O conhecimento da composição da seiva floema, bem como o seu mecanismo de carregamento e de longa distância de transporte é essencial para a compreensão de sinalização de longa distância no desenvolvimento das plantas e stress / agente patogénico e da resposta assimilar transporte. Este manuscrito descreve a recolha de exsudados do floema, utilizando o método de EDTA-facilitada.
O floema da planta é essencial para o transporte de longa distância de (foto-) assimila, bem como de transmissão de sinais de estresse biótico ou abiótico. Ele contém açúcares, aminoácidos, proteínas, lípidos, RNA e outros metabolitos. Enquanto existe um grande interesse no entendimento da composição e função do floema, o papel de muitas destas moléculas e, assim, a sua importância no desenvolvimento das plantas e de resposta ao estresse ainda tem de ser determinado. Um obstáculo para a análise floema reside no facto de que as vedações floema ferindo-se sobre. Como resultado, o número de plantas a partir de seiva floema que podem ser obtidos é limitada. Um método que permite a recolha de floema exsudados de várias espécies de plantas sem equipamento adicional é a recolha de exsudado floema EDTA facilitada descrito aqui. Embora seja fácil de utilizar, embora promova o ferimento de células e cuidado deve ser tomado para remover o conteúdo das células danificadas. Além disso, os vários controlos para comprovar a pureza do exsudadosão necessárias. Porque é uma exsudação ao invés de uma recolha directa de seiva do floema (não é possível em muitas espécies) só quantificação relativa de seus conteúdos podem ocorrer. A vantagem deste método é que, sobre os outros, pode ser usada em muitas espécies de plantas herbáceas ou lenhosas (Perilla, Arabidopsis, choupo, etc), e requer equipamento e formação mínima. Isso leva a uma razoavelmente grandes quantidades de exsudados que podem ser utilizados para a análise subsequente das proteínas, açúcares, lípidos, RNA, vírus e metabolitos. É suficientemente simples que pode ser usado tanto em uma investigação, bem como num laboratório de ensino.
As plantas não podem mover-se para escapar condições adversas. Conseqüentemente, eles tiveram que desenvolver mecanismos para detectar estresses ambientais, obter e transmitir um sinal relacionado com toda a planta, e ajustar o desenvolvimento em conformidade. Existem dois sistemas de transporte para a distribuição de água, nutrientes e outros compostos (sinalização). O primeiro é o xilema; que normalmente transporta água e sais minerais absorvidos pelas raízes ao longo da planta. A segunda é o floema. O ponto de vista do floema mudou de uma simples assimilar sistema de transporte para um canal de RNA, proteínas, vírus, lipídios e outras moléculas pequenas. Ela desempenha um papel importante no transporte de nutrientes e assimilar, a resposta ao stress abiótico e biótico, bem como no crescimento e desenvolvimento da planta. Ele agora é chamado de "superestrada da informação" da planta 18.
O floema é constituído por vários tipos de células: parênquima do floema, bem como acompanhante especializado cells e elementos peneira. O elemento de peneira é o local de movimento de longa distância. Para permitir o fluxo longitudinal desobstruída, elementos crivados estão faltando a maioria das organelas, bem como núcleos e são pensados para conter, no máximo, um mecanismo de translação limitado 21, 33. Acredita-se que as células de companhia sintetizar proteínas e outros compostos, que circulam na corrente de floema. Estes compostos são, em seguida, transportados para o elemento de crivo através plasmodesmata e pode funcionar como sinais de longa distância 4,16.
Vários grupos de compostos podem ser encontrados em exsudatos floema:
O desafio de trabalhar com o floema planta reside na sua capacidade de selar-se sobre o ferimento. Existem quatro principais métodos utilizados para recolher floema exsudato, mas eles só funcionam em selecionar espécies:
1) Em cucurbitáceas é possível obter quantidades razoáveis de floema de exsudado através de cortes do pecíolo. Uma vez que a queda inicial de contaminação de células lesionadas é removido, é possível obter grandes quantidades de razoavelmente pura seiva floema 1, 15. No entanto, com o aumento do tempo de recolha, este exsudado engrossa, tornando-se cada vez inadequados para abordagens de cromatografia líquida (não publicados). Publicações recentes sugerem, que, dependendo das espécies, isto é seiva floema derivado either o fascículo (PF) ou o extrafascicular floema (PE) e que, ao mesmo tempo que contém "móvel" seiva floema dos elementos de peneira (PF), que é também propensas à contaminação a partir de outros tipos de células, incluindo o xilema 40, 41 .
2) A segunda abordagem é a obtenção de floema a seiva através de cortes rasos ou furos no caule ou pecíolo. Este método tem sido utilizado com sucesso no tremoço 17, 25, 36 cucurbitáceas, Brassica napus e 12. Aqui, a contaminação a partir de células lesionadas é mínima e que os exsudados muito puro. No entanto, as plantas precisam de ser saudável e bem regada, pois é muito desafiador para perfurar seletivamente apenas os elementos crivados. Se vasos do xilema são cortados, todos exsudato é atraído para o fluxo do xilema. Isso faz com que o método inadequado para as plantas com pecíolos e hastes muito frágeis ou altamente lignificado.
3) stylectomy pulgão permite pulgões para inserir seu estilete para os elementos crivados an removendo o pulgão com um laser. Floema seiva é exalava através do restante estilete 2, 9, 10, 35, 38. Em teoria, qualquer planta que pode ser infectada pelos pulgões podem ser usadas para esta abordagem. No entanto, a maioria estufa ou gerentes câmara de crescimento não vai apoiar o uso de um patógeno. Além disso, os pulgões introduzir várias proteínas no floema com a saliva 19, 33. Isto conduz a uma transcrição limitado reprogramação 30 e tem o potencial de alterar a composição do floema 26.
4) O método descrito aqui é o EDTA-exsudação facilitada de seiva floema. Este método emprega EDTA para impedir a selagem do floema 20. Quelatos de EDTA de Ca 2 + que os iões que participam nos processos de outro modo que o selo do floema. Embora o EDTA pode levar a danos nas células 30, vários grupos têm utilizado este método e observou qualquer efeito adverso de concentrações de EDTA 10 mM a 20 mM na ultra-estrutura celular, ou na phloem carregamento e transporte 5, 24. Para reduzir o efeito prejudicial assim como interferências de EDTA, com cromatografia e electroforese em gel, as plantas são movidas para a água depois de 1 h, e apenas a parte posterior do exsudado é usada 14. Assim, em vez de exsudação em EDTA, floema é exsudado em água (EDTA facilitada exsudação). É um método simples e direta, de baixo custo e baixa tecnologia para a coleta de exsudato do floema. Seiva floema obtido desta forma pode ser utilizado para analisar as proteínas, moléculas pequenas, lípidos, e RNAs e tem sido utilizado com sucesso em muitas plantas. Embora uma quantidade limitada de experiências foi realizado em 11 de monocotiledóneas, o método parece ser mais adequado para dicots Perilla (17, 20, Arabidopsis 8, 13, 14, Álamo 7). Coleção de exsudato tem que ocorrer em um ambiente úmido para evitar a perda de exsudato através da transpiração. Consoante a planta, a incubação em EDTA para uma a duas horas ésuficiente para prevenir a vedação dos elementos de floema / peneira. A coleção pode ocorrer na água. Isto tem a vantagem de evitar o efeito negativo sobre o EDTA tem a estrutura celular e estabilidade. Também elimina a interferência de EDTA, com métodos como HPLC ou SDS-PAGE. Ele é mostrado como ele se aplica a Arabidopsis. Para plantas maiores, incubação em EDTA e exsudato colecções tem que ser aumentado e é realizado em provetas em vez de tubos de reacção de 1,7 ml.
A recolha de EDTA-facilitada de floema exsudados é muito simples, necessita de equipamentos mínima, e é aplicável para a maioria das plantas. Em geral, este método aumenta a capacidade para analisar exsudato floema de mais espécies. Embora o exsudado é diluída, é fácil de recolher muitas amostras diferentes ou a partir de muitas plantas de escala até uma grande quantidade de material. Isto permite então que para a detecção de novos compostos que são em muito baixa abundância e, de outro modo ser ignorada.
Este método pode ser usado para várias espécies de plantas e funciona como descrito para os listados neste manuscrito. Se novas espécies são exploradas, os dois aspectos que podem precisar de modificação são o número de folhas usadas eo tempo de exsudação. Na maioria dos casos, de cinco a oito horas de exsudação deve ser apropriada. Para confirmar a utilização deste método para uma nova espécie de planta, exsudado precisam de ser recolhidos e um ou mais de a análise subsequente tal como descrito no protocolo da peça 4 nEEDS a ser executada. Dependendo da intensidade do sinal observado, o volume de recolha pode precisar de ser melhorados. Em geral, os lípidos e análise de proteínas requer mais material do que a análise de açúcar e metabolito desde as primeiras são menos abundantes no floema exsudados.
Porque a recolha de exsudado EDTA facilitada envolve superfícies de corte, bem como um efeito potencialmente nocivo de EDTA, vários pontos tem que ser considerados: (1) após a incubação de uma hora com EDTA, os pecíolos têm de ser lavados. Isto remove os compostos obtidos a partir de células feridas, bem como a própria EDTA, o que poderia danificar as células ou interferir com a extracção. (2) Para os controlos positivos e negativos devem ser incluídos para assegurar que os dados obtidos são derivados de seiva floema e não a partir de células lesadas (ver passos críticos abaixo). (3) Floema seiva contém várias enzimas, que poderiam ser ativo durante a coleta de exsudato. Assim, em alguns casos, pode ser útil para recolher for diferentes quantidades de tempo. (4) Uma vez que o método envolveu a exsudação em água, a uma quantificação absoluta dos compostos não é possível.
Etapas críticas: A chave para o sucesso do uso deste método é o uso de cautela ao manusear a amostra para não ferir as células, bem como o uso de controles apropriados (ver ref 14.). Um controle adequado é a coleção de floema exsudato sem tratamento prévio com EDTA. Neste caso, o floema vedará si e nenhum exsudado pode ser recolhido. Quaisquer compostos contaminantes provenientes das células feridos será detectado aqui. Um segundo controlo seja a análise de açúcares no exsudado. Na Arabidopsis, a sacarose deve ser o metabolito predominante na seiva floema, com sacarose, frutose a proporção de 01:04 – 01:08 (Ref. 8, 14).
Para extracção de RNA é necessária a utilização de um inibidor de RNAse. Além disso, um controlo positivo de anteriormente descrevendoed mRNA floema localizada (Ubc9: Ubiquitin enzima conjugante 9, At4g27960, 8, 14) e um controle negativo de, por exemplo, um mRNA cloroplasto (Rubisco LSU) são aconselháveis.
Como o exsudado contém enzimas activas, um curso de tempo é aconselhável fazer alterações no perfil certo floema não são simplesmente devido a variações no tempo de recolha. Em alguns casos, pode ser benéfico utilizar os inibidores de proteases. No entanto, os investigadores precisam ter em mente, que o exsudato coletado será concentrada e que os compostos adicionados será em grande parte concentrada. Um segundo passo crítico no âmbito do protocolo é o recutting do pecíolo em EDTA. Este passo serve um propósito duplo: Em primeiro lugar, são removidos todos os pratos perfurados selado, evitando a formação de novas velas permitindo assim o livre fluxo da seiva floema. Segunda, ele remove a bolha de cavitação no xilema gerado durante o corte e, assim, permite o transporte do xilema. O tamanho do segundo corte dependems de plantas utilizadas. Em plantas com pecíolos maiores deve ser de vários milímetros (superior a 1 cm) sobre o primeiro corte, de plantas como a Arabidopsis, são suficientes 1-2 mm.
A utilização deste método pode conduzir à descoberta de novos compostos em exsudatos do floema que poderiam ter de sinalização, de desenvolvimento ou implicações biomédicas. Ele levou um olhar mais aprofundado na sinalização de lipídios de longa distância, o que era um campo pouco estudado dentro da ciência da planta, devido à falta de acesso ao floema.
The authors have nothing to disclose.
Este trabalho foi financiado pela National Science Foundation-NSF IOS concessão # 1144391 a SHB.
K2-EDTA | Sigma-Aldrich | ED2P-500G | |
Shallow Glass or plastic Petri Dish (7-15 cm) | PYREX or Corning | Any clean, shallow dish will work | |
Chloroform | EMD | CX1054-1 | Only open containers in fume hood |
Methanol | J.T.Baker | 9070-03 | |
Screw cap tubes | VWR International | 53283-800 | |
Screw cap tubes | Sun Sri | 13-425 | |
Eppendorf tubes | Denville | C2170 |