）を用いることができる。
3. フィブロネクチンの吸着または任意の他のコーティングにsubstを可能にするために室温で1時間インキュベートチャネルの壁に対する割合。
4. 構造が非結合基材を除去するために、PBSで3回洗浄します。
5. 洗浄後、議定書3に進むか、後で使用する（24時間の最大値）、4℃でチップを格納します。

3。セル負荷

1. プレートからPBSを除去して、細胞培地でマイクロシステムを埋める。媒体とのチャネルを飽和させるために1時間インキュベートしてみましょう。
   注：分子阻害剤のような薬物を含む実験のためには、右の濃度の薬剤を含む培地でチャンネルをプレインキュベートすることをお勧めします。さらに、いくつかの薬物は、有効濃度を低下させるPDMS構造体に可溶化する傾向がある。一部のソリューションは、この問題^11-12に対抗するために提案されている。
2. 浮遊DCを削除し、培養液でフラッシュすることにより、半接着細胞を回収する。血球計数器を用いて細胞を数える。
   注：核イメージングでは、ヘキスト33342染色はインで事前に達成することができ完全培地中の200 ng / mlの時に染料と30分の間に2×10 ⁶の細胞をcubating。プロトコルを続行する前に色素の過剰を取り除くために遠心分離により二回洗浄します。
3. 5分（時間および速度は細胞の種類に応じて異なっていてもよい）中に300×gで細胞を遠心し、培地を捨てる。 20×10 ⁶細胞/ mlの濃度に達するようにペレットを希釈する。
4. プレートから培地の過剰を削除し、マイクロピペットを用いて、PDMS構造のエントリの穴を空にします。各エントリの穴に1×10 ^5個の細胞の量に到達するために細胞溶液5μlのエントリを入力します。
   NOTE：高細胞密度は、チャネルによる細胞の接触に有利に働くことが要求される。低細胞密度は、チャネルと、実験の失敗の内側の細胞の少数をもたらし得る。
5. インキュベーター内で37℃で30分間、マイクロチップをインキュベートする。実験皿に完全培地の2ミリリットルを追加します。
   注：全体のPDMS構造は、bになりませんeは実験中の細胞の乾燥を避けるために覆わ。 2mlの十分でない場合、完全にPDMS構造体を覆うように、より多くの培地を加える。

4。イメージング

1. 顕微鏡下のプレートを配置する前にレンズクリーニングティッシュと料理の外部底面を清掃してください。
2. 多数の細胞内移行を分析するには、CO ₂と温度を装備ビデオ顕微鏡で10倍と広い視野照明（ 図3）を使用します。細胞追跡を容易にするために、ヘキスト染色およびUV光は（ステップ3.2参照）を使用することができる。移行は、移行​​中に細胞構造の高解像度を得るために、共焦点顕微鏡を用いて分析することができる。
3. 10Xのタイムラプス顕微鏡検査のために、期待されるセル速度（5ミクロン/分の速度で移行した樹状細胞のため、通常2分）に応じた時間周波数を選択します。
   注：ここに記載されているプロトコルは、nを行いますオトは、細胞遊走パラメータの分析を含む。いくつかのポイントは、時間経過の映画から情報を抽出するためにどのように進めるかについて、読者に助言するために議論に記載されています。

Representative Results

各実験において、PDMSの表面は。前と（ステップ2.4）で洗浄した後、図2に示す蛍光分子、PLL-gの-PEGでコーティングされたチャネルを図調査の関心に適合分子でコーティングされる。このような実験は、チャンネル内のコーティングの均一性を制御することができる。

セルの負荷後に、ビデオ顕微鏡は、細胞移動に追従して行うことができる。 図3Aは、DC細胞を追跡するために適切な密度でマイクロチャネルに移行する場合の例を示している。位相コントラストおよびヘキスト染色の両方は、（説明を参照）は、この目的のために使用することができる。技術は、より高い解像度で、蛍光共焦点顕微鏡と互換性があり、細胞小器官または細胞構造を追跡するために使用することができる。 図4Bは LifeActGFPを発現するDCを移行中の重合アクチンの動的な一例を示す。

細胞の定量化の例DCを移行中で分析運動性を図5に示す。 図5（a）は、WTまたはY27632処理したDCから生成kymographsを示しています。 Y27632は、細胞収縮および遊走の十分に特徴付け阻害剤であり、速度の変化を検出するシステムの能力を検証するために使用した。 kymographsはさらに、異なるパラメータの研究は、細胞移動を記述することができ、時間の関数としての細胞の位置および大きさを抽出するために分析することができる。 図5Bは、自家製のソフトウェア^13を使用して、核の位置決めを撮像して追跡移動の速度を示している。 DCは6ミクロン/分に近い平均速度を持っている。 Y27632による治療は、大幅に速度が低下します。この例では、単一の実験で多数の細胞の定量および薬物治療によって誘導される差異を検出するためのシステムの有用性を可能にする技術のパワーを示している。これは、siRNAの使用およびモルのスクリーニングに拡張することができる cules移行の制御に関与する。

図1。チャンネルアセンブリのステップ。PDMSチップは、チャネル型から複製された。 （A）チャネルを含むチップを金型から直接抽出した。 （B）実験皿穴に合わせてサイズ変更チップは、細胞の侵入を可能としました。 （C）チップは、最終的にガラス皿の上に貼り付けた。 （DおよびE）装置の概略図。 （D）は上面図。 （E）は側面図。緑色のオブジェクトは、チャンネルまたはアウト（青）セルを表す。 1cmのバーです。

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図2。蛍光基質とのチャンネルのコーティング。（A）1時間の間に100μgの/ mlの蛍光PEGとインキュベート5ミクロン×5ミクロンのチャンネル。 （B）のチャンネルのPBS洗浄後の残存蛍光PEGのイメージの代表。 50μmのバー。

図3。マイクロチャネルに沿って移動する細胞。位相コントラスト（グレー）と5ミクロン×5ミクロン微細加工チャネルに移動する細胞の核染色（青）。 （A）チャネルに沿って移行したDCのムービーから抽出された一枚の画像。 （B）モンタージュは、選択範囲の変位を示すテッドDCがチャネルに沿って移行する。白い矢印は、移動する細胞を示す。タイムスケール1 IMG / 2分。 50μmのバー。

図4マイクロチャネルの中の高解像度細胞の例。単一のマイクロチャンネルに沿って移行するDCの高分解能イメージング。マイクロチャネル中を移動するDCの位相差像の（A）モンタージュ（1 img/20秒）（100×倍率）。 （B）は 、DCのモンタージュ蛍光イメージング（1 img/20秒、60X倍率、単一の光セクション）を使ってシステムの互換性を示すlifeact（ハイライト重合したアクチン）を発現する。重合アクチンは黒で示されている。チャネルサイズ10μm幅×高さ5μm。 10μmのバー。

図5。マイクロチャネルに沿って移行するDCの代表的な結果。この図は、マイクロチャネルに沿って移動している細胞の映画から行うことができます分析の種類を示している。 図5（a）は、WTまたはに移行Y27632処理したDCのタイムラプス位相コントラスト画像から生成kymographsを示していますマイクロチャネル（10×、1 IMG / 2分）。 図5Bは、ヘキスト染色、自家製ソフトウェア^13を使用して、DC核を追跡した後に得られる細胞の速度の定量化の例を示しています。データは、ノンパラメトリックt検定（マン - ホイットニー検定）を使用して分析する。 100μmのバー。

Discussion

ここでは、単一の実験で多数の細胞の遊走特性を研究するための方法として、マイクロチャネルからなる装置を記載している。この実験系は、内因性の遊走細胞によって組織に見閉じ込められた環境制約を模倣。しかし、単一の次元に移行を強制することにより、自動細胞追跡とmeasurablesの抽出（ 図5）を容易にします。我々はまた、我々のデバイスは、蛍光顕微鏡と互換性があり、従って、細胞運動性（ 図4）の異なる段階の間、細胞小器官の位置を研究するために適合させることができることを示している。

プロトコル内の重要なステップは、チャネルの品質です。これは、ガラス表面にPDMSの良い付着を制御することが重要である。スティッキングのトラブルが表示されたら最初に確認する事が両面の清潔さとプラズマクリーナーの一つです。重要であり得る他のパラメータは、目でロードされた細胞の電子密度。自発的遊走は、チューブへの侵入を容易にするために、チャネルへの細胞の近接を必要とし、最適な数は、各細胞型について評価すべきである。

一例として、我々は、DCの自発的な遊走を示したが、システムは他の細胞型の遊走を分析するために使用することができる。研究室では、一次Tリンパ球、マクロファージならびに腫瘍細胞株（データは示されていないと参照^7-9）試験した。

チャネル内の細胞遊走を分析するために、2つの主要なプロトコルが試験されている。最初は、位相コントラスト（10倍）により撮影を必要とし、細胞を^3（ 図5A）からの移行を自動的に検出し、kymographsの生成に基づいている。速度、細胞の大きさおよび持続性は、とりわけ、kymographsから抽出することができるパラメータである。このシステムは、kymographsの品質によってとの開発に限定されているそれらを生成し、分析するためのソフトウェア。データを定量化するための第二の、より簡単な方法は、ヘキスト染色（ 図3）を使用して、核の半自動化の追跡に基づいています。蛍光の使用は、標準的なイメージングソフトウェアと移動の追跡と分析を可能にする。このような戦略の例は、最初の世界セルレース¹²のために開発されました。

PDMSの表面は実質的に任意のタンパク質を吸着することができることを考えると、マイクロチャネルは、細胞遊走における細胞外マトリックスタンパク質の影響を評価するために使用することができる。チャネルの幾何学的形状はまた、細胞遊走における物理的制約の影響の研究を容易に改変することができる。

最後に、この実験系は、単一の実験において、いくつかの条件を取得するように適合させることができる。これは、一緒に半自動化分析と、関与する新たな役者の発見のための中スループットスクリーニングに対応しています癌細胞の移動中のd。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Polydimethylsiloxane (PDMS)	GE Silicones	RTV615	Package of 90% silicone base and 10% curing agent
Core sample cutter	Ted Pella Int.	Harris Uni-Core	Diameter 2.5 mm
Glass-bottom dish	WPI	Fluorodish FD 35-100
Ultrasonic cleaner	Branson Ultrasonics	Branson 200
Plasma cleaner	Harrick Plasma	PDC 32 G	For small samples (35 dishes). A bigger version is also available
Fibronectin from bovine plasma	Sigma Aldrich	F0895
PolyLysine grafted PEG (Pll-g-PEG)	Susos	PLL(20)-g[3.5]-PEG(5)
Hoechst 33342	Sigma Aldrich	B2261
Y27632	TOCRIS	1254