Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Visualiseringen af ​​det immunologiske Synapse med Dual Color Time-gated stimuleret emission Nedbrydning (STED) Nanoscopy

Published: March 24, 2014 doi: 10.3791/51100
Automatic Translation
1, 1
1Center for Human Immunobiology, Texas Children's Hospital and Baylor College of Medicine

Summary

Her illustrerer vi protokollen for billeddannelse med tofarvede STED Nanoscopy den cytotoksiske immun synapse af NK-celler sammenfattet på glas. Ved hjælp af denne metode, vi får sub-100 nm opløsning på synapse proteiner og cytoskelettet.

Abstract

Naturlige dræberceller danner stramt reguleret, fintunet immunologiske synapser (IS) for at lysere virusinficerede eller tumorigene celler. Dynamisk aktin reorganisering er afgørende for funktionen af ​​NK-celler og dannelsen af ​​IS. Billeddannelse af F-aktin i synapsen har traditionelt anvendt konfokal mikroskopi, men diffraktion grænsen af ​​lys begrænser beslutning af fluorescensmikroskopi, herunder konfokal til ca 200 nm. Nylige fremskridt inden for imaging-teknologi har muliggjort udviklingen af ​​subdiffraction begrænset super-opløsning billeddannelse. For at visualisere F-actin arkitektur på IS rekapitulere vi NK-celle cytotoksisk synapse ved at overholde NK-celler til at aktivere receptoren på glas. Vi derefter billedet proteiner af interesse ved hjælp af to-farve stimuleret emission udtynding mikroskopi (STED). Dette resulterer i <80 nm opløsning på synapser. Heri beskrives de trin i prøveforberedelse og erhvervelse af billeder ved hjælp af dobbelt coleller STED Nanoscopy at visualisere F-actin på NK IS. Vi illustrerer også optimering af indsamling af prøven ved hjælp af Leica SP8 software og tid-gated STED. Endelig udnytter vi Huygens software til efterbehandling deconvolution billeder.

Introduction

Den immunologiske synapse er et komplekst miljø af signalproteiner og cytoskeletale elementer. Den cytolytiske synapse blev oprindeligt beskrevet som havende en "bulls-eye"-lignende struktur med en ring af actin og adhæsionsmolekyler omkring en central sekretorisk domæne 1-4. Men vi ved nu, at den består af mikroskopiske domæner af aktiv signalering, der kræver kontinuerlig dynamisk cytoskeletal reorganisering for funktion 5-11. Meget af den information, som vi nu har om synapse er afledt af mikroskopi, og immunologer har været early adopters af cutting-edge imaging-teknologi.

En sådan ny teknologi er super opløsning mikroskopi. Konventionel lysmikroskopi rumligt begrænset af diffraktion barriere af lys, som sætter den nedre grænse for opløsning for alle fluorescensmikroskopi herunder konfokal på cirka 200 nm. I de seneste år har adskillige teknikker været developed, der tillader opløsning under diffraktion barriere. Disse omfatter stimulation emission udtynding mikroskopi (STED), struktureret belysning mikroskopi (SIM), stokastisk løst mikroskopi (STORM), og fotoaktiverbart lysmikroskopi (PALM). Disse teknikker er blevet revideret i detaljer andetsteds 12-15, men er skitseret nedenfor. Subdiffraction begrænset opløsning genereres i unikke måder i hvert system. Udvælgelsen af ​​en super-opløsning teknik bør derfor være dikteret af eksperimentet og eksperimentelle system af interesse.

STED super opløsning opnås ved hjælp af en høj intensitet torroidal udtømning stråle, der selektivt "tavshed" fluorescens omkring hver fluorfor af interesse efter excitation, hvilket resulterer i subdiffraction begrænset fluorescensmikroskopi 16-18. En fordel ved STED er, at billedet erhvervelse er hurtig og kræver forholdsvis lidt efterbehandling. Mens farvestof udvælgelse er dikteret af spectral position udtømning bjælke, som i det kommercielt tilgængelige system er beliggende ved 592 nm, er flere kommercielt tilgængelige farvestoffer rådighed, der gør kombinationer af to fluorophorer muligt. Endvidere kan almindeligt anvendte fluorescerende reportere såsom GFP skal afbildes, hvilket gør levende celle eksperimenter muligt 19,20.

Vi har tidligere brugt STED at identificere og kvantificere regioner af F-actin hypodensity der er udnyttet af NK-celler til degranulering 21,22. Vi foreslår, at STED er et godt valg til afbildning af immune synapse på grund af sin relativt fleksibelt tilgængelighed af fluoroforer og overlegen forbedring i opløsning i xy akse. Desuden, på kommercielt tilgængelige STED benyttet til disse forsøg, anvendelse af en high-speed (12.000 Hz) resonans scanner tillader hurtig erhvervelse af billeder med minimal skade på prøver. Begrænset fleksibilitet i farve valg betragtes som en ulempe STED 12,dog dobbelt farve STED er forholdsvis ligetil med flere kommercielt tilgængelige fluorophores. Integrationen af ​​STED med en laser konfokal mikroskop giver også mulighed for yderligere konfokal billeddannelse i kombination med STED, så mens STED er begrænset til to kanaler, kan yderligere strukturer filmede i konfokal med opløsning på ca 200 nm (E. Mace, upublicerede observationer ). Mens vi beskriver anvendelsen af STED til billeddannelse af immunceller, er denne teknologi anvendes til en række celletyper, herunder neurale celler og til visualisering af en bred vifte af cellestrukturer 23-26.

SIM anvender en anden tilgang til at generere subdiffraction begrænset billeder. Ved at visualisere kendte periodiske excitation mønstre kan information derefter opnås om den ukendte struktur blive undersøgt efter matematisk transformation 27. Dette giver en stigning i beslutning til ~ 100 nm sideværts 28,29. Fordelen ved SIM-kort er, at det is kompatibel med alle standard konfokal farvestoffer og sonder, men ulempen er, at det er meget langsommere til at hente billeder og disse kræver langvarig efterbehandling 12. Dette begrænser også dets anvendelse til levende celler.

Endelig kan billederne super-opløsning genereres ved stokastisk foto-kobling af fluorophores. Denne tilgang er udnyttet i foto-aktiverede lokalisering mikroskopi (PALM) og stokastiske optisk genopbygning mikroskopi (STORM). Ved at scanne flere kamera rammer og lokalisere tilfældigt aktiverede molekyler, der er slået "til" og "off" over tid, er billeder med 20-30 nm opløsning genereres fra akkumulerede rammer 30-32. Det trade-off for denne beslutning er den tid, der kræves for at hente billeder.

Her viser vi, i detaljer, protokollen for at forberede og billeddannelse dual farveprøver i STED. I dette system eksitation med en pulserende, afstemmelige, hvidt lys laser. På grund af karakterenaf det pulserende exciteringsstrålen er tid gating for afsløring muliggjort og yderligere stigninger opløsning. Desuden er systemet udstyret med gadolinium hybrid (hydr) detektorer, som er mere følsomme end konventionelle lysforstærkningsrør, således at lavere laser strømkrav. Nedbrydningen stråle til STED anvendes løbende og er tunet til 592 nm, hvilket vil diktere valget af farvestoffer til rådighed for to farver STED. Almindeligt anvendte farvestof kombinationer generelt omfatter en overgearet ved 488 nm (f.eks Alexa Fluor 488, Oregon Green, DyLights grøn eller Chromeo 488) og en overgearet ved 458 nm (såsom Pacific Orange eller Horizon V500). Medens påvisning af de to farvestoffer vil være i en række lignende (og begge er tilgængelige ved nedbrydningen laser), vil excitation forekomme med forskellige bølgelængder. Med et justerbart hvidt lys laser og justerbare detektorer, der maksimere signal, mens fjerne spektral overlapning lavet ret nemt. Som sådan har vi haft god succes med kombinioner af kommercielt tilgængelige farvestoffer, såsom Pacific Orange og Alexa Fluor 488 (her anvendt). Vores protokol er skræddersyet til og beskriver evalueringen af ​​humane NK-celler som repræsenterer historiske fokus for vores laboratorium. Vi er specielt udnytte NK92 cellelinje i dette eksempel, da det er en vi har regelmæssigt anvendt i vores eksperimentelle arbejde 21,33.

Protocol

1.. Frakke Dækglas med antistof

  1. Forvarm (ved 37 ° C) i 30 ml RPMI 10% FCS medier og 1 ml BD Cytofix / Cytoperm.
  2. Der fremstilles en opløsning af 5 ug / ml oprenset antistof i phosphatbufret saltvand (PBS). Anbefales til aktivering af NK92 cellelinie, brug af anti-CD18 og anti-NKp30.
    1. Mark en cirka skilling mellemstore cirkel for hver tilstand på en # 1.5 dækglas ved hjælp af en PAP pen. For en dobbelt farve eksperiment, bør der være fire betingelser: uplettet, dobbelt farves, og to enkeltsenge farvede forhold. Doser 200 pi antistofopløsning i hver region, og der inkuberes ved 37 ° C i 30 minutter.
    2. Vask dækglas ved forsigtigt at nedsænke hver en i 50 ml PBS i et 50 ml konisk rør ved stuetemperatur. Vask skal ske umiddelbart før tilsætningen af ​​bør tages celler og forsigtighed for at undgå antistof tørring på dækglasset.

2. Aktiver NK-celler på Coverpodekviste; Fix og permeabiliserer

  1. Isoler 5 x 10 5 NK92 celler pr tilstand. Centrifuge og dekantere supernatant. Vask en gang med 10 ml forvarmet medier fra trin 1.1. Centrifuge og dekantere supernatant.
    1. Resuspender cellerne i forvarmede medier fra trin 1.1 i en koncentration på 2,5 x 10 6 / ml.
    2. Forsigtigt dekanteres 200 ul til midten af ​​regionen skabt i afsnit 1.2.1. Inkuberes ved 37 ° C i 20 min ved 5% CO 2. (Bemærk: denne gang kan udvides eller mindskes, afhængigt af den biologiske funktion af interesse for NK-celle granula polarisering, 20 min er tilstrækkelig.).
  2. Efter inkubation af celler vaskes forsigtigt dækglas ved at dyppe hver i 50 ml stuetemperatur PBS i et 50 ml konisk rør.
  3. Tilsæt 1 ul Triton X-100 til 1 ml forvarmet Fix / Perm opløsningen fra trin 1.1 og vortex grundigt. Lave og permeabilisere ved tilsætning af 200 pi Fix / Perm buffer (trin 2.3) til celler. Inkuber i 10 mi i mørke ved stuetemperatur.

3. Stain Cells

  1. Forbered farvning buffer: phosphatbufret saltvand (PBS), 1% BSA, 0,1% Saponin.
    1. Forbered opløsning af primært antistof i 200 pi farvning buffer (se trin 3.1). (Bemærk: antistof bør titreres før brug). Undgå brug af primært antistof, der er rejst i de samme arter, der anvendes til at belægge dækglasset (trin 1.2). Også undgå Strepatividin-biotin-bindinger til STED billeddannelse.
    2. Efter punkt 2.3.1, forsigtigt vaske dækglas i 50 ml farvning buffer. Dup kanter PAP-pen region med vatpind til at fjerne overskydende buffer. Påfør antistof løsning skabt i afsnit 3.1.1. Inkuber 30 minutter i mørke ved stuetemperatur. (Anbefalet: inkuberes dækglas i dias kasse med en fugtig papirserviet for at bevare fugtighed).
  2. Forbered løsning af sekundært antistof i 200 pi farvningpuffer. Anbefalede fluorophores er Alexa Fluor 488, Pacific Orange, og V500. Generelt er en fortynding på 1:200 er egnet til STED billeddannelse.
    1. Vask forsigtigt dækglas i 50 ml farvning buffer. Dup kanter PAP-pen region med vatpind til at fjerne overskydende buffer. Anvend sekundært antistof opløsning. Inkuber 30 minutter i mørke ved stuetemperatur.
  3. Gentag vask og farvning for yderligere proteiner af interesse. Hvis påvisning af F-actin med phalloidin, kan dette indgå med sekundært antistof, generelt ved en 1:200 fortynding.

4.. Mount Dækglas på dias

  1. Forbered montage medium. Bemærk: Forlæng eller forlænge Gold er at foretrække. Vectashield skal undgås, da det ikke er foreneligt med STED. 2,2-thiodioethanol skal undgås, hvis phalloidin anvendes. Mowiol er acceptabel.
  2. Placer cirka 10-20 ul montering medium på et dias. Invert dækglas (celle nedad) og montere dækglas forsigtigt, idet manundgå indføring af luftbobler. Inkuber slides i 24 timer (dækglasset op) før billeddannelse.
  3. Seal kanter dækglas med neglelak.

5.. Forsøgsopstilling

  1. Igangsætte krævede lasere og software. Igangsætte STED udtømning laser ved 100% effekt. Juster STED laser, som i tilfælde af kommercielle systemer er ofte en automatiseret procedure.
  2. Fokus prøven, begyndende med en enkelt farvede kontrol på mikroskopet med okularer.

6.. Optimering af indstillinger

  1. Scan den første kanal og optimere laser magt, exciteringsstrålen position og detektor rækkevidde. Hvis det er muligt, undgå en gevinst på> 100. Fange billedet i konfokal at optimere indstillingerne. Line og / eller ramme gennemsnitsberegning vil øge opløsningen. Check for pixel mætning. Bemærk: Nogle mætning er acceptabelt i konfokal som anvendelsen af ​​STED vil reducere intensiteten af ​​emission. For STED vil en optimal pixelstørrelse være under 30 nm, hvordanstadigt bedre opløsning opnås med mindre pixel størrelser. Størrelsen af ​​området af interesse, der afbildes, vil diktere den nedre grænse for pixelstørrelse. Mindre pixel størrelser kan øge fotoblegning.
    1. Påfør STED udtømning stråle og fange billedet, startende med 50% udtynding laser magt. Hvis en forbedring i opløsningen er set, kan anvendes mere udtømning lasereffekt. På dette tidspunkt, kan det være nødvendigt at justere excitation laser magt, line gennemsnit, og / eller gevinst.
    2. Anvend tid gating at reducere baggrund (mindst 0,3 nanosekunder). Juster indstillingerne, indtil en forbedring i opløsning i konfokal kan ses. Opløsning kan tilnærmes ved at estimere fuld bredde halv maksimum (FWHM). Dette repræsenterer afstanden ved halv maksimal intensitet af en Gauss top skabt ved at trække en linie nu over strukturen af ​​interesse, og er en almindeligt anvendt metode til at beregne opløsning.
    3. Når den første kanal er tilfredsstillende, indleder en anden sekvens for sig selvindirekte, speciel scanning. Generelt er det bedst at scanne længere bølgelængde fluorofor først. Gentag trin 6.1 på anden kanal.
  2. Bekræft mangel på spektral overlapning af imaging enkelt farvede kontrol med både scan sekvenser. Mild spektral overlapning kan korrigeres ved hjælp af spektrale un-blanding funktioner i softwaren, bør dog så vidt muligt undgås.

7.. Image Acquisition

  1. Anskaf billeder. Til kvantitativ billeddannelse, anbefales det at opnå mindst 20 billeder / tilstand. Det præcise antal, men bør defineres i henhold til den eksperimentelle spørgsmål i samråd med en statistisk metode, såsom beregning stikprøvestørrelse. Gem eksperiment.

8.. Deconvolution

  1. Åbn fil med deconvolution software eller batch-processor. Tjek parametre for hver kanal ved hjælp af software. Bekræft hver kanals excitation og emission spektre STED udtømning emission, og billedbehandling retningning (op eller ned, hvis billedet er 3-dimensionel) i særdeleshed.
  2. Deconvolve bruge deconvolution guiden. Standardindstillingerne er generelt tilstrækkelig, men signal til støjforhold (SNTR) til vil variere fra fluoroforen til fluoroforen og skal bestemmes for hver kanal og hvert eksperiment individuelt.

Representative Results

Er klart, at et primært mål for super-opløsning billeddannelse være en forbedring i forhold til konventionel konfokal mikroskopi. Der er dog nogle almindelige faldgruber, som kan føre til suboptimal opløsning. Disse kræver, at hvert eksperiment optimeres individuelt. I vores repræsentativt eksperiment vi billeddannelse af F-actin-netværket i en NK-celle aktiveret af antistof bundet til glas. Almindelige årsager til (og korrektioner for) en mangel på bedre opløsning på STED løbet konfokal er som følger:

  1. Under-prøvetagning (figur 1a). Kan dette føre til kornethed og tab af pixel oplysninger, som fremgår af dårlig opløsning af F-actin filamenter. Øget linje eller ramme gennemsnitsberegning kan ofte rette dette.
  2. Blegning og / eller over-prøvetagning (figur 1b). Dette kan være forårsaget af langvarig pixel opholdstid som følge af overdreven linje gennemsnit. Alternativt kan det være et resultat af over-scanningen af ​​billedet inden erhvervelse, herunder overforbrug afudtømningen laser. Dette medfører ofte en diset eller slørede billeder. Dette kan korrigeres ved at scanne interesseområde kun minimalt før erhverve eller, hvis det er muligt, at øge laser scanningshastighed. Hvis problemet fortsætter, kan nedbrydningen laser magt reduceres.

Ved at opnå den rette balance af pixel opholdstid, magnetisering laser magt, og udtømningen laser magt, et billede med forbedret opløsning og tilstrækkelige oplysninger kan genereres (figur 1c). Opløsningen kan forbedres yderligere ved anvendelse af dekonvolvering (figur 1d). Når købet er optimeret, vil deconvolution forbedre opløsning både kvalitativt og kvantitativt og sub-100 nm opløsning bør rutinemæssigt opnåelige.

Figur 1
Figur 1.. Optimering af indkøb og fælles faldgruber STED billeddannelse. NK92 celler blev aktiveret på anti-CD18 og-NKp30 belagt glas i 20 min derefter fikseret, permeabiliseret og farvet for F-actin med phalloidin Alexa Fluor 488. A) Et eksempel på tab af billedinformation grund under-sampling. b) Et eksempel på tab af opløsning på grund af blegning / over-sampling c) betingelser optimeret D) optimerede forhold kan føre til større forbedring i opløsning med deconvolution. Scale bar = 5 um.

Discussion

Forbedringen i opløsning i løbet af konfokal vil være noget afhængig af faktorer, som ikke kan kontrolleres. Disse faktorer omfatter mindre afvigelser i dækglas tykkelse og uoverensstemmelser i montering medier. Det er vigtigt at holde temperaturen og luftfugtigheden i imaging rum så konsekvent som muligt, og det place stråle skal udrettet cirka hver 60 min. Som nævnt i Procedures, skal brug af Vectashield montage medium undgås, da det ikke er foreneligt med STED. Ud over at der, bør man altid bruge # 1.5 dækglas, og hvis den er tilgængelig, kan du bruge dem, der er blevet verificeret til en bestemt tykkelse.

En ændring af den fremgangsmåde, der beskrives her, er at billedet yderligere kanaler i konfokal, ved hjælp fluorophores der udleder ved en længere bølgelængde end place stråle. På denne måde kan man billede op til fire kanaler (to i konfokal, to i STED). Hvis du tager denne fremgangsmåde er imidlertid de kanaler med fluoroforer eenhed overfører over STED udtømning laser skal blive afbildet først, da anvendelsen af ​​place stråle vil nedbryder fotoner i disse kanaler. En fordel til denne teknik er anvendelse af tid gating, som også vil forbedre opløsning i konfokal ved at eliminere emission fra fotoner med korte levetider 34. Især vil anvendelse af tid gating, timingen af ​​emissions-detektorer til at korrespondere med pulserende excitation STED, mindske baggrundsfluorescens fra refleksion fra dækglas glas når billeddannelse tæt på den. Selv i et eksperiment ikke er egnet til STED, hvis du bruger en pulserende excitation kilde, kan tid gating være et nyttigt redskab til at forbedre opløsning i konfokal.

Der er forskellige ændringer, der kan udnyttes til at forbedre opløsningen i STED. Den ene er at formindske størrelsen af ​​knappenålshullet fra standard 1 Airy enhed, selv om dette også vil reducere mængden af ​​lys, der når prøven. Dette kan der kompenseres for ved at øge lasis magt eller gevinst. En anden er at øge linje gennemsnit, hvilket vil øge mængden af ​​oplysninger, der indsamles for hver foton, forbedre opløsning. Igen, dette kan dog være på bekostning af fotoblegning af prøven, så en balance vil være nødvendigt at balance mellem opløsning og blegning. Ligeledes vil anvendelsen af ​​fluorescerende proteiner, såsom GFP kræver omhyggelig optimering for at undgå blegning. Dette kan opnås ved om nødvendigt faldende STED lasereffekt. Længere tidspunkter vil også give mulighed for større foton nyttiggørelse og reducere blegning. Korrektion for fotoblegning skal der redegøres for, når man analyserer levende STED.

Selvfølgelig, billedbehandling i 3 dimensioner i STED er også muligt, og det vil også give en forbedring i forhold til konventionelle konfokal billeddannelse. Dette er især tilfældet, hvis det sker i kombination med deconvolution, selv om der bør udvises forsigtighed for at korrigere for afdrift, der opstår under billeddannelse af flere planer i z-aksen. Hvis du bruger Huygens-softwareat deconvolve er denne korrektion opnås ved hjælp af "stabilisere billedet" funktionen. Med denne fremgangsmåde vil opløsning i z-aksen skal forbedres. Dette er en stor forbedring i forhold til konventionel konfokal billedbehandling, der har dårlig aksial opløsning, og selv i løbet af blot børsnoterede selv, som også har en relativt dårlig z-akse opløsning. Mens erhverve flere stakke i STED, skal der drages omsorg for at undgå blegning af prøven, og om nødvendigt kan man reducere linje gennemsnitsberegning eller laser magt intensitet for at gøre det. Igen skal det bemærkes, at hvis billeddannelse andre fluorophores, der ikke er egnet til STED, at anvendelsen af ​​nedbrydningen bjælke i første sekventiel scanning forhindre emission fra disse kanaler. Derfor er en blandet STED / konfokal tilgang (ved brug af konfokal scanning i kanaler, der udsender ved en bølgelængde på mere end 592 nm) vil desværre ikke være egnet til 3D.

For at opsummere, har vi valgt STED som en tilgang på grund af sin relativt let application og forbedring i opløsning i forhold til standard konfokal billeddannelse. Til billeddannelse immun synapse, har det vist en effektiv og værdifuld teknik, der giver os mulighed for at se detaljer i F-actin arkitektur ikke muligt på opløsning over 200 nm. Mens mange af disse detaljer synes subtile, kan de få en dybtgående indvirkning på NK-celle funktion. Således anvender vi den nyeste nanoskopiske imaging-teknologi til tilvejebringelse af oplysninger, der er afgørende for at opretholde menneskers sundhed.

Disclosures

Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen konkurrerende finansielle interesser. Delvis offentliggørelse omkostninger ved denne artikel blev afholdt af Leica Microsystems, Inc.

Acknowledgments

Vi takker Geoff Daniels for teknisk assistance. Dette arbejde blev finansieret af R01 AI067946 til JSO

Materials

Name Company Catalog Number Comments
#1.5 cover slips VWR 48393-172
BD Cytofix/Cytoperm BD Biosciences 554722
Bovine serum albumin Sigma A2153
Cotton tipped applicator Fisher Scientific S450941
Falcon centrifuge tubes (50 ml) VWR 352070
Fetal calf serum (FCS) (500 ml) Atlantic Biologicals S11050
Goat anti-rabbit Pacific Orange Life Technologies P31584
Laboratory tissue wipers VWR 82003-820
Nail polish VWR 100491-940
NK-92 cells ATCC CRL-2407
Phalloidin Alexa Fluor 488 Life Technologies A12379
Phosphate buffered saline Life Technologies 14190250
Prolong anti-fade reagent Life Technologies P7481
Purified anti-CD18 Biolegend 301202
Purified anti-NKp30 Biolegend 325202
Purified anti-perforin Biolegend 308102
RPMI 1640 medium (500 ml) Life Technologies 11875-093
Saponin from Quillaja bark Sigma S4521
Super PAP pen Life Technologies 008899
Triton X-100 Electron Microscopy Sciences 22142
Huygens deconvolution software SVI Contact company
Leica SP8 TCS STED microscope Leica Microsystems contact company

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Stinchcombe, J. C., Bossi, G., Booth, S., Griffiths, G. M. The immunological synapse of CTL contains a secretory domain and membrane bridges. Immunity. 15 (5), 751-761 (2001).
  2. Grakoui, A., Bromley, S. K., Sumen, C., et al. The immunological synapse: a molecular machine controlling T cell activation. Science. 285 (5425), 221-227 (1999).
  3. Monks, C. R., Freiberg, B. A., Kupfer, H., Sciaky, N., Kupfer, A. Three-dimensional segregation of supramolecular activation clusters in T cells. Nature. 395 (6697), 82-86 (1998).
  4. Orange, J. S., Harris, K. E., Andzelm, M. M., Valter, M. M., Geha, R. S., Strominger, J. L. The mature activating natural killer cell immunologic synapse is formed in distinct stages. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100 (24), 14151-14156 (2003).
  5. Treanor, B., Lanigan, P. M., Kumar, S., et al. Microclusters of inhibitory killer immunoglobulin-like receptor signaling at natural killer cell immunological synapses. J. Cell Biol. 174 (1), 153-161 (2006).
  6. Abeyweera, T. P., Merino, E., Huse, M. Inhibitory signaling blocks activating receptor clustering and induces cytoskeletal retraction in natural killer cells. J. Cell Biol. 192 (4), 675-690 (2011).
  7. Beemiller, P., Jacobelli, J., Krummel, M. F. Integration of the movement of signaling microclusters with cellular motility in immunological synapses. Nat. Immunol. 13 (8), 787-795 (2012).
  8. Campi, G., Varma, R., Dustin, M. L. Actin and agonist MHC-peptide complex-dependent T cell receptor microclusters as scaffolds for signaling. J. Exp. Med. 202 (8), 1031-1036 (2005).
  9. Mossman, K. D., Campi, G., Groves, J. T., Dustin, M. L. Altered TCR signaling from geometrically repatterned immunological synapses. Science. 310 (5751), 1191-1193 (2005).
  10. Varma, R., Campi, G., Yokosuka, T., Saito, T., Dustin, M. L. T cell receptor-proximal signals are sustained in peripheral microclusters and terminated in the central supramolecular activation cluster. Immunity. 25 (1), 117-127 (2006).
  11. Yokosuka, T., Sakata-Sogawa, K., Kobayashi, W., et al. Newly generated T cell receptor microclusters initiate and sustain T cell activation by recruitment of Zap70 and SLP-76. Nat. Immunol. 6 (12), 1253-1262 (2005).
  12. Toomre, D., Bewersdorf, J. A new wave of cellular imaging. Annu. Rev. Cell. Dev. Biol. 26, 285-314 (2010).
  13. Schermelleh, L., Heintzmann, R., Leonhardt, H. A guide to super-resolution fluorescence microscopy. J. Cell Biol. 190 (2), 165-175 (2010).
  14. Huang, B., Bates, M., Zhuang, X. Super-resolution fluorescence microscopy. Annu. Rev. Biochem. 78, 993-1016 (2009).
  15. Mace, E. M., Orange, J. S. New views of the human NK cell immunological synapse: recent advances enabled by super- and high-resolution imaging techniques. Front. Immunol. 3, 421 (2012).
  16. Hell, S. W., Wichmann, J. Breaking the diffraction resolution limit by stimulated emission: stimulated-emission-depletion fluorescence microscopy. Opt. Lett. 19 (11), 780-782 (1994).
  17. Klar, T. A., Hell, S. W. Subdiffraction resolution in far-field fluorescence microscopy. Opt. Lett. 24 (14), 954-956 (1999).
  18. Klar, T. A., Jakobs, S., Dyba, M., Egner, A., Hell, S. W. Fluorescence microscopy with diffraction resolution barrier broken by stimulated emission. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97 (15), 8206-8210 (2000).
  19. Rankin, B. R., Moneron, G., Wurm, C. A., et al. Nanoscopy in a living multicellular organism expressing GFP. Biophys. J. 100 (12), 63-65 (2011).
  20. Willig, K. I., Kellner, R. R., Medda, R., Hein, B., Jakobs, S., Hell, S. W. Nanoscale resolution in GFP-based microscopy. Nat. Methods. 3 (9), 721-723 (2006).
  21. Rak, G. D., Mace, E. M., Banerjee, P. P., Svitkina, T., Orange, J. S. Natural killer cell lytic granule secretion occurs through a pervasive actin network at the immune synapse. PLoS Biol. 9 (9), (2011).
  22. Mace, E. M., Orange, J. S. Dual channel STED nanoscopy of lytic granules on actin filaments in natural killer cells. Commun. Integr. Biol. 5 (2), 184-186 (2012).
  23. Singh, H., Lu, R., Rodriguez, P. F., et al. Visualization and quantification of cardiac mitochondrial protein clusters with STED microscopy. Mitochondrion. 12 (2), 230-236 (2012).
  24. Tonnesen, J., Nagerl UV, Superresolution imaging for neuroscience. Exp. Neurol. 242, 33-40 (2013).
  25. Kempf, C., Staudt, T., Bingen, P., et al. Tissue multicolor STED nanoscopy of presynaptic proteins in the calyx of held. PLoS One. 8 (4), (2013).
  26. Jans, D. C., Wurm, C. A., Riedel, D., et al. STED super-resolution microscopy reveals an array of MINOS clusters along human mitochondria. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110 (22), 8936-8941 (2013).
  27. Gustafsson, M. G. Surpassing the lateral resolution limit by a factor of two using structured illumination microscopy. J. Microsc. 198 (2), 82-87 (2000).
  28. Gustafsson, M. G., Shao, L., Carlton, P. M., et al. Three-dimensional resolution doubling in wide-field fluorescence microscopy by structured illumination). Biophys. J. 94 (12), 4957-4970 (2008).
  29. Schermelleh, L., Carlton, P. M., Haase, S., et al. Subdiffraction multicolor imaging of the nuclear periphery with 3D structured illumination microscopy. Science. 320 (5881), 1332-1336 (2008).
  30. Betzig, E., Patterson, G. H., Sougrat, R., et al. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science. 13 (5793), 1642-1645 (2006).
  31. Hess, S. T., Girirajan, T. P., Mason, M. D. Ultra-high resolution imaging by fluorescence photoactivation localization microscopy. Biophys. J. 91 (11), 4258-4272 (2006).
  32. Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy. Nat. Methods. 3 (10), 793-795 (2006).
  33. Cdc42-interacting protein-4 functionally links actin and microtubule networks at the cytolytic NK cell immunological. J. Exp. Med. Banerjee, P. P., Pandey, R., Zheng, R., Suhoski,, Monaco-Shawver, L., Orange, J. S. 204 (10), 2305-2320 (2007).
  34. Vicidomini, G., Moneron, G., Han, K. Y., et al. Sharper low-power STED nanoscopy by time gating. Nat. Methods. 8 (7), 571-573 (2011).

Tags

Immunologi naturlige dræberceller F-actin immun synapse super-opløsning mikroskopi tofarvet stimuleret emission depletion (STED) mikroskopi
Visualiseringen af ​​det immunologiske Synapse med Dual Color Time-gated stimuleret emission Nedbrydning (STED) Nanoscopy
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Mace, E. M., Orange, J. S.… More

Mace, E. M., Orange, J. S. Visualization of the Immunological Synapse by Dual Color Time-gated Stimulated Emission Depletion (STED) Nanoscopy. J. Vis. Exp. (85), e51100, doi:10.3791/51100 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter