Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

تصور من قبل المناعية المشبك المزدوج اللون التوقيت بوابات-الانبعاث المستحث استنفاد (STED) Nanoscopy

Published: March 24, 2014 doi: 10.3791/51100
Automatic Translation
1, 1
1Center for Human Immunobiology, Texas Children's Hospital and Baylor College of Medicine

Summary

نحن هنا توضيح بروتوكول للتصوير من قبل اثنين من الألوان STED nanoscopy والسامة للخلايا المشبك المناعي للخلايا NK لخص على الزجاج. باستخدام هذه الطريقة نحصل على شبه قرار 100 نيوتن متر من البروتينات المشبك والهيكل الخلوي.

Abstract

الخلايا القاتلة الطبيعية تشكل ينظم بإحكام، المشابك المناعية دقيقا (IS) من أجل ليز الخلايا المصابة فيروسي أو مكون للأورام. ديناميكية الأكتين إعادة تنظيم أمر بالغ الأهمية لوظيفة الخلايا القاتلة الطبيعية وتشكيل IS. التصوير من F-الأكتين في المشبك وقد استخدمت تقليديا المجهري متحد البؤر، ولكن الحد حيود الضوء يقيد حل مضان المجهري، بما في ذلك متحد البؤر، إلى ما يقرب من 200 نانومتر. وقد مكنت التطورات الحديثة في تكنولوجيا التصوير تطوير subdiffraction محدودة فائقة التصوير القرار. من أجل تصور العمارة F-الأكتين في IS نحن ألخص NK السامة للخلايا خلية المشبك من خلال الالتزام خلايا NK لتفعيل مستقبلات على الزجاج. نحن ثم البروتينات صورة ذات الاهتمام باستخدام اللونين استنزاف الانبعاث المستحث المجهري (STED). هذه النتائج في <80 نانومتر قرار في المشبك. هنا نحن تصف خطوات إعداد العينات والحصول على الصور باستخدام عمود مزدوجأو STED nanoscopy لتصور F-الأكتين في NK IS. نحن أيضا توضيح الأمثل من اقتناء العينة باستخدام برامج لايكا SP8 وSTED بوابات الوقت. أخيرا، ونحن الاستفادة هيغنز برامج لمرحلة ما بعد المعالجة deconvolution من الصور.

Introduction

المشبك المناعية هو بيئة معقدة من الإشارات البروتينات والعناصر هيكل الخلية. وقد وصفت المشبك لحل الخلايا أصلا بأنها "الثيران العين" مثل هيكل مع حلقة من الأكتين والتصاق جزيئات المحيطة مجال إفرازية المركزي 1-4. ومع ذلك، ونحن نعلم الآن أنه يتكون من المجالات المجهرية من إشارات النشطة التي تتطلب إعادة تنظيم هيكل الخلية الحيوية المستمر من أجل وظيفة 5-11. استمدت الكثير من المعلومات التي لدينا الآن حوالي المشبك من المجهري، وكانت المناعة الأوائل من تكنولوجيا التصوير المتطورة.

واحدة من هذه التكنولوجيا هو رواية فائقة القرار المجهري. المجهر الضوئي التقليدية محدودة مكانيا من قبل حاجز حيود الضوء، والذي يحدد الحد الأدنى من القرار لجميع المجهري مضان، بما في ذلك متحد البؤر، في حوالي 200 نانومتر. في السنوات الأخيرة، كانت عدة تقنيات المطورد التي تسمح القرار دون حاجز الحيود. وتشمل هذه الانبعاثات التحفيز استنزاف المجهري (STED)، منظم المجهري الإضاءة (SIM)، المجهري حل عشوائيا (STORM)، والمجهر الضوئي photoactivatable (النخيل). وقد تم استعراض هذه التقنيات بالتفصيل في مكان آخر 12-15، ولكن ترد أدناه. يتم إنشاء Subdiffraction القرار محدودة بطرق فريدة من نوعها في كل نظام. اختيار تقنية فائقة الدقة، وبالتالي، يجب أن تمليها التجربة والنظام التجريبي من الفائدة.

ويتحقق القرار السوبر STED باستخدام عالية الكثافة torroidal استنزاف شعاع التي انتقائي "الصمت" مضان حول كل fluorophore من الفائدة التالية الإثارة، مما أدى إلى subdiffraction محدودة المجهري مضان 16-18. ميزة واحدة من STED هو أن الحصول على الصور سريعا ويتطلب القليل نسبيا مرحلة ما بعد المعالجة. في حين أملت اختيار صبغة من المواصفاتموقف ترال من شعاع نضوب، والتي تقع في النظام المتوفرة تجاريا في 592 نانومتر، تتوفر العديد من الأصباغ المتاحة تجاريا التي تجعل مجموعات من اثنين fluorophores ممكن. بالإضافة إلى ذلك، تستخدم عادة للصحفيين الفلورسنت مثل GFP يمكن تصويرها، مما يجعل التجارب الخلية الحية ممكن 19،20.

وقد استخدمنا في السابق STED لتحديد مناطق hypodensity F-الأكتين التي تستخدم من قبل خلايا NK للتحبب 21،22 وكميا. نقترح أن STED هو خيار جيد لتصوير المشبك المناعي، نظرا لتوافر مرونة نسبيا من fluorophores وتحسين متفوقة في القرار في محور س ص. بالإضافة إلى ذلك، على النظام STED المتاحة تجاريا تستخدم لهذه التجارب، واستخدام سرعة عالية (12،000 هرتز) الماسح الضوئي صدى يسمح لسرعة اقتناء الصور مع الحد الأدنى من الضرر لعينات. وتعتبر مرونة محدودة في اختيار صبغة وضع غير مؤات من STED 12،ولكن اللون المزدوج STED واضح ومباشر نسبيا مع العديد من fluorophores متاحة تجاريا. دمج STED مع المجهر متحد البؤر المسح الضوئي ليزر يسمح أيضا للتصوير متحد البؤر إضافية في تركيبة مع STED، وذلك في حين STED يقتصر على قناتين، وهياكل إضافية يمكن تصويرها في متحد البؤر مع قرار من حوالي 200 نانومتر (E. الصولجان، والملاحظات غير منشورة ). في حين وصفنا استخدام STED لتصوير الخلايا المناعية، يتم تطبيق هذه التكنولوجيا لمجموعة متنوعة من أنواع الخلايا، بما في ذلك الخلايا العصبية، وتصور مجموعة متنوعة من هياكل الخلية 23-26.

يستخدم SIM نهجا مختلفا لتوليد صور محدودة subdiffraction. من خلال وضع تصور أنماط الإثارة الدورية المعروفة، ومن ثم يمكن الحصول على معلومات حول بنية مجهولة تجري دراستها التالية التحول الرياضية 27. هذا ينتج زيادة في القرار إلى ~ 100 نانومتر أفقيا 28،29. ميزة SIM هو أنه طو متوافق مع جميع الأصباغ متحد البؤر القياسية وتحقيقات، ولكن العيب هو أنه أبطأ بكثير للحصول على الصور وهذه تتطلب مطولة مرحلة ما بعد المعالجة 12. وهذا يحد أيضا استخدامه لتصوير الخلايا الحية.

أخيرا، يمكن أن تتولد الصور فائقة الدقة من العشوائية الصور التحول من fluorophores. يتم استغلال هذا النهج في تنشيط الصورة توطين المجهري (النخيل) ومؤشر ستوكاستيك المجهر إعادة الإعمار البصرية (STORM). عن طريق المسح الضوئي لقطة كاميرا متعددة وتوطين الجزيئات تفعيلها بشكل عشوائي التي تحولت "على" و "خارج" مع مرور الوقت، يتم إنشاء الصور مع قرار 20-30 نانومتر من الأطر المتراكمة 30-32. المفاضلة لهذا القرار هو الوقت اللازم للحصول على الصور.

نحن هنا تظهر، في التفاصيل، وبروتوكول لإعداد وتصوير عينات اللون المزدوج في STED. في هذا النظام، هو الإثارة مع نابض، الانضباطي، ضوء الليزر الأبيض. نظرا لطبيعةمن الإثارة شعاع نابض، يرصد الوقت النابضة الكشف ممكن، والمزيد من الزيادات القرار. بالإضافة إلى ذلك، تم تجهيز نظام مع الجادولينيوم الهجين (HYD) كشف، والتي هي أكثر حساسية من أنابيب مضخم التقليدية، وبالتالي السماح لانخفاض متطلبات الطاقة الليزر. يتم تطبيق شعاع استنزاف لSTED مستمر ويتم ضبطها إلى 592 نانومتر، والتي سوف تملي اختيار الأصباغ المتاحة لهما اللون STED. تركيبات الصبغة المستخدمة عادة تشمل عموما واحد منفعل من قبل 488 نانومتر (مثل اليكسا فلور 488، أوريغون الأخضر، DyLights الأخضر، أو كروميو 488) واحد منفعل من قبل 458 نانومتر (مثل البرتقال أو المحيط الهادئ الأفق V500). وهكذا، في حين كشف عن الأصباغ اثنين سيكون في نطاق مماثل (وكلاهما يمكن الوصول إليها بواسطة الليزر استنزاف)، سوف تحدث الإثارة مع أطوال موجية مختلفة. مع الانضباطي الأبيض ضوء الليزر والانضباطي للكشف عن، وتعظيم إشارة حين القضاء على التداخل الطيفي مصنوع من السهل إلى حد ما. على هذا النحو، كان لدينا نجاح جيدة مع combinatأيونات الأصباغ المتاحة تجاريا، مثل البرتقال والمحيط الهادئ اليكسا فلور 488 (المستخدمة هنا). تم تصميم بروتوكول لدينا نحو ويصف تقييم خلايا NK الإنسان الذي يمثل التركيز التاريخية من مختبرنا. نحن على وجه التحديد استخدام خط الخلية NK92 في هذا المثال لأن ذلك هو واحد ونحن قد طبقت بشكل منتظم في منطقتنا 21،33 العمل التجريبي.

Protocol

1. Coverslips معطف مع الجسم المضاد

  1. Prewarm (عند 37 درجة مئوية) 30 مل من RPMI 10٪ FCS وسائل الإعلام 1 مل من BD Cytofix / Cytoperm.
  2. يعد حل من 5 ميكروغرام / مل من الأضداد المنقى في الفوسفات مخزنة المالحة (PBS). لتفعيل خط الخلية NK92، استخدام الألغام المضادة للCD18 ومكافحة NKp30 ينصح.
    1. علامة واحدة تقريبا عشرة سنتات دائرة الحجم لكل حالة على ساترة # 1.5 باستخدام القلم PAP. لتجربة اللون المزدوج، يجب أن يكون هناك أربعة شروط: غير ملوثين، ملطخة المزدوج، وشرطين الملون واحد. الاستغناء 200 ميكرولتر من محلول الأجسام المضادة في كل منطقة واحتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
    2. غسل coverslips بغمر بلطف كل واحد في 50 مل من برنامج تلفزيوني في أنبوب 50 مل المخروطية في درجة حرارة الغرفة. ينبغي أن يحدث الغسيل مباشرة قبل إضافة ينبغي أن تؤخذ الخلايا والحرص على تجنب تجفيف الجسم المضاد على ساترة.

2. تنشيط خلايا NK على الغلافزلات؛ فيكس وPermeabilize

  1. عزل 5 × 10 5 خلايا لكل NK92 الشرط. أجهزة الطرد المركزي وطاف صب. يغسل مرة واحدة مع 10 مل وسائل الاعلام prewarmed من الخطوة 1.1. أجهزة الطرد المركزي وطاف صب.
    1. خلايا resuspend في وسائل الاعلام prewarmed من الخطوة 1.1 بتركيز 2.5 × 10 6 / مل.
    2. صب بلطف 200 ميكرولتر من وسط المنطقة بإنشائه في قسم 1.2.1. احتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة في 5٪ CO 2. (ملاحظة: هذه المرة يمكن تمديدها أو ينقص تبعا لوظيفة بيولوجية من الفائدة للNK الخلية الحبيبية الاستقطاب، 20 دقيقة كافية).
  2. بعد حضانة الخلايا، وغسل بلطف coverslips بغمر كل في 50 مل من درجة حرارة الغرفة PBS في أنبوب 50 مل المخروطية.
  3. إضافة 1 ميكرولتر من تريتون X-100-1 مل من prewarmed حل فيكس / بيرم من الخطوة 1.1 ودوامة بدقة. إصلاح وpermeabilize بإضافة 200 ميكرولتر من فيكس / بيرم العازلة (الخطوة 2.3) إلى الخلايا. احتضان لمدة 10 مترفي في الظلام في درجة حرارة الغرفة.

3. خلايا وصمة عار

  1. إعداد تلطيخ العازلة: الفوسفات مخزنة المالحة (PBS)، 1٪ BSA، 0.1٪ سابونين.
    1. تحضير محلول الأجسام المضادة الأولية في 200 ميكرولتر تلطيخ العازلة (انظر الخطوة 3.1). (ملاحظة: يجب معاير الأجسام المضادة قبل استخدامها). تجنب استخدام الأجسام المضادة الأولية الذي يظهر في نفس الأنواع المستخدمة في معطف ساترة (الخطوة 1.2). أيضا تجنب الروابط Strepatividin البيوتين لSTED التصوير.
    2. 2.3.1 القسم التالي، وغسل بلطف coverslips في 50 مل تلطيخ العازلة. ربت حواف المنطقة PAP من ركلة جزاء مع مسحة القطن لإزالة العازلة الزائدة. تطبيق حل الأجسام المضادة التي تم إنشاؤها في القسم 3.1.1. احتضان 30 دقيقة في الظلام في درجة حرارة الغرفة. (الموصى به: احتضان coverslips في مربع الشريحة مع منشفة ورقية رطبة للحفاظ على الرطوبة).
  2. إعداد حل الضد الثانوية في 200 ميكرولتر تلطيخالعازلة. fluorophores الموصى بها اليكسا فلور 488، والمحيط الهادئ أورانج، وV500. عموما، وهو 1:200 التخفيف مناسبة لSTED التصوير.
    1. غسل بلطف coverslips في 50 مل تلطيخ العازلة. ربت حواف المنطقة PAP من ركلة جزاء مع مسحة القطن لإزالة العازلة الزائدة. تطبيق حل الضد الثانوية. احتضان 30 دقيقة في الظلام في درجة حرارة الغرفة.
  3. تكرار الغسيل وتلطيخ للبروتينات إضافية من الفائدة. إذا كشف F-الأكتين مع Phalloidin، وهذا يمكن أن تدرج مع الأجسام المضادة الثانوية، وعموما في التخفيف 1:200.

4. جبل Coverslips على الشرائح

  1. إعداد تصاعد المتوسط. ملاحظة: إطالة أو إطالة الذهب هي الأفضل. VECTASHIELD يجب تجنبها، لأنها ليست متوافقة مع STED. يجب تجنب 2،2-thiodioethanol إذا تم استخدام Phalloidin. Mowiol غير مقبول.
  2. وضع حوالي 10-20 ميكرولتر من تصاعد المتوسطة على شريحة. عكس ساترة (الجانب الخلية أسفل) وجبل ساترة بلطف، مع الحرص علىتجنب إدخال فقاعات الهواء. احتضان الشرائح لمدة 24 ساعة (ساترة متابعة) قبل التصوير.
  3. ختم حواف ساترة مع طلاء الأظافر.

5. الإعداد التجريبية

  1. بدء الليزر والبرمجيات اللازمة. بدء نضوب STED الليزر على الطاقة 100٪. محاذاة STED الليزر، والتي في حالة الأنظمة التجارية في كثير من الأحيان إجراء الآلي.
  2. تركيز العينة، التي تبدأ مع التحكم الملون واحد، على المجهر باستخدام العدسات.

6. تعظيم الاستفادة من إعدادات

  1. مسح القناة الأولى وتحسين قوة الليزر، موقف الإثارة شعاع ومجموعة كاشف. إذا كان ذلك ممكنا، تجنب كسب> 100. التقاط الصورة في متحد البؤر لتحسين الإعدادات. سوف الخط و / أو الإطار المتوسط ​​زيادة القرار. التحقق من وجود بكسل التشبع. ملاحظة: بعض التشبع هو مقبول في متحد البؤر عن تطبيق STED سوف يقلل من كثافة الانبعاثات. لSTED، وحجم البكسل يكون الأمثل أقل من 30 نانومتر كيفوسيتم الحصول على أفضل قرار من أي وقت مضى مع أحجام أصغر بكسل. فإن حجم المنطقة ذات الاهتمام التي يجري تصويرها تملي الحد الأدنى من حجم بكسل. أحجام بكسل أصغر قد تزيد photobleaching من.
    1. تطبيق STED استنزاف شعاع والتقاط الصور، بدءا من 50٪ استنزاف قوة الليزر. إذا رأيت تحسنا في القرار، ويمكن تطبيق أكثر استنزاف قوة الليزر. في هذه المرحلة، قد يكون من الضروري لضبط قوة الإثارة ليزر، خط المتوسط، و / أو مكسب.
    2. تطبيق الساعة النابضة للحد من الخلفية (الحد الأدنى 0.3 NSEC). ضبط الإعدادات حتى يمكن رؤية تحسن في القرار أكثر من متحد البؤر. قرار يمكن أن يقترب عن طريق تقدير كامل عرض نصف كحد أقصى (FWHM). هذا يمثل المسافة في نصف كثافة القصوى من ذروة التمويه إنشاؤها عن طريق رسم خط صورة عبر بنية الفائدة، وهي الطريقة المستخدمة على نطاق واسع لتقدير القرار.
    3. مرة واحدة القناة الأولى هي مرضية، والشروع في سلسلة ثانية لذاتهquential المسح. بشكل عام، فمن الأفضل أن تفحص أطول الطول الموجي fluorophore الأولى. كرر الخطوة 6.1 على القناة الثانية.
  2. تأكيد عدم وجود التداخل الطيفي بواسطة التصوير الملون الضوابط واحدة مع كل من تسلسل المسح الضوئي. يمكن تصحيح التداخل الطيفي باستخدام ميزات خفيفة لخلط الامم المتحدة الطيفية في البرنامج، ولكن يجب تجنب كلما كان ذلك ممكنا.

7. الحصول على الصور

  1. الحصول على صور. للتصوير الكمي، فمن المستحسن للحصول على ما لا يقل عن 20 الصور / حالة. العدد الدقيق، ومع ذلك، ينبغي أن تحدد وفقا لمسألة تجريبية بالتنسيق مع نهج الإحصائية مثل حساب حجم العينة. حفظ التجربة.

8. Deconvolution

  1. فتح ملف مع برنامج deconvolution أو دفعة المعالج. تحقق المعلمات لكل قناة باستخدام البرمجيات. تأكيد الإثارة وانبعاث أطياف كل قناة، STED الانبعاثات نضوب، والتصوير المباشرهنشوئها (صعودا أو هبوطا، إذا كانت الصورة 3 الأبعاد) على وجه الخصوص.
  2. Deconvolve استخدام المعالج deconvolution. الإعدادات الافتراضية هي كافية عموما، ومع ذلك إشارة إلى نسبة الضوضاء (SNTR) سوف تختلف من fluorophore fluorophore لوسوف تحتاج إلى أن تحدد لكل قناة وكل تجربة على حدة.

Representative Results

بشكل واضح، فإن الهدف الأساسي من القرار فائقة التصوير يكون تحسنا متحد البؤر المجهري التقليدية. ومع ذلك، هناك بعض المخاطر المشتركة التي قد تؤدي إلى القرار الأمثل. هذه تتطلب أن يكون الأمثل لكل تجربة على حدة. في التجربة ممثل دينا، ونحن تصوير شبكة F-الأكتين في الخلايا القاتلة الطبيعية تفعيلها من خلال الأجسام المضادة بد أن الزجاج. الأسباب الشائعة ل(وتصحيحات ل) عدم وجود تحسن على قرار من STED متحد البؤر هي كما يلي:

  1. تحت أخذ العينات (الشكل 1A). قد يؤدي هذا إلى التحبب وفقدان المعلومات بكسل، كما هو مبين في القرار الفقراء من خيوط F-الأكتين. زيادة خط أو الإطار المتوسط ​​في كثير من الأحيان يمكن تصحيح هذا.
  2. تبيض و / أو الإفراط في أخذ العينات (الشكل 1B). قد يكون ذلك بسبب مطولة بكسل مدة بقاء نتيجة لخط المتوسط ​​المفرطة. بدلا من ذلك، قد يكون نتيجة الإفراط في المسح الضوئي للصورة قبل الاستحواذ، بما في ذلك الإفراط في استخدامالليزر نضوب. هذه النتائج عادة في الصور ضبابية أو غامض. هذا يمكن تصحيحه عن طريق المسح الضوئي مجال الاهتمام بالحد الأدنى فقط قبل الحصول أو، إذا كان ذلك ممكنا، وزيادة سرعة المسح الضوئي ليزر. إذا استمرت المشكلة، يمكن تخفيض قوة الليزر نضوب.

من خلال تحقيق التوازن الصحيح من الوقت يسكن بكسل، الإثارة قوة الليزر، واستنزاف قوة الليزر، صورة مع تحسن القرار ومعلومات كافية يمكن أن تتولد (الشكل 1C). القرار يمكن تحسينها عن طريق استخدام deconvolution (الشكل 1D). عندما تم تحسين الاستحواذ، سوف deconvolution تحسين القرار كما ونوعا، وينبغي أن تكون شبه قرار 100 نانومتر يمكن بلوغه بصورة روتينية.

الشكل 1
تم تفعيل الرقم 1. الأمثل لاقتناء والمخاطر المشتركة من التصوير STED. NK92 الخلايا على مكافحة CD18 وNKp30 الزجاج المطلي لمدة 20 دقيقة ثم ثابتة، permeabilized والملون لF-الأكتين مع Phalloidin اليكسا فلور 488. أ) مثال فقدان معلومات الصورة بسبب نقص أخذ العينات. ب) مثال على فقدان القرار بسبب تبيض / الإفراط في أخذ العينات ج) الظروف الأمثل د) الظروف الأمثل يؤدي إلى مزيد من التحسن في القرار مع deconvolution. شريط النطاق = 5 ميكرون.

Discussion

فإن التحسن في القرار على أن يعتمد إلى حد ما متحد البؤر على العوامل التي لا يمكن السيطرة عليها. وتشمل هذه العوامل الانحرافات الطفيفة في سماكة الغطاء زلة والتناقضات في وسائل الإعلام في تصاعد مستمر. فمن المهم للحفاظ على درجة الحرارة والرطوبة في غرفة التصوير متسقة قدر الإمكان، وينبغي إعادة ترتيب شعاع STED تقريبا كل 60 دقيقة. كما ذكر في الإجراءات، ويجب تجنب استخدام VECTASHIELD المتوسطة المتزايدة، وهذا غير متوافق مع STED. بالإضافة إلى هذا، ينبغي للمرء دائما استخدام # 1.5 زلات الغطاء، وإذا كانت متوفرة، استخدام تلك التي تم التحقق منها لسمك معين.

واحد من تعديل النهج وصفها هنا هو صورة قنوات إضافية في متحد البؤر، وذلك باستخدام fluorophores التي تنبعث منها في طول موجة أطول من شعاع STED. بهذه الطريقة، يمكن للمرء صورة يصل إلى أربع قنوات (اثنان في متحد البؤر، واثنان في STED). إذا أخذ هذا النهج، ومع ذلك، فإن قنوات مع fluorophores الإلكترونيةسوف mitting أعلاه استنزاف الليزر STED تحتاج إلى تصوير أول، وتطبيق شعاع STED سوف تستنزف الفوتونات في هذه القنوات. واحدة ميزة لهذه التقنية هو تطبيق من الوقت النابضة، والتي سوف تحسن أيضا في القرار متحد البؤر من خلال القضاء على الانبعاثات من الفوتونات مع أعمار قصيرة 34. على وجه الخصوص، فإن استخدام النابضة الوقت، توقيت كشف الانبعاثات لتتوافق مع الإثارة نابض STED، وانخفاض مضان الخلفية من انعكاس قبالة الزجاج ساترة عند التصوير على مقربة منه. حتى في تجربة لا تصلح للSTED، إذا باستخدام مصدر الإثارة نابض، يمكن للزمن النابضة تكون أداة مفيدة لتحسين القرار في متحد البؤر.

هناك العديد من التعديلات التي يمكن استخدامها لتحسين القرار في STED. واحد هو تقليل حجم الثقب من مستوى 1 إيري حدة، على الرغم من أن هذا سوف أيضا تقليل كمية من الضوء تصل إلى العينة. وهذا يمكن أن يتم تعويضهم عن طريق زيادة لاسإيه السلطة أو تحقيق مكاسب. هو آخر لزيادة خط المتوسط، الأمر الذي سيزيد من كمية المعلومات التي تم جمعها عن كل فوتون، وتحسين القرار. مرة أخرى، ومع ذلك، قد يكون هذا على حساب photobleaching من العينة، لذلك سوف تحتاج إلى التوازن الذي يجب إقامته بين القرار والتبييض. وبالمثل، فإن استخدام البروتينات الفلورية مثل GFP تتطلب التحسين الحذر لتجنب التبييض. ويمكن تحقيق هذا عن طريق تقليل قوة الليزر STED إذا لزم الأمر. نقاط قتا أطول سوف تسمح أيضا لمزيد من الانتعاش والحد من الفوتون التبييض. ينبغي أخذها في الاعتبار تصحيح ل photobleaching ليعيش عند تحليل STED.

بطبيعة الحال، والتصوير في 3 أبعاد في STED الممكن أيضا، وسوف تعطي أيضا تحسنا التصوير متحد البؤر التقليدية. هل هذا صحيح لا سيما إذا كان يتم ذلك بالاشتراك مع deconvolution، على الرغم من الرعاية التي ينبغي اتخاذها لتصحيح الانحراف الذي يحدث أثناء التصوير طائرات متعددة في محور ض. إذا باستخدام برنامج هيغنزلdeconvolve، يتم الحصول على هذا التصحيح باستخدام "استقرار الصورة" الميزة. باستخدام هذا النهج، سيتم تحسين القرار في محور ض. هذا هو تحسنا كبيرا خلال التصوير متحد البؤر التقليدية، التي لديها ضعف القرار المحوري، وحتى على STED نفسها فقط، التي لديها أيضا فقيرة نسبيا القرار ض محور. حين الحصول على أكوام متعددة في STED، يجب توخي الحذر لتجنب التبييض من العينة، وإذا كان أحد يمكن أن تقلل من الضروري الخط المتوسط ​​أو الليزر كثافة الطاقة من أجل القيام بذلك. مرة أخرى، تجدر الإشارة إلى أنه إذا كان التصوير fluorophores الأخرى التي ليست مناسبة للSTED، وتطبيق شعاع نضوب في أول مسح متتابعة من شأنه أن يمنع الانبعاثات من هذه القنوات. وبالتالي، نهج STED / متحد البؤر مختلطة (عند استخدام المسح متحد البؤر في القنوات التي تنبعث منها في طول موجة أكبر من 592 نانومتر) للأسف لن تكون مناسبة ل3D.

لتلخيص، فقد اخترنا STED كنهج بسبب السهولة النسبية المتمثلة في التطبيقlication والتحسن في القرار على التصوير متحد البؤر القياسية. لتصوير المشبك المناعي، فإنه قد ثبت تقنية فعالة وقيمة أن يسمح لنا أن نرى التفاصيل في العمارة F-الأكتين غير ممكن في القرار أكثر من 200 نانومتر. في حين أن العديد من هذه التفاصيل تبدو خفية، فإنها يمكن أن يكون لها تأثير عميق على وظيفة خلايا NK. وبالتالي، نحن نطبق أحدث تكنولوجيا التصوير نانوية لاستخلاص المعلومات التي تعتبر ضرورية للحفاظ على صحة الإنسان.

Disclosures

يعلن الكتاب أنه ليس لديهم مصالح مالية المتنافسة. وقد تحملت تكاليف نشر جزئية من هذه المادة من قبل لايكا مايكروسيستمز، وشركة

Acknowledgments

نشكر جيف دانيلز للحصول على المساعدة الفنية. وقد تم تمويل هذا العمل من قبل R01 AI067946 لJSO

Materials

Name Company Catalog Number Comments
#1.5 cover slips VWR 48393-172
BD Cytofix/Cytoperm BD Biosciences 554722
Bovine serum albumin Sigma A2153
Cotton tipped applicator Fisher Scientific S450941
Falcon centrifuge tubes (50 ml) VWR 352070
Fetal calf serum (FCS) (500 ml) Atlantic Biologicals S11050
Goat anti-rabbit Pacific Orange Life Technologies P31584
Laboratory tissue wipers VWR 82003-820
Nail polish VWR 100491-940
NK-92 cells ATCC CRL-2407
Phalloidin Alexa Fluor 488 Life Technologies A12379
Phosphate buffered saline Life Technologies 14190250
Prolong anti-fade reagent Life Technologies P7481
Purified anti-CD18 Biolegend 301202
Purified anti-NKp30 Biolegend 325202
Purified anti-perforin Biolegend 308102
RPMI 1640 medium (500 ml) Life Technologies 11875-093
Saponin from Quillaja bark Sigma S4521
Super PAP pen Life Technologies 008899
Triton X-100 Electron Microscopy Sciences 22142
Huygens deconvolution software SVI Contact company
Leica SP8 TCS STED microscope Leica Microsystems contact company

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Stinchcombe, J. C., Bossi, G., Booth, S., Griffiths, G. M. The immunological synapse of CTL contains a secretory domain and membrane bridges. Immunity. 15 (5), 751-761 (2001).
  2. Grakoui, A., Bromley, S. K., Sumen, C., et al. The immunological synapse: a molecular machine controlling T cell activation. Science. 285 (5425), 221-227 (1999).
  3. Monks, C. R., Freiberg, B. A., Kupfer, H., Sciaky, N., Kupfer, A. Three-dimensional segregation of supramolecular activation clusters in T cells. Nature. 395 (6697), 82-86 (1998).
  4. Orange, J. S., Harris, K. E., Andzelm, M. M., Valter, M. M., Geha, R. S., Strominger, J. L. The mature activating natural killer cell immunologic synapse is formed in distinct stages. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100 (24), 14151-14156 (2003).
  5. Treanor, B., Lanigan, P. M., Kumar, S., et al. Microclusters of inhibitory killer immunoglobulin-like receptor signaling at natural killer cell immunological synapses. J. Cell Biol. 174 (1), 153-161 (2006).
  6. Abeyweera, T. P., Merino, E., Huse, M. Inhibitory signaling blocks activating receptor clustering and induces cytoskeletal retraction in natural killer cells. J. Cell Biol. 192 (4), 675-690 (2011).
  7. Beemiller, P., Jacobelli, J., Krummel, M. F. Integration of the movement of signaling microclusters with cellular motility in immunological synapses. Nat. Immunol. 13 (8), 787-795 (2012).
  8. Campi, G., Varma, R., Dustin, M. L. Actin and agonist MHC-peptide complex-dependent T cell receptor microclusters as scaffolds for signaling. J. Exp. Med. 202 (8), 1031-1036 (2005).
  9. Mossman, K. D., Campi, G., Groves, J. T., Dustin, M. L. Altered TCR signaling from geometrically repatterned immunological synapses. Science. 310 (5751), 1191-1193 (2005).
  10. Varma, R., Campi, G., Yokosuka, T., Saito, T., Dustin, M. L. T cell receptor-proximal signals are sustained in peripheral microclusters and terminated in the central supramolecular activation cluster. Immunity. 25 (1), 117-127 (2006).
  11. Yokosuka, T., Sakata-Sogawa, K., Kobayashi, W., et al. Newly generated T cell receptor microclusters initiate and sustain T cell activation by recruitment of Zap70 and SLP-76. Nat. Immunol. 6 (12), 1253-1262 (2005).
  12. Toomre, D., Bewersdorf, J. A new wave of cellular imaging. Annu. Rev. Cell. Dev. Biol. 26, 285-314 (2010).
  13. Schermelleh, L., Heintzmann, R., Leonhardt, H. A guide to super-resolution fluorescence microscopy. J. Cell Biol. 190 (2), 165-175 (2010).
  14. Huang, B., Bates, M., Zhuang, X. Super-resolution fluorescence microscopy. Annu. Rev. Biochem. 78, 993-1016 (2009).
  15. Mace, E. M., Orange, J. S. New views of the human NK cell immunological synapse: recent advances enabled by super- and high-resolution imaging techniques. Front. Immunol. 3, 421 (2012).
  16. Hell, S. W., Wichmann, J. Breaking the diffraction resolution limit by stimulated emission: stimulated-emission-depletion fluorescence microscopy. Opt. Lett. 19 (11), 780-782 (1994).
  17. Klar, T. A., Hell, S. W. Subdiffraction resolution in far-field fluorescence microscopy. Opt. Lett. 24 (14), 954-956 (1999).
  18. Klar, T. A., Jakobs, S., Dyba, M., Egner, A., Hell, S. W. Fluorescence microscopy with diffraction resolution barrier broken by stimulated emission. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97 (15), 8206-8210 (2000).
  19. Rankin, B. R., Moneron, G., Wurm, C. A., et al. Nanoscopy in a living multicellular organism expressing GFP. Biophys. J. 100 (12), 63-65 (2011).
  20. Willig, K. I., Kellner, R. R., Medda, R., Hein, B., Jakobs, S., Hell, S. W. Nanoscale resolution in GFP-based microscopy. Nat. Methods. 3 (9), 721-723 (2006).
  21. Rak, G. D., Mace, E. M., Banerjee, P. P., Svitkina, T., Orange, J. S. Natural killer cell lytic granule secretion occurs through a pervasive actin network at the immune synapse. PLoS Biol. 9 (9), (2011).
  22. Mace, E. M., Orange, J. S. Dual channel STED nanoscopy of lytic granules on actin filaments in natural killer cells. Commun. Integr. Biol. 5 (2), 184-186 (2012).
  23. Singh, H., Lu, R., Rodriguez, P. F., et al. Visualization and quantification of cardiac mitochondrial protein clusters with STED microscopy. Mitochondrion. 12 (2), 230-236 (2012).
  24. Tonnesen, J., Nagerl UV, Superresolution imaging for neuroscience. Exp. Neurol. 242, 33-40 (2013).
  25. Kempf, C., Staudt, T., Bingen, P., et al. Tissue multicolor STED nanoscopy of presynaptic proteins in the calyx of held. PLoS One. 8 (4), (2013).
  26. Jans, D. C., Wurm, C. A., Riedel, D., et al. STED super-resolution microscopy reveals an array of MINOS clusters along human mitochondria. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110 (22), 8936-8941 (2013).
  27. Gustafsson, M. G. Surpassing the lateral resolution limit by a factor of two using structured illumination microscopy. J. Microsc. 198 (2), 82-87 (2000).
  28. Gustafsson, M. G., Shao, L., Carlton, P. M., et al. Three-dimensional resolution doubling in wide-field fluorescence microscopy by structured illumination). Biophys. J. 94 (12), 4957-4970 (2008).
  29. Schermelleh, L., Carlton, P. M., Haase, S., et al. Subdiffraction multicolor imaging of the nuclear periphery with 3D structured illumination microscopy. Science. 320 (5881), 1332-1336 (2008).
  30. Betzig, E., Patterson, G. H., Sougrat, R., et al. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science. 13 (5793), 1642-1645 (2006).
  31. Hess, S. T., Girirajan, T. P., Mason, M. D. Ultra-high resolution imaging by fluorescence photoactivation localization microscopy. Biophys. J. 91 (11), 4258-4272 (2006).
  32. Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy. Nat. Methods. 3 (10), 793-795 (2006).
  33. Cdc42-interacting protein-4 functionally links actin and microtubule networks at the cytolytic NK cell immunological. J. Exp. Med. Banerjee, P. P., Pandey, R., Zheng, R., Suhoski,, Monaco-Shawver, L., Orange, J. S. 204 (10), 2305-2320 (2007).
  34. Vicidomini, G., Moneron, G., Han, K. Y., et al. Sharper low-power STED nanoscopy by time gating. Nat. Methods. 8 (7), 571-573 (2011).

Tags

علم المناعة، العدد 85، والخلايا القاتلة الطبيعية، F-الأكتين، المشبك المناعي، فائقة الدقة المجهر، حفز اللونين نضوب الانبعاثات (STED) المجهري
تصور من قبل المناعية المشبك المزدوج اللون التوقيت بوابات-الانبعاث المستحث استنفاد (STED) Nanoscopy
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Mace, E. M., Orange, J. S.… More

Mace, E. M., Orange, J. S. Visualization of the Immunological Synapse by Dual Color Time-gated Stimulated Emission Depletion (STED) Nanoscopy. J. Vis. Exp. (85), e51100, doi:10.3791/51100 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter