체관부 수액의 조성뿐만 아니라 로딩 및 장거리 전송 메커니즘의 지식은 식물의 개발과 스트레스 / 병원균 응답 및 전송 동화의 장거리 신호의 이해를 위해 필수적이다. 이 원고는 EDTA-촉진 방법을 사용하여 체관의 삼출물의 컬렉션을 설명합니다.
식물의 체관의 장거리 수송 (사진)과 생물 또는 비 생물 적 스트레스를 전달하는 신호로 동화 필수적입니다. 그것은 설탕, 아미노산, 단백질, RNA, 지질 및 기타 대사 산물이 포함되어 있습니다. 따라서 구성과 기능 사부의 이러한 분자의 많은 역할과 이해에 큰 관심이 있지만, 식물의 개발과 스트레스의 중요성이 반응은 아직 결정되지 수 있습니다. 사부 분석 한 장벽시 체관부 씰 자체가 상처를 입는 있다는 사실에있다. 그 결과로, 체관부 수액을 얻을 수있는 식물의 수는 제한됩니다. 추가 장비없이 여러 식물 종 체관의 삼출물의 수집을 허용 한 가지 방법은 EDTA-촉진 사부 삼출물 수집이 여기에 설명되어 있습니다. 사용하기 쉬운 반면, 그것은 세포의 상처를 입기에 이르게 손질이 손상된 세포의 내용을 제거하기 위해 수행 할 수있다. 또한, 몇 가지 컨트롤은 삼출물의 순결을 증명하기 위해필요합니다. 오히려 그 내용만을 기준으로 정량화가 발생할 수 있습니다 체관부 수액 (많은 종 불가능합니다)의 직접 수집보다 삼출물 때문이다. 다른 사람을 통해이 방법의 장점은 많은 초본 또는 목본 식물 종 (들깨, 애기 장대, 포플러 등)에 사용되는 최소한의 장비와 훈련을 필요로 할 수 있다는 것입니다. 그것은 단백질, 당, 지질, RNA, 바이러스 및 대사 산물의 후속 분석을 위해 사용할 수있는 삼출물 합리적으로 다량 발생합니다. 그것은이 두 연구뿐만 아니라 교육 실험실에서 사용할 수있을만큼 간단합니다.
식물은 불리한 조건을 탈출 이동할 수 없습니다. 결과적으로, 그들은 환경 스트레스를 감지하는 메커니즘을 개발 유도 및 공장 전반에 걸쳐 관련 신호를 전송하고 그에 따라 개발을 조정했습니다. 두 전송 시스템은 물, 영양분 및 기타 (신호) 화합물의 분포 존재한다. 첫 번째는 목부이며, 일반적으로 물을 수송과 미네랄은 식물 전체에 뿌리에 의해 흡수하는. 두 번째는 사부입니다. 사부의 뷰가 RNA에 대한 간단한 동화 교통 시스템에서 도관으로 변경, 단백질, 바이러스, 지질 및 다른 작은 분자. 그것은에 중요한 역할을 동화 양분 교통, 생물 및 비 생물 적 스트레스에 대한 반응뿐만 아니라 식물의 성장과 발전에서와 같이. 그것은 지금 공장 18의 "정보 고속도로"라고합니다.
사부 실질뿐만 아니라, 전문적인 동반자 CE : 사부는 여러 종류의 세포로 구성되어 있습니다LLS 및 체 요소입니다. 체 요소는 장거리 이동 사이트입니다. 방해 세로 흐름을 허용하기 위해 체 요소뿐만 아니라 핵 대부분의 세포 소기관을 누락하고 최상의 제한된 번역 기계 21, 33를 포함하는 것으로 생각되고 있습니다. 그것은 동반자 세포가 단백질과 체관 스트림 여행 다른 화합물을 합성하는 것으로 생각됩니다. 이 화합물은 다음의 원형질을 통해 체 요소에 전송되는 장거리 신호 4,16으로 작동 할 수 있습니다.
화합물의 여러 그룹이 사부의 삼출물에서 찾을 수 있습니다 :
식물 체관부와 협력의 과제는 상처를 입기에 자신을 봉인하는 능력에 달려있다. 이 사부의 삼출물을 수집하는 데 사용되는 네 가지 주요 방법이 있습니다, 그러나 그들은 선택 종에서만 작동합니다 :
1) 조롱박으로는 잎자루의 인하를 통해 사부의 삼출물의 합리적인 금액을 얻을 수있다. 손상된 세포의 오염과 초기 드롭이 제거되면, 그것은 순수한 체관부 수액 1, 15의 합리적 많은 양을 얻을 수있다. 그러나 증가 수집 시간, 액체 크로마토 그래피 방법 (미발표)에 대한가 점점 부적합이 삼출물이 두껍게 만들기. 최근 출판물은 종에 따라이 체관부 수액을 eithe에서 파생 된 것으로, 제안그것은 체 요소 (FP)에서 "모바일"체관부 수액을 포함 수행하는 동안 R fascicular (FP) 또는 extrafascicular 사부 (EP)와 그, 그것은 또한 목부 (40)을 포함 다른 세포 유형, 41 오염 경향이있다 .
2) 두 번째 방법은 줄기 나 잎자루 얕은 상처 나 구멍을 통해 체관부 수액을 얻을 수있다. 이 방법은 피나 17, 25, 조롱박 36, 그리고 브라 시카 napus 12에서 성공적으로 사용되었습니다. 여기에 부상 세포의 오염을 최소화하고 매우 순수한 삼출물. 그러나 식물은 매우 선택적으로 구멍을 막 체 요소에 도전하기 때문에 건강하고 잘 급수 할 필요가있다. 목부 혈관이 다친 경우, 모든 삼출물이 목부 스트림으로 그려집니다. 이것은 매우 허약하거나 매우 lignified 잎자루 또는 줄기를 가진 식물에 적합하지 않은 방법을합니다.
3) 진딧물 stylectomy는 진딧물이 체 요소로 자신의 탐침을 삽입 할 수 있습니다N 레이저 진딧물을 제거. 체관부 수액은 나머지 탐침 2, 9, 10, 35, 38을 통해 발산된다. 이론적으로는 진딧물에 의해 감염 될 수있는 공장이 방법을 사용할 수 있습니다. 그러나, 대부분의 온실 또는 성장 챔버 관리자는 병원체의 사용을 지원하지 않습니다. 또한, 진딧물은 침 19, 33과 체관에 여러 단백질을 소개합니다. 이 30 프로그래밍 제한된 전사에 이르게과 체관 구성 26 변경 가능성이 있습니다.
4) 여기에서 설명하는 방법은 체관부 수액 EDTA-촉진 삼출물이다. 이 방법은 체관 (20)의 바다 표범 어업을 방지하기 위해 EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)을 사용합니다. EDTA는 칼슘 2 + 그렇지 않으면 체관을 밀봉하는 과정에 참여하는 것이 이온을 킬레이트. EDTA는 세포 손상 30로 이어질 수 있지만, 몇몇 그룹은 세포의 미세 구조 또는 phloe 20 mm까지이 방법을 사용하고 10 MM에서 EDTA 농도의 부정적인 영향을 관찰 한M 적재 및 운송 5, 24. 어떤 파괴적인 효과뿐만 아니라 크로마토 그래피 및 겔 전기 영동과 EDTA의 간섭을 줄이기 위해 식물은 1 시간 후 물에 이동되고 삼출물 만 후반부는 14 사용됩니다. 따라서, 오히려 EDTA로 스며 나옴보다, 사부 물 (EDTA-촉진 스며 나옴)로 exudated 있습니다. 그것은 사부의 삼출물의 수집을위한 똑 바른 앞으로, 낮은 비용, 낮은 기술 방법입니다. 체관부 수액이 방법은 단백질, 작은 분자, 지질 및 RNA를 분석하는 데 사용할 수 있습니다 얻고 많은 식물에서 성공적으로 사용되었습니다. 실험의 제한된 양의 외떡잎 11에서 수행하고있는 동안,이 메소드는 dicots (들깨 17, 20, 애기 장대 8, 13, 14, 포플러 7)에 더 적합 할 것으로 보인다. 삼출물의 컬렉션 증산을 통해 삼출물의 손실을 피하기 위해 다습 한 환경에서 발생합니다. 식물에 따라 1 ~ 2 시간 EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)의 배양은사부 / 체 요소의 바다 표범 어업을 방지하기에 충분. 이 컬렉션은 다음 물에 발생할 수 있습니다. 이 EDTA 세포의 구조와 안정성에 미치는 부정적인 영향을 방지하는 이점을 갖고있다. 또한 HPLC 또는 SDS-PAGE와 같은 방법으로 EDTA의 간섭을 제거합니다. 이 애기 장대에 적용이 표시됩니다. 큰 식물, EDTA 및 삼출물 컬렉션의 배양은 최대 크기를 조정해야합니다 오히려 1.7 ML 반응 관에 비해 커에 수행됩니다.
사부 삼출물의 EDTA-촉진 컬렉션은 매우 간단합니다, 최소한의 장비를 필요로하고, 대부분의 식물에 적용됩니다. 전반적으로,이 방법은 더 많은 종 사부 삼출물을 분석 할 수있는 능력을 확장합니다. 삼출물이 희석되어 있지만, 그것은 물질의 다량을 확장 할 여러 가지 샘플을 수집하거나 많은 식물에서하기 쉽다. 이는 매우 낮은 풍부하고 간과 될 새로운 화합물의 검출을 할 수 있습니다.
이 방법은 여러 식물 종에 사용이 원고에 나와있는 것들에 대한 설명으로 작동 할 수 있습니다. 새로운 종을 탐구하는 경우 수정해야 할 두 가지 측면 사용되는 나뭇잎과 삼출물의 시간의 번호입니다. 대부분의 경우, 주 5 일 8 시간 삼출물이 적합해야합니다. 새로운 종의 식물이 메서드를 사용하는 방법을 확인하려면, 삼출물 프로토콜 제 4 N에 설명 된대로 수집 이후 분석 중 하나 이상을해야합니다eeds을 수행 할 수 있습니다. 관찰 된 신호의 강도에 따라 수집 볼륨은 최대 크기를 조정해야 할 수도 있습니다. 전자는 사부의 삼출물 덜 풍부하기 때문에 일반적으로, 지질 및 단백질 분석은 설탕과 대사 산물 분석보다 더 많은 자료가 필요합니다.
EDTA-촉진 삼출물 컬렉션 잘라 표면뿐만 아니라 EDTA의 잠재적 손상 효과를 포함하기 때문에, 여러 가지 점을 고려 할 수있다 : (1) EDTA와 함께 한 시간 배양 한 후, 잎자루는 철저하게 세척해야합니다. 이 상처 입은 세포뿐만 아니라 세포를 손상 시키거나 추출을 방해 할 수 EDTA 자체에서 얻은 화합물을 제거한다. (2) 긍정적이고 부정적인 컨트롤 얻은 데이터가 체관부 수액에서 파생되도록 포함될 필요하지 손상된 세포 (아래 중요한 단계 참조). (3) 체관부 수액 삼출물 수집하는 동안 활성화 될 수있는 몇 가지 효소를 포함한다. 따라서, 어떤 경우에는 FO를 수집하는 것이 유용 할 수 있습니다시간의 R 다른 양. 방법은 물에 스며 나옴을 포함하기 때문에 (4), 화합물의 절대 정량 할 수 없습니다.
중요한 단계 (. REF 참조 14) 해당 컨트롤의 세포뿐만 아니라 사용을 손상하지 않는 샘플을 처리하는 동안이 메서드의 성공적인 사용의 핵심은주의를 사용하는 것입니다. 한 적절한 컨트롤은 EDTA와 사전 처리없이 사부의 삼출물의 모음입니다. 이 경우 체관 자체를 밀봉하고 더 삼출물을 수집 할 수 없습니다. 상처 입은 세포에서 나오는 모든 오염 물질이 여기에 감지됩니다. 두 번째 컨트롤은 삼출물에있는 설탕의 분석 될 것이다. 애기 장대에서, 자당는 1:4 1시 8분 (REF 8, 14) 사이의 크로스 비율 과당, 체관부 수액에서 주된 대사 산물이어야한다.
RNA 추출을위한 RNA 분해 효소 억제제의 사용이 필요합니다. 이전 describ의 또한, 양성 대조군ED 사부 현지화 발현 (UBC9 : 유비퀴틴 결합시키는 효소 9 At4g27960, 8, 14) 예를 들면의 부정적인 제어 엽록체의 mRNA (Rubisco LSU)가 바람직하다.
삼출물이 활성 효소를 포함하고 있기 때문에, 시간 코스 수집 시간의 변화에 단순히 때문이 사부 프로필에서 확인을 변경하는 것이 좋습니다. 경우에 따라서는 단백질 분해 효소 억제제를 사용하는 것이 도움이 될 수 있습니다. 그러나 연구자는 수집 된 삼출물이 집중 추가 된 화합물은 주로 집중 될 것이라는 될 것을 명심해야합니다. 프로토콜에서 두 번째 중요한 단계는 EDTA 아래 잎자루의 다시합시다입니다. 이 단계는 이중 목적을 제공합니다 : 새로운 따라서 체관부 수액의 자유로운 흐름을 허용하는 플러그의 형성을 방지하면서 첫째, 어떤 밀봉 체 플레이트를 제거합니다. 둘째, 절단 동안 생성 된 목부에서 캐비테이션 거품을 제거하기 때문에 목부 전송 할 수 있습니다. 두 번째 컷의 크기는 좌우사용되는 식물에의. 큰 잎자루를 가진 식물은 애기 장대 같은 식물에서 첫 번째 컷, 위의 몇 밀리미터 (최대 1cm)이어야한다 1-2 MM은 충분하다.
이 방법의 사용은 개발 또는 생명 영향을 신호 수도 사부 삼출물에있는 새로운 화합물의 발견으로 이어질 수 있습니다. 그것은 사부에 대한 접근의 부족으로 인해 식물 과학에서 거의 연구 된 분야였다 장거리 지질 신호,에서 깊이있는 모습 더하라는 메시지가있다.
The authors have nothing to disclose.
이 작품은 국립 과학 재단 NSF-IOS 부여 # 1144391에 SHB에 의해 지원되었다.
K2-EDTA | Sigma-Aldrich | ED2P-500G | |
Shallow Glass or plastic Petri Dish (7-15 cm) | PYREX or Corning | Any clean, shallow dish will work | |
Chloroform | EMD | CX1054-1 | Only open containers in fume hood |
Methanol | J.T.Baker | 9070-03 | |
Screw cap tubes | VWR International | 53283-800 | |
Screw cap tubes | Sun Sri | 13-425 | |
Eppendorf tubes | Denville | C2170 |