Знание состава флоэмы SAP, а также механизм ее транспортной нагрузки и междугородной имеет важное значение для понимания дальней сигнализации в развитии завода и стресс / патоген ответ и ассимилировать транспорта. Эта рукопись описывает набор экссудаты флоэмы использованием ЭДТА способствует методом.
Флоэмы растений имеет важное значение для дальней транспортировки (фото-) усваивает, а также сигналов передачи биотических или абиотических стрессов. Он содержит сахара, аминокислоты, белки, РНК, липидов и других метаболитов. В то время как существует большой интерес к пониманию состав и функции флоэмы, роль многих из этих молекул и, таким образом, их значение в развитии растений и стрессовые реакции до сих пор не определен. Одним из препятствий для анализа флоэмы заключается в том, что флоэмы уплотнения себя на ране. В результате, количество растений, из которых флоэмы сок может быть получена ограничено. Один из методов, который позволяет коллекцию экссудата флоэмы из нескольких видов растений без добавления оборудования ЭДТА при содействии флоэмой экссудата коллекции описаны здесь. Хотя это легко в использовании, это и ведет к ранению клетки и уход должны быть приняты, чтобы удалить содержимое поврежденных клеток. Кроме того, несколько элементов управления, чтобы доказать чистоту экссудатанеобходимы. Потому что это экссудата, а не прямого сбора флоэмы SAP (не для многих видов) лишь относительное количественное его содержание может произойти. Преимущество этого метода по сравнению с другими является то, что она может быть использована во многих травянистых или древесных растений (периллы, Arabidopsis, тополь и т.д.) и требует минимального оборудование и обучение. Это приводит к достаточно большого количества экссудатов, которые можно использовать для последующего анализа белков, сахара, липиды, РНК вирусов и метаболитов. Он достаточно прост, что его можно использовать как в исследованиях, а также в учебном лаборатории.
Растения не могут двигаться, чтобы избежать неблагоприятных условиях. Следовательно, они должны были разработать механизмы выявления экологических стрессов, выявить и передать сигнал связанной по всему растению, а также настроить развития соответственно. Два транспортных систем существуют для распределения воды, питательных веществ и других (сигнализация) соединений. Первый ксилемы; который обычно перевозит воду и минеральные вещества поглощается корнями по всему растению. Второй флоэмы. Ввиду флоэмы изменились по сравнению с простым ассимилировать транспортной системы с трубопроводом для РНК, белки, вирусы, липиды и другие малые молекулы. Она играет важную роль в ассимилировать и перенос питательных веществ, реакция на биотических и абиотических стрессов, а также в росте и развитии растений. Это теперь называется "информационной магистрали" растения 18.
Луб состоит из нескольких типов клеток: паренхимы флоэмы, а также специализированных спутника CELLS и сито элементов. Элемент сита является местом междугородной движения. Для обеспечения беспрепятственного продольного потока, сито элементы отсутствуют наиболее органелл, а также ядер и, как полагают, содержат в лучшем случае ограниченную поступательную машины 21, 33. Считается, что спутник клетки синтезируют белки и другие соединения, которые перемещаются в потоке флоэмы. Эти вещества затем транспортируется в сито элемент через плазмодесмы и может функционировать до тех пор, сигналы расстояние 4,16.
Некоторые группы соединений можно найти в экссудаты флоэмы:
Задача в работе с завода флоэмой заключается в его по герметизации себя на ранение. Существуют четыре основных методов, используемых для сбора экссудата флоэмы, но они работают только на некоторых видов:
1) В тыквенных можно получить достаточную количества экссудата флоэмы через разрезы черешок. Как только начальный перепад с загрязнением поврежденных клеток удаляется, можно получить достаточно большое количество чистого флоэмы сок 1, 15. Однако с увеличением времени сбора, это экссудата утолщается, что делает его непригодным для более жидких подходы хроматографии (не опубликовано). Последние публикации предложить, что в зависимости от вида, это флоэмой SAP является производным от eitheR пучковой (FP) или extrafascicular флоэмы (EP) и что, хотя он содержит «мобильной» флоэмой сок из элементов сита (FP), также склонны к загрязнению от других типов клеток, в том числе ксилемой 40, 41 .
2) Второй подход заключается в получении флоэмой SAP через порезы или мелкие проколы в стебель или черешок. Этот метод успешно применяется в 17 люпина, 25, 36 тыквенных и Brassica париз 12. Здесь загрязнение от поврежденных клеток является минимальным и выделения очень чистого. Тем не менее, растения должны быть здоровыми и хорошо поливают так как это очень сложно избирательно прокол только те элементы, сита. Если сосуды ксилемы являются рваные все экссудата всасывается в ксилемы поток. Это делает его малопригодным для растений с очень хрупкие или сильно одревесневшие стебли или черешки.
3) тли тлей stylectomy позволяет вставить их стилет в решето элементовн удалением тли с помощью лазера. Флоэмы сок излучал через остальные зонд 2, 9, 10, 35, 38. В принципе, любое растение, которое может быть заражен тли могут быть использованы для этого подхода. Однако большинство менеджеров теплице или камере роста не будет поддерживать использование патогена. Кроме того, тля ввести несколько белков в флоэмы с их слюне 19, 33. Это приводит к ограниченному транскрипционные перепрограммирования 30 и имеет потенциал, чтобы изменить состав флоэмы 26.
4) метод, описанный здесь является ЭДТА при содействии экссудации флоэмы SAP. Этот метод использует ЭДТА для предотвращения уплотнения флоэмы 20. Хелатов ЭДТА ионов Са 2 +, которые могли бы участвовать в процессах, которые запечатывают флоэмы. В то время как ЭДТА может привести к повреждению клеток 30, несколько групп использовали этот метод и не наблюдалось негативного влияния концентрации ЭДТА от 10 мм до 20 мм ультраструктуры клеток или на phloeм погрузки и транспортировки 5, 24. Для уменьшения вредного воздействия, а также помехи ЭДТА с хроматографию и гель-электрофорез, растения перемещаются в воде после 1 ч и только поздней части экссудата используется 14. Таким образом, вместо экссудата в ЭДТА, флоэме имеет exudated в воду (ЭДТА способствует экссудации). Это прямо вперед, низкой стоимостью и низкой технологий метод для сбора выделений флоэмы. Флоэмы сок полученный таким образом, может быть использована для анализа белков, малые молекулы, липиды и РНК, и была успешно использована во многих растениях. В то время как ограниченное количество экспериментов была выполнена в однодольных 11, метод оказывается более подходящим для двудольных (17 периллы, 20, Arabidopsis, 8, 13, 14, тополь 7). Коллекция экссудаты должно произойти во влажной среде, чтобы избежать потери экссудаты через испарение. В зависимости от растения, инкубации в ЭДТА от одного до двух часовдостаточным для предотвращения уплотнения флоэмы / сито элементов. Коллекция может произойти в воду. Это имеет то преимущество, предотвращая негативное воздействие ЭДТА имеет на клеточной структуры и стабильности. Это также исключает помехи ЭДТА с методов, таких как ВЭЖХ или SDS-PAGE. Показано, как он относится к Arabidopsis. Для более крупных растений, инкубации в ЭДТА и экссудата коллекции должна быть сокращена и выполняется в стаканы, а не в 1,7 мл пробирок.
ЭДТА при содействии коллекция флоэмой экссудата очень прост, требует минимального оборудования и подходит для большинства растений. В целом, этот метод расширяет возможности для анализа флоэмой экссудата из более видов. Хотя экссудата разбавляют, легко собрать много различных образцов или из многих растений масштабирования до большого количества материала. Затем это позволяет для обнаружения новых соединений, которые находятся в очень низкой численности и могли бы быть пропущены.
Этот метод может быть использован для нескольких видов растений и работает, как описано для перечисленных в этой рукописи. Если новые виды изучены, два аспекта, которые, возможно, потребуется модификация являются количество используемых листьев и время экссудации. В большинстве случаев 7:55 час экссудации должны быть пригодными. Чтобы подтвердить использование этого метода для новых видов растений, экссудат должна быть собрана и один или более из последующего анализа, как описано в протокольной части 4 нГКПЗ должна быть выполнена. В зависимости от интенсивности сигнала наблюдалось, сбор объема возможно, должны быть расширены. В общем, липидного и белкового анализа потребуется больше материала, чем сахар и анализ метаболитов с бывшим менее распространены в экссудата флоэмы.
Поскольку ЭДТА при содействии экссудата коллекция включает сократить поверхностей, а также потенциально повреждающее действие ЭДТА, несколько точек должны быть рассмотрены: (1) после одного часа инкубации с ЭДТА, черешки должны быть тщательно вымыты. Это устраняет любые соединения, полученные из раненых клеток, а также ЭДТА себе, что может привести к повреждению клеток или помешать экстракции. (2) Положительные и отрицательные контрольные должны быть включены для обеспечения полученные данные, полученные из флоэмы SAP, а не от поврежденных клеток (см. критические шаги ниже). (3) Флоэма SAP не исключает ряда ферментов, которые могли бы быть активными во время экссудата коллекции. Таким образом, в некоторых случаях может быть полезно для сбора лR разное количество времени. (4) Так как способ включал экссудации в воду, абсолютный количественный соединений невозможно.
Критические шаги: Ключ к успешному применению этого метода является использование осторожность при обращении с образцом, чтобы не травмировать любые клетки, а также использование соответствующего контроля (см. 14.). Один подходящий управления сбором экссудаты флоэмы без предварительной обработки с ЭДТА. В этом случае флоэмой будет печать себе и не экссудата не могут быть собраны. Любые загрязнения соединениями Исходя из раненых клетки будут обнаружены здесь. Второй элемент управления будет анализ сахара в экссудата. В Arabidopsis, сахароза должна быть преобладающей метаболита в флоэмы SAP, с фруктозу сахарозу соотношении от 1:4 до 1:08 (8 Ref, 14).
Для выделения РНК применение ингибитора РНКазы является необходимым. Кроме того, положительный контроль ранее описывающиеЭд флоэмой локализованных мРНК (UBC9: Убиквитин Сопрягающее фермента 9, At4g27960, 8, 14) и отрицательный контроль например хлоропластов мРНК (Rubisco ЛГУ) целесообразны.
Поскольку экссудат содержит активные ферменты, время конечно рекомендуется убедиться, что изменения в профиле флоэмы не просто из-за изменения времени сбора. В некоторых случаях может быть полезно использовать ингибиторы протеиназы. Тем не менее, исследователи должны иметь в виду, что собранные экссудата будут сосредоточены и добавил, что любые соединения будут в основном сосредоточены. Второй важный шаг в протокол перекройки черешка под ЭДТА. Этот шаг служит двойной цели: во-первых, он удаляет имеющиеся закрытые сетчатыми тарелками, предотвращая образование новых свечах что позволяет обеспечить свободный поток флоэме SAP. Во-вторых, он удаляет пузырька в ксилемы генерируется во время резки и таким образом позволяет ксилемы транспорта. Размер второго разреза зависитс на растениях, используемых. В установках с большим черешки она должна быть на несколько миллиметров (до 1 см) выше первого разреза, в растениях Arabidopsis как, 1-2 мм достаточно.
Использование этого метода может привести к открытию новых соединений в флоэмы экссудата, которые могли бы сигнализацию, развитием или биомедицинские последствия. , Послужила толчком к более глубокий взгляд на междугородние липидов сигнализации, который был малоизученной области в рамках науки о растениях в связи с отсутствием доступа к луб.
The authors have nothing to disclose.
Эта работа выполнена при поддержке Национального научного фонда NSF-IOS грант № 1144391 в ШБ.
K2-EDTA | Sigma-Aldrich | ED2P-500G | |
Shallow Glass or plastic Petri Dish (7-15 cm) | PYREX or Corning | Any clean, shallow dish will work | |
Chloroform | EMD | CX1054-1 | Only open containers in fume hood |
Methanol | J.T.Baker | 9070-03 | |
Screw cap tubes | VWR International | 53283-800 | |
Screw cap tubes | Sun Sri | 13-425 | |
Eppendorf tubes | Denville | C2170 |