远距离信号指示的理解,在植物生长发育和应力/病原体的反应和吸收运输的韧皮部汁液的组合物,以及其加载和长途运输的机制的知识是至关重要的。此手稿描述的韧皮部分泌物使用EDTA促进方法的集合。
植物韧皮部是必不可少的长途运输(照片)以及输送生物或非生物胁迫的信号同化。它含有糖,氨基酸,蛋白质,RNA,脂质和其他代谢产物。理解的组成和功能的韧皮部,许多这些分子的作用,从而虽然是一个大的兴趣,在植物发育和应力响应的重要性尚未确定。韧皮部分析的一个障碍在于韧皮部密封后伤人的事实。其结果是,从该植物韧皮部汁液可以得到的数量是有限的。的一种方法,该方法允许韧皮部的排泄物收集不增加设备的一些植物物种是这里所描述的EDTA-促进的韧皮部渗出物的收集。虽然很容易使用,它导致伤人的细胞和护理注意消除受损细胞的内容。此外,有几个控制,以证明渗出液的纯度是必要的。因为它是一个而不是直接收集韧皮部汁液(不可能在许多物种)相对定量其内容可以发生渗出。比其他的这种方法的优点是它可以被用在许多草本或木本植物物种( 紫苏 , 拟南芥 , 杨树 , 等 ),并需要最少的设备和培训。它会导致相当大的蛋白质,糖类,脂类,RNA,病毒和代谢物用于随后的分析,可用于大量的排泄物。这是很简单的,它可以用来在一个研究中,以及在一个教学实验室。
植物不能移动摆脱不利条件。因此,他们不得不开发机制来检测环境压力,引起整个工厂和传输相关的信号,并相应地调整发展。两个运输系统存在的水,营养物和其他化合物(信令)的分布。首先是木质部;,通常输送水和矿物质,整个植物的根。第二个是韧皮部。韧皮部的图已经改变从一个简单的吸收运输系统的导管用于RNA,蛋白质,病毒,脂质和其它小分子。它起着重要的作用,吸收和养分运输,生物和非生物胁迫的响应,以及在植物生长和发育。它现在被称为“信息高速公路”的植物18。
韧皮部是由多种细胞类型:韧皮薄壁,以及专门的伴侣CELLS和筛分子。筛元素是长距离的移动网站。要允许纵向流动通畅,筛分子最缺少的细胞器,以及原子核和被认为含有充其量只是一种有限的平移机械21,33。据认为,伴随细胞合成蛋白质和其它化合物,在韧皮部流旅行。然后,这些化合物是通过胞间连丝运送到筛分子,可以作为长距离信号4,16。
可以发现在韧皮部的排泄物的几组化合物:
植物韧皮部工作的挑战在于它的容量密封后伤人。有四个主要用来收集韧皮部分泌物的方法,但他们只能在选择物种:
1)在葫芦科植物,它是通过削减叶柄未能取得合理数量的韧皮部渗出。一旦最初的下降与损伤的细胞的污染被除去,这是可以取得相当大的量的纯韧皮部汁液1,15。然而,随着收集时间,这样的渗出物变稠,使其越来越不适合用于液相色谱的方法(未发表)。最近的出版物表明,韧皮部汁液取决于物种,这是源于要么r的束状(FP)的:韧皮部extrafascicular(EP),而它确实包含“移动”的韧皮部筛分子(FP),也容易污染其他类型的细胞,包括木质部40,41 。
2)第二种方法是通过茎或叶柄浅切口或穿刺获得韧皮部汁液。该方法已被成功地使用,羽扇豆17,25,36葫芦科, 甘蓝型油菜 12。这里的污染是最小的,从受伤的细胞的分泌物很纯。然而,植物需要是健康和浇灌的,因为它是非常具有挑战性的选择性穿刺只是筛分子。如果木质部缺口,所有被抽入木质部流渗出。这使得该方法不适合非常脆弱或高度木质化叶柄或茎的植物。
3)蚜虫stylectomy允许他们的短剑插入到筛分子蚜虫Ñ用激光消除蚜虫。韧皮部汁液渗出,通过剩余的短剑2,9,10,35,38。从理论上讲,这种方法可用于任何被感染的植物,可以由蚜虫。然而,大多数温室或生长室经理将不支持使用的病原体。此外,蚜虫介绍几种蛋白质进入韧皮部与他们的唾液19,33。这将导致一个有限的转录重编程30,有可能改变韧皮部组合 物26。
4)这里介绍的方法是EDTA促进韧皮部汁液渗出。该方法采用EDTA的韧皮部20,以防止密封。 EDTA螯合的Ca 2 +离子,否则将参加密封韧皮部的进程。虽然EDTA可导致细胞的损伤30,几组都使用此方法,并没有观察到不利影响的10mM的EDTA的浓度从20mM的的细胞超微结构上phloe的上24米5,装载和运输。为了减少任何破坏性影响以及干扰EDTA与色谱和凝胶电泳,植物搬进水1小时后,才有了后来的渗出物的一部分用于14。因此,而非渗出物进入EDTA,韧皮部渗出水(EDTA促进渗出)。这是一个直接,成本低,技术含量低的方法收集韧皮部分泌物。韧皮部汁液这种方式获得的,可用于分析蛋白质,小分子,脂质,和RNA,并已成功地用于在许多植物中。虽然在单子叶植物11中已经执行了有限数量的实验方法,该方法似乎是更适合于双子叶植物( 紫苏 17,20, 拟南芥 8,13,14, 白杨 7)。收集分泌物发生在潮湿的环境中,通过蒸腾作用的分泌物,以避免损失。根据工厂的一到两小时,在EDTA中温育足以防止密封韧皮部/筛分子。然后集合可以发生水。这有利于防止EDTA对细胞的结构和稳定性的负面影响。它也消除了干扰的方法,如HPLC或SDS-网页的EDTA。示出,因为它适用于拟南芥 。对于较大的植物,培养在EDTA和渗出物馆藏有扩大规模,并在烧杯中进行,而不是在1.7毫升的反应管。
的EDTA促进韧皮部渗出物的收集是非常简单的,需要最少的设备,适用于大多数植物。总体而言,此方法扩展分析能力,韧皮部分泌物从更多的物种。 ,虽然渗出液稀释,很容易收集许多不同的样本,或从许多植物中,以扩展至大量的材料。这就允许检测的新的化合物在非常低丰度的,否则将被忽略。
此方法可用于多种植物物种和工作所描述的这个手稿中列出的那些。如果探索新的物种,可能需要修改的两个方面是所使用的叶片的数目和渗出的时间。在大多数情况下,一个五至八个小时渗出应该是合适的。确认使用这种方法的一个新的植物物种,需要收集渗出物和一个或多个随后的分析中所描述的协议部分4 N进行电火工品。根据观察到的信号的强度,采集量,可能需要扩大。在一般情况下,将需要更多的脂肪和蛋白质分析的材料比糖和代谢物的分析,因为前者是在韧皮部分泌物较少丰富。
EDTA-促进渗出物的收集,因为涉及切割面,以及一个潜在的破坏性的影响的EDTA,有几点必须考虑到:(1)含EDTA的一个小时的孵育后,叶柄彻底洗净。此删除任何受伤的细胞以及乙二胺四乙酸本身,这可能会损坏细胞或干扰萃取得到的化合物。 (2)阳性和阴性对照,以确保获得的数据均来自韧皮部汁液,需要包括受伤的细胞,而不是从(请参阅下面的关键步骤)。 (3)韧皮部汁液含有多种酶,这可能是活跃在渗出液收集。因此,在某些情况下可能是有用的,以收集FOŗ不同的时间。 (4)由于该方法涉及到水渗出,绝对定量的化合物是不可能的。
关键步骤:成功地使用这种方法的关键是使用谨慎处理样品的同时,不会伤害任何细胞,以及使用适当的控制(见参考文献14)。一个合适的控制是未经处理的收集韧皮部分泌物用EDTA。在这种情况下,韧皮部,将密封本身,并可以收集没有渗出液。任何污染的化合物来自受伤的细胞将被检测到。第二个控制将渗出液中糖分析。在拟南芥中,应该是蔗糖的主要代谢产物内韧皮部汁液,果糖与蔗糖比在1:4和1:8之间(参考8,14)。
提取RNA的RNA酶抑制剂的使用是必要的。此外,阳性对照先前describ的编韧皮部的本地化的mRNA(UBC9:泛素结合酶9,At4g27960,8,14)和作为阴性对照的叶绿体mRNA表达(Rubisco的LSU)例如是可取的。
由于渗出液含有活性酶,一个时间过程应确保韧皮部轮廓的变化,不只是由于集合中时间的变化。在某些情况下,它可能是有益的使用蛋白酶抑制剂。然而,调查人员需要牢记,将集中收集的渗出物和任何添加的化合物将主要集中。在协议的第二个关键步骤是再切下叶柄EDTA。这一步有两个目的:第一,它删除任何密封筛板,同时防止形成新的插头从而允许自由流动的韧皮部汁液。其次,它消除了空化泡在切割时产生的木质部,从而允许木质部运输。第二次切割的大小取决于上线使用的植物。在较大的叶柄植物,它应该是几毫米(可达1厘米)以上的首次降息, 拟南芥等植物中,1-2毫米就足够了。
使用这种方法可以发现在韧皮部的渗出液的新的化合物,可能有信号,发育或生物医学方面的影响导致。它已经引发了更深入的看看在长距离的的脂质信号,这是一个小研究植物科学领域内由于缺乏进入韧皮部。
The authors have nothing to disclose.
这项工作是由美国国家科学基金会NSF-IOS补助#1144391 SHB支持。
K2-EDTA | Sigma-Aldrich | ED2P-500G | |
Shallow Glass or plastic Petri Dish (7-15 cm) | PYREX or Corning | Any clean, shallow dish will work | |
Chloroform | EMD | CX1054-1 | Only open containers in fume hood |
Methanol | J.T.Baker | 9070-03 | |
Screw cap tubes | VWR International | 53283-800 | |
Screw cap tubes | Sun Sri | 13-425 | |
Eppendorf tubes | Denville | C2170 |