Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Biology

Indsamling og analyse af doi: 10.3791/51111 Published: October 23, 2013

Summary

Kendskab til sammensætningen af ​​Phloem saft samt den mekanisme af sin læsning og fjerntrafik er afgørende for forståelsen af ​​langdistance-signalering i plantens udvikling og stress / patogen respons og assimilere transport. Dette håndskrift beskriver indsamling af phloem exudater bruger EDTA-lettet metode.

Abstract

Anlægget Phloem er afgørende for fjerntransport af (foto-) assimilerer samt af signaler transportanlæg biotisk eller abiotisk stress. Den indeholder sukre, aminosyrer, proteiner, RNA, lipider og andre metabolitter. Mens der er en stor interesse i at forstå sammensætning og funktion phloem, rolle mange af disse molekyler og dermed deres betydning i plantens udvikling og stress reaktion er endnu ikke fastlagt. En barriere til Phloem analyse ligger i det faktum, at de phloem sæler selv upon såret. Som et resultat heraf er antallet af planter, hvorfra Phloem saft kan opnås begrænset. En metode, der tillader samling af phloem udsondringer fra flere plantearter uden tilsat udstyr er EDTA-faciliteret Phloem ekssudat samling beskrevet her. Mens det er let at bruge, det dog fører til den såret af celler og pleje skal tages for at fjerne indholdet af beskadigede celler. Desuden flere kontrol viser renheden af ​​ekssudater nødvendige. Fordi det er en udsondring snarere end en direkte samling af phloem saft (ikke muligt i mange arter) kun relativ kvantificering af dens indhold kan forekomme. Fordelen ved denne metode i forhold til andre er, at det kan bruges i mange urteagtige eller træagtige plantearter (Perilla, Arabidopsis, poppel, osv.) og kræver minimal udstyr og uddannelse. Det fører til rimeligt store mængder ekssudater, der kan anvendes til efterfølgende analyse af proteiner, sukkerarter, lipider, RNA, virus og metabolitter. Det er simpelt nok, at det kan bruges i såvel forskning såvel som i en undervisning laboratorium.

Introduction

Planter kan ikke flytte at undslippe ugunstige forhold. Derfor er de nødt til at udvikle mekanismer til at spore miljøbelastninger, fremkalde og sende et relateret signal i hele anlægget, og justere udviklingen i overensstemmelse hermed. To transportsystemer for fordelingen af ​​vand, næringsstoffer og andre (signalanlæg) forbindelser. Den første er den veddet, som typisk transporterer vand og mineraler taget op af rødderne hele planten. Det andet er Phloem. Visningen af ​​phloem er ændret fra et simpelt assimilere transportsystem til en ledning for RNA, protein, vira, lipider og andre små molekyler. Det spiller en vigtig rolle i assimilere og transport af næringsstoffer, reaktion på biotisk og abiotisk stress, såvel som i planters vækst og udvikling. Det er nu kaldt "informationsmotorvejen" af anlægget 18 år.

Phloem består af flere celletyper: Phloem parenkym, samt specialiserede ledsager ceLLS og si elementer. Sien element er stedet for langdistance-bevægelse. At tillade uhindret langsgående strømning, der si elementer mangler fleste organeller samt kerner og menes at indeholde i bedste fald en begrænset translationel maskiner 21, 33.. Det menes, at ledsagende celler syntetiserer proteiner og andre forbindelser, der rejser i phloem strøm. Disse forbindelser er derefter transporteret ind sigten elementet via plasmodesmata og kan fungere som langdistance signaler 4,16.

Adskillige grupper af forbindelser kan findes i phloem udsondringer:

  • Sukkerarter er ofte produkter af fotosyntese og transporteres som "energi-bærer" molekyler til andre dele af planten til opbevaring eller som byggesten. Men de kan også fungere som frostvæske eller signalering forbindelser.
  • Proteiner kan også findes i phloem udsondringer. De omfatter metaboliske enzymer, men også har signalfunktioner. Én brinle af et protein, der tjener som en udviklingsmæssig signal er Flowering locus T-protein, som signalerer induktion af blomstring samt sæsonmæssige blad løsnen i planter. 6
  • Nukleinsyrer er til stede i phloem udsondringer i form af mRNA, små og meget små RNA'er, og virale RNA'er. De synes at være stort set involveret i signalering 27, 28, 39.. Samtidig har rRNA og tRNA'er for næsten alle aminosyrer blevet observeret i phloem saften fra agurker 42.. De synes at være selektivt overføres til sigten rørsystem. De tRNA'er viser nødvendige ændringer for evnen til at overføre aminosyrer til den translationelle apparat. Men stedet for at deltage i oversættelsen, de synes at hæmme denne proces. Alternativt kunne de tjene som en kilde til cytokinin eller signalere metaboliske status af anlægget 42..
  • Fedtsyrer, oxylipins og andre lipider er også blevet fundet i Phloem udsondringer 3, 13, 14, 23.. Jasmonic syre, en oxylipin bevæger sig gennem Phloem som en del af svaret på patogeninfektion 22, 29, 31, 32. Mens den rolle de fleste Phloem lipider er stadig uklart, nogle af dem sandsynligvis har meldefunktion 4..

Udfordringen i at arbejde med plante Phloem ligger i dens evne til at forsegle sig ved såret. Der er fire store metoder til at indsamle phloem udsondringer, men de arbejder kun i udvalgte arter:

1) Cucurbitae er det muligt at opnå rimelige mængder Phloem ekssudat gennem nedskæringer af stilk. Når den første dråbe med forurening af skadede celler er fjernet, er det muligt at finde rimeligt store mængder af ren Phloem sap 1, 15. Men med stigende indsamlingen tid, det ekssudat tykkere, hvilket gør det stadig uegnet til væskekromatografi strategier (ikke offentliggjort). Seneste publikationer antyder, at afhængig af arten, er denne Phloem saft stammer fra eitheR fascicular (FP) eller extrafascicular phloem (EP), og at, mens den indeholder "mobil" Phloem saft fra sien elementer (FP), er det også udsat for kontaminering fra andre celletyper, herunder veddet 40, 41 .

2) En anden metode er at opnå Phloem sap gennem lavvandede nedskæringer eller punkteringer i stilken eller petiole. Denne metode er blevet anvendt med succes i lupin 17, 25, agurker 36, og Brassica napus 12.. Her forurening fra beskadigede celler er minimal og ekssudaterne meget ren. Men planter har brug for at være sund og godt vandes, da det er meget udfordrende at selektivt punktere bare si elementer. Hvis veddet fartøjer hakker, er alt ekssudat trukket ind i veddet stream. Dette gør metoden uegnet til anlæg med meget skrøbelige eller meget lignified bladstilke eller stængler.

3) Bladlus stylectomy tillader bladlus at indsætte deres stiletten i sien elementern fjerne bladlus med en laser. Phloem saft er exuded gennem den resterende stiletten 2, 9, 10, 35, 38. I teorien kan enhver plante, der kan blive inficeret af bladlus anvendes til denne fremgangsmåde. Dog vil de fleste drivhus eller vækstkammer, ledere understøtter ikke brug af et patogen. I øvrigt indfører bladlus adskillige proteiner i phloem med deres spyt 19, 33.. Dette fører til en begrænset transkriptionel omprogrammering 30 og har potentialet til at ændre phloem sammensætning 26..

4) Den her beskrevne fremgangsmåde er EDTA-lettet udsondring af Phloem saft. Denne fremgangsmåde anvender EDTA for at forhindre forsegling af phloem 20.. EDTA chelaterer Ca2 +-ioner, der ellers ville deltage i processer, der forsegler Phloem. Mens EDTA kan føre til celleskader 30, har flere grupper brugt denne metode, og observerede ingen negativ effekt af EDTA koncentrationer fra 10 til 20 mm på cellen ultrastruktur eller på phloem lastning og transport 5. 24.. For at reducere eventuelle skadelige effekt samt indblanding af EDTA med chromatografi og gelelektroforese, er planter flyttet ind vand efter 1 time og kun den senere del af ekssudat bruges 14. Således, snarere end udsondring i EDTA er Phloem exudated i vand (EDTA-lettet udsondring). Det er et straight-forward, lave omkostninger, og lavteknologisk metode til indsamling af phloem udsondringer. Phloem saft opnået på denne måde kan anvendes til at analysere proteiner, små molekyler, lipider og RNA'er og har været anvendt med succes i mange planter. Mens et begrænset antal forsøg er blevet udført i enkimbladede planter 11, hvilken fremgangsmåde synes at være mere egnet til tokimbladede (Perilla 17, 20, Arabidopsis 8, 13, 14, Poplar 7). Indsamling af udsondringer har at forekomme i et fugtigt miljø for at undgå tab af udsondringer gennem transpiration. Afhængigt af planten, er inkubering i EDTA i én til to timertilstrækkeligt til at forhindre forsegling af phloem / si elementer. Samlingen kan da opstå i vand. Dette har den fordel at forhindre negative virkninger EDTA har på cellestruktur og stabilitet. Det fjerner også interferens EDTA med metoder som HPLC eller SDS-side. Det er vist som det gælder for Arabidopsis. For større anlæg, har inkubering i EDTA og eksudat samlinger skal skaleres op og er udført i bægre snarere end i 1,7 ml reagensglas.

Protocol

1.. Fremstilling af Planter

  1. Arabidopsis frø kan spire direkte på jorden eller på MS plader. Dyrke planter i fire til seks uger i klimakamre med en 12-timers lysperiode (22 ° C dag, 15 ° C natten 14). Vandplanter gang til to gange om ugen. Brug bunden bakke til vanding, skal du ikke vandplanter fra toppen, så bakkerne at tørre, før re-vanding. Sørg planter er godt hydreret på høsttidspunktet.

2.. Udarbejdelse af løsninger og Fade

  1. K 2-EDTA-opløsning: Lav en 100 mM K 2-EDTA-opløsning stamopløsning, som kan opbevares i køleskab. På dagen for indsamling, fortyndes 4:59 (den ene del EDTA-opløsning, fire dele vand) for at få en 20 mM K 2-EDTA-opløsning.
  2. Fyld et glas eller en petriskål (diameter 7-15 cm) halvvejs med 20 mM K 2-EDTA-opløsning. Hvis indsamling af prøver fra forskellige behandlinger (for exrigelig kontrol og salt-stressede planter eller forskellige genotyper), udarbejde særskilte retter for hver behandling.
  3. Fyld ønskede antal 1,7 ml reaktionsrør med 1,4 ml 20 mM K 2-EDTA-opløsning. Fyld et lige antal reaktionsrør med 1,4 ml autoklaveret deioniseret eller Millipore vand.
  4. Sæt papirservietter på bænken til at sætte planter på, få en ny barberblad og sat på handsker.

3.. Indsamling af Phloem Ekssudater (afbildet i Flowchart i figur 1)

  1. Høst roset blade mellem fire og seks uger gamle planter ved at skære dem med barberblad i bunden af ​​stilk tæt på centrum af rosetten.
  2. Umiddelbart placere bladene i skålene indeholdende 20 mM K 2-EDTA. Sørg den afskårne ende af stilk er nedsænket i opløsningen (figur 2).
  3. Når 15 blade er blevet opsamlet (ca. 3-4 planter), forsigtigt stak blade oven på hinanden, således that den afskårne stilke er afstemt med hinanden. Eftersnitter bunden af stilke (ca. 1 mm) og straks overføre bladene i en af reaktionsrørene med 20 mM K 2-EDTA-opløsning. Bladene passer lettest, hvis de er lidt rullet op. Undgå at klemme bladene i, da det kan medføre skade celler og dermed fører til indsamling af blade celleindhold.
  4. Hvis der er mere materiale der er behov for, forsigtigt dække prøver med en våd køkkenrulle. Brug et nyt sæt af retter, hvis for indsamling af prøver fra forskellige behandlinger eller genotyper.
  5. Når alle prøver er placeret i reaktionsrør, indsamle ekssudaterne enten i mørke eller i lys.
  6. Til opsamling i mørke, linje gulvet i en stor dyb tallerken med våde papirservietter. Placer rack med blade-fyldte reaktionsrør i skålen, og begge omslag med våde papirservietter eller sætte ind i en sort plast tilbage med slidser til beluftning. Placer hele opsætningen i et skab eller et mørkt rum.
  7. For kollektion i lyset, Line bunden af ​​en klar plexiglas beholder med våde papirservietter. Placer rack med blade-fyldte reaktionsrør i beholderen og luk den.
  8. Efter 1 time, efterlader remove forsigtigt fra beholderen og reaktionsrørene og vaskes grundigt med destilleret, demineraliseret eller Millipore vand for at fjerne alle EDTA. Dette trin tjener tre formål: (1) det fjerner EDTA minimeres skader på cellerne, (2) det eliminerer interferens af EDTA med SDS-PAGE og kromatografi, og (3) fjerner eventuelle forbindelser, der har akkumuleret fra skære / beskadiget celler. Straks overføre til den forberedte reaktionsrør indeholdende autoklaveres vand og vende tilbage til den befugtede opsamlingsbeholdere til indsamling af udsondringer. På dette tidspunkt tilsættes RNase-inhibitor, hvis ekssudat skal bruges til RNA-ekstraktion. Valgfrit: proteinaseinhibitor kan tilføjes, hvis proteinanalyse ønskes.
  9. Efter den påtænkte indsamling tid, træk ud, og DISCArd bladene og indefryse Phloem ekssudater i flydende N2 til yderligere brug. Hvis langtidslagring er nødvendig, lyofilisere prøverne og opbevares ved -80 ° C.
  10. I tilfælde af Arabidopsis, kan metabolitter allerede kan påvises efter indsamling af udsondringer i 1 time. Dog kollektion for 5-8 hr er tilrådeligt, hvis analyse af mindre rigelige komponenter er planlagt. For større planter som Perilla er længere indsamling gange (8 timer) anbefales.
    Ekssudat indsamlet fra 15 blade er typisk nok til en bane på en SDS-PAGE-gel (proteiner) til mRNA udvinding, GC-MS (sukkerarter og metabolitter). For lipidanalyse sammenlægning af 2-3 prøver (ekssudat 30-45 blade) anbefales og fører til klarere resultater.

4.. Efterfølgende analyse (for video viser vi kun 4.4)

  1. For protein analyse, resuspender prøve i 15 pi vand og 30 ul Lämmli buffer varme til 95 ° C i 5 min, spin hurtigt ned ad en precipitates og indlæse hele prøven på en SDS-PAGE gel (45 ul loading lommer). Prøver skal farves med Kolloid Coomassie eller andre følsomme pletter, da protein overflod er meget lav.
  2. For sukker og små metabolit analyse, tilføje derivatisering midler til den tørrede prøve som beskrevet i litteraturen 14.
  3. mRNA kan analyseres ved hjælp af RT-PCR, microarray eller RNA-Seq analyse.
  4. For lipidanalyse straks pool 2-3 prøver og adskillelser mod Chloroform: methanol (1:1) i stinkskab som følger: tilføjer et tilsvarende beløb af Chloroform: Methanol til hver prøve, vortex i et par sekunder, og centrifugeres i 4 min ved 400 x g.. Saml bunden (organisk fase) i et glasrør med teflon hætte og gentag partition med den øverste fase tre gange mere. Tør de kombinerede organiske faser under en strøm af N2 og forelægger til yderligere analyse (Tyndtlagskromatografi: TLC 14, 37, væskekromatografi-massespektrometri: LC-MS 14).

Representative Results

Det er blevet klart i løbet af de sidste mange år, at kompleksiteten i Phloem saft kan være svaret på spørgsmålet om, hvordan planter sender varierende udviklingsmæssige og stress-signaler for optimal respons. Brug EDTA-lettet Phloem udsondring kan give mulighed for at analysere Phloem udsondringer fra planter, der ikke er egnet til andre tilgange, men kan være af økonomisk eller fysiologisk interesse.

Denne metode giver mulighed for høst af tilstrækkelig Phloem udsondringer at identificere Phloem-lokaliserede proteiner, og påvise ændringer i deres niveau som reaktion på udvikling eller stress (Figur 3). Som det fremgår af figuren, proteiner er i meget lav tæthed, endnu, deres niveau er højt nok for efterfølgende proteomics eksperimenter ved hjælp af LC-MS/MS eller Western blot-analyse. Resultaterne i agurkeplanter tyder på, at opskæring af stammen fører til en afbrydelse af vandet potentielle balance og en efterfølgende tilstrømning af vand ogmulige forureninger fra apoplast 41.. Alligevel kollektion til tider fra enkeltmandsvirksomheder til otte timer påvirker ikke Phloem protein profil / komposition i Arabidopsis (. Kun den absolutte mængde varierer Guelette m.fl.), mængden af protein indsamlet og mønstret af fundne proteiner varierer mellem arter (Arabidopsis: ved, Perilla, bane I og NI) og behandlinger (Perilla dyrket ved forskellige dagslængder, bane I og NI). Som et resultat proteinholdige signaler kan visualiseres, identificeret og følges.

mRNA og mikro RNA kan også identificeres i phloem udsondringer ved denne metode. Men behandling med RNAse-inhibitor er nødvendig for at forhindre nedbrydning af mRNA i den forlængede exudat tid. Da sien elementer ikke indeholder funktionelle chloroplaster, RuBisCO lille eller stor underenhed (RBC'er eller RbCl, henholdsvis) mRNA'er kan anvendes som negative kontroller, mens kendt PhloemLokaliseret mRNA som Ubiquitin-konjugerende enzym kan anvendes som en positiv kontrol (figur 4).

Ligeledes kan sukkere eller små metabolitter analyseres ved hjælp enten GC-MS eller LC-MS. Det skal her nævnes, at phloem ekssudater indeholder et stort antal af funktionelle enzymer, herunder næsten hele glycolytiske vej 12. Derfor kan anvendelse af flere tidspunkter afsløre metaboliske processer under ekssudat samling. Et eksempel er vist i Figur 5: I alle udsondringer, er saccharose den mest almindelige metabolit, hvilket er mest tydeligt efter en samling i 1 time. Men efter fem timer saccharose til fructose er lidt reduceret. Hvis den samme ekssudat opsamles i en time og efterladt på bænken for de næste fire timer, er saccharose til fructose forholdet reduceret til en langt større grad, tyder på, at aktive enzymer i phloem ekssudater føre til en nedbrydning af saccharose ved rumtemperaturtemperatur (for flere peak fortolkninger se 14). Dette er i overensstemmelse med resultater, som Phloem lastning og transport af molekyler fra følgesvend celler i sien elementer kan fortsætte i udsondring indtil systemet mister sin vitalitet 34..

Lipider i phloem udsondringer og i forlængelse heraf er lange afstande lipid signalering en forholdsvis ny interessefelt i plante videnskab. På grund af deres hydrofobe natur lipider er kun til stede i lave koncentrationer og kan være bundet til andre molekyler til solubilisering. Alligevel, EDTA-lettere udsivning muliggør indsamling af tilstrækkeligt materiale til at visualisere (TLC, figur 6) og identificere (LC-MS, figur 7) phloem lipider fra flere plantearter. Som det ses af figuren, er det muligt at identificere og adskille flere lipid arter. LC-MS tillader at identificere forskellige lipidarter og overvåge ændringer i lipid profiler Forskelnt genotyper eller behandlinger. Dette giver mulighed for undersøgelse af den rolle, lipider under plantens udvikling og stress respons.

Figur 1
Figur 1.. Diagram over den samling af phloem ekssudater af Arabidopsis eller Perilla. Forskellige stier fører til forskellige slutprodukter, der er angivet med blåt. Til fremstilling af RNA, RNAse-inhibitor (100 U / ml, Roche) sættes til vandet i hvilken phloem ekssudat opsamles.
Klik her for at se større billede .

Figur 2
Figur 2.. Opsætning af materialer til Phloem ekssudat indsamleion. Opsætningen viser alle nødvendige materialer til protokoltrin 3,1-3,4.
Klik her for at se større billede .

Figur 3
. Figur 3 Proteiner findes i Phloem ekssudater af to forskellige plantearter, Arabidopsis (At) og Perilla (I og NI, forskellige dagslængder), MW: molekylvægt markør (bane 2). Proteiner blev separeret ved hjælp af en 10-20% gradient SDS-PAGE.
Klik her for at se større billede .

Figur 4
Figur 4. Analysetilstedeværelsen af ​​mRNA for RuBisCO lille og store underenhed (RBCs og RbCl, henholdsvis) og ubiquitin-konjugerende enzym (UBC). mRNA blev opsamlet fra Arabidopsis blade (L), stilke (P), og phloem ekssudater (Ph), revers transkriberet og specifikke transkripter visualiseret under anvendelse af PCR. Figuren er modificeret fra Guelette et al. 14..
Klik her for at se større billede .

Figur 5
Figur 5.. GC-MS profil Phloem ekssudater indsamles for forskellige antal gange. Bemærk hvordan den relative mængde af saccharose ændringer fra 1 time samling (A) til 5 timer efter opsamling tid (B). Ekssudat profil efter opsamling i 1 time efterfulgt af "inkubation" ved stuetemperatur temperatur (RT) i fire timer (C). Leaf metabolit profil (D).
Klik her for at se større billede .

Figur 6
Figur 6.. Thin-lags kromatogram sammenligne lipider fra Perilla (venstre) og Arabidopsis (til højre) blade og Phloem ekssudater. Stjerner angiver lipider specifikke for phloem udsondringer. DGDG: digalactosyldiacylglycerol, PG: phosphatidylglycerol; MGDG: monogalactosyldiacyglycerol; Den del af figuren viser Arabidopsis lipider har været ændret siden Guelette m.fl. 14...
Klik her for at se større billede .

nt "fo: keep-together.within-page =" altid "> Figur 7
Figur 7.. Lipid profil Phloem ekssudater af Arabidopsis (chloroformfase) ved hjælp af LC-MS / negativ ion-mode. Grafer i toppen (mutant A) og bund (vildtype, B) viser forskellene i lipidprofilerne mellem to forskellige genotyper (angivet med pile).
Klik her for at se større billede .

Discussion

EDTA-lettet samling af Phloem udsondringer er meget enkel, kræver minimal udstyr, og er relevant for de fleste planter. Samlet denne fremgangsmåde udvider evnen til at analysere phloem udsondringer fra flere arter. Selvom ekssudat fortyndes, er det nemt at samle mange forskellige prøver eller fra mange planter at skalere op til en stor mængde materiale. Dette tillader derefter til påvisning af hidtil ukendte forbindelser, som er i meget lav tæthed og som ellers ville blive overset.

Denne metode kan bruges til flere plantearter og virker som beskrevet for dem, der er anført i dette håndskrift. Hvis nye arter er blevet undersøgt, de to aspekter, der eventuelt kræver ændring er antallet af anvendte blade og tidspunktet for udsivning. I de fleste tilfælde bør en fem til otte timer udsondring være egnet. For at bekræfte anvendelsen af ​​denne fremgangsmåde til en ny planteart, ekssudat skal indsamles, og en eller flere af de efterfølgende analyse som beskrevet i protokol del 4 needs skal udføres. Afhængig af intensiteten af ​​den observerede signal, kan indsamlingen volumen skal skaleres op. I almindelighed vil lipid og protein analyse kræver mere materiale end sukker og metabolit analyse, idet førstnævnte er mindre rigelige i phloem udsondringer.

Fordi EDTA-lettet ekssudat samling indebærer snitfladerne samt en potentielt skadelig effekt af EDTA, flere punkter skal overvejes: (1) efter den ene times inkubering med EDTA, har stilke skal vaskes grundigt. Dette fjerner alle forbindelser opnået fra sårede celler samt EDTA selv, som kan beskadige celler eller forstyrre udvinding. (2) Positive og negative kontroller skal indgå for at sikre opnåede data stammer fra Phloem saft, og ikke fra sårede celler (se kritiske trin nedenfor). (3) Phloem sap gør indeholde flere enzymer, som kunne være aktiv under ekssudat samling. Derfor, i nogle tilfælde kan det være nyttigt at indsamle for forskellige mængder af tid. (4) Da metoden involveret exudat i vand, en absolut kvantificering af forbindelserne er ikke mulig.

Kritiske trin: Nøglen til en vellykket brug af denne metode er brugen af forsigtighed under håndtering af prøven til ikke skade nogen celler samt anvendelse af passende kontroller (se ref 14..). Et passende kontrol er indsamling af phloem udsondringer uden forudgående behandling med EDTA. I dette tilfælde phloem vil tætne sig selv og ingen ekssudat kan indsamles. Kontaminerende forbindelser fra de sårede celler vil blive opdaget her. En anden kontrol ville være analysen af ​​sukker i ekssudat. I Arabidopsis, bør saccharose være den fremherskende metabolit i phloem saft, med fructose saccharose forholdet 1:04 til 01:08 (ref. 8, 14).

Til RNA-ekstraktion anvendelse af en RNAse-inhibitor er nødvendig. Hertil kommer en positiv kontrol af hidtil described Phloem lokaliseret mRNA (UBC9: ubiquitinkonjugerende enzym 9, At4g27960, 8, 14) og en negativ kontrol med for eksempel en kloroplast mRNA (RuBisCO LSU) er tilrådeligt.

Fordi ekssudatet indeholder aktive enzymer er et tidsforløb rådes til at sørge for ændringer i Phloem profilen er ikke blot som følge af variationer i samlingen tid. I nogle tilfælde kan det være fordelagtigt at anvende proteinaseinhibitorer. Men efterforskerne har brug for at huske på, at de indsamlede ekssudat vil blive koncentreret og at eventuelle tilsatte stoffer vil stort set koncentreret. Et andet afgørende skridt i protokol er den recutting af stilk under EDTA. Dette trin tjener et dobbelt formål: For det første fjerner eventuelle forseglede si plader, mens forhindre dannelsen af ​​nye stikpropper dermed giver mulighed for frit flow af Phloem SAP. For det andet, det fjerner kavitation boble i den genererede veddet, mens der skæres, og dermed giver mulighed for xylem transport. Størrelsen af ​​den anden cut afhænges på de anvendte planter. I anlæg med større bladstilke det bør være flere millimeter (op til 1 cm) over den første skæring, i planter som Arabidopsis, 1-2 mm er tilstrækkelig.

Brugen af ​​denne metode kan føre til opdagelsen af ​​nye forbindelser i Phloem ekssudater, som kunne have signalering, udviklingsmæssige eller biomedicinske implikationer. Det har medført en mere dybdegående kig på langdistance-lipid signalering, hvilket var en lidet studerede felt inden plante videnskab på grund af den manglende adgang til Phloem.

Disclosures

Vi har intet at afsløre.

Acknowledgments

Dette arbejde blev støttet af National Science Foundation NSF-IOS tilskud # 1144391 til SHB.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
K2-EDTA Sigma-Aldrich ED2P-500G  
Shallow Glass or plastic Petri Dish (7-15cm) PYREX or Corning Any clean, shallow dish will work
Chloroform EMD CX1054-1 Only open containers in fume hood
Methanol J.T.Baker 9070-03  
Screw cap tubes VWR International 53283-800  
Screw cap tubes Sun Sri 13-425  
Eppendorf tubes Denville C2170  

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Balachandran, S., Xiang, Y., Schobert, C., Thompson, G. A., Lucas, W. J. Phloem sap proteins from Cucurbita maxima and Ricinus communis have the capacity to traffic cell to cell through plasmodesmata. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 94, 14150-14158 (1997).
  2. Barnes, A., Bale, J., Constantinidou, C., Aston, P., Jones, A., Pritchard, J. Determining protein identity from sieve element sap in Ricinus communis L. by quadrupole time of flight (Q-TOF) mass spectrometry. J. Exp. Bot. 55, 1473-1481 (2004).
  3. Behmer, S. T., Grebenok, R. J., Douglas, A. E. Plant sterols and host plant suitability for a phloem feeding insect. Functional Ecology. (2010).
  4. Benning, U. F., Tamot, B., Guelette, B. S., Hoffmann-Benning, S. New aspects of phloem-mediated long-distance lipid signaling in plants. Front.Plant.Sci. 3, 53> (2012).
  5. Chen, S., Petersen, B. L., Olsen, C. E., Schulz, A., Halkier, B. A. Long-distance phloem transport of glucosinolates in Arabidopsis. PlantPhysiol. 127, 194-201 (2001).
  6. Corbesier, L., et al. FT protein movement contributes to long distance signalling in floral induction of Arabidopsis. Science. 316, 1030-1033 (2007).
  7. Dafoe, N. J., Gowen, B. E., &Constabel, C. P. Thaumatin-like proteins are differentially expressed and localized in phloem tissues of hybrid poplar.BMC. Plant Biology. 10, (2010).
  8. Deeken, R., Ache, P., Kajahn, I., Klinkenberg, J., Bringmann, G., Hedrich, R. Identification of Arabidopsis thaliana phloem RNAs provides a search criterion for phloem-based transcripts hidden in complex datasets of microarray experiments. The Plant Journal. 55, 746-759 (2008).
  9. Doering-Saad, C., Newbury, H. J., Bale, J. S., Pritchard, J. Use of aphid stylectomy and RT-PCR for the detection of transporter mRNAs in sieve elements. J. Exp. Bot. 53, 631-637 (2002).
  10. Fisher, D. B., Wu, Y., Ku, M. S. B. Turnover of soluble-proteins in the wheat sieve tube. Plant Physiol. 100, 1433-1441 (1992).
  11. Gaupels, F., Buhtz, A., Knauer, T., Deshmukh, S., Waller, F., van Bel, A. J. E., Kogel, K. -H., Kehr, J. Adaptation of aphid stylectomy for analyses of proteins and mRNAs in barley phloem sap. J Exp Bot. 59, 3297-3306 (2008).
  12. Giavalisco, P., Kapitza, K., Kolasa, A., Buhtz, A., Kehr, J. Towards the proteome of Brassica napus phloem sap. Proteomics. 6, 896-909 (2006).
  13. Guelette, B. S., Chamberlin, B., Benning, U. F., Hoffmann-Benning, S. Indications of lipids/lipid signaling in the phloem exudates of Arabidopsis thaliana and Perilla ocymoides. Benning, C., Ohlroggeeds, J. Proceedings of the 17th International Symposium of Plant, Michigan State University. Lansing, USA. 92-95 (2007).
  14. Guelette, B. S., Benning, U. F., Hoffmann-Benning, S. Identification of lipids and lipid-binding proteins in phloem exudates from Arabidopsis thaliana. J. Exp. Bot. 63, 3603-3616 (2012).
  15. Haebel, S., Kehr, J. Matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry peptide mass fingerprints and post source decay: a tool for the identification and analysis of phloem proteins from Cucurbita maxima Duch. separated by two-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis. Planta. 214, 3328 (2001).
  16. Hayashi, H., Fukuda, A., Suzui, N., Fujimaki, S. Proteins in the sieve element-companion cell complexes: their detection, localization and possible functions. Aust. J. Plant Physiol. 27, 489-496 (2000).
  17. Hoffmann-Benning, S., Gage, D. A., McIntosh, L., Kende, H., Zeevaart, J. A. D. Comparison of peptides in the phloem sap of flowering and non-flowering Perilla and lupine plants using microbore HPLC followed by matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry. Planta. 216-2140 (2002).
  18. Jorgensen, R. A., Atkinson, R. G., Forster, R. L., Lucas, W. J. An RNA-Based Information Superhighway in Plants. Science. 6, 1486-1487 (1998).
  19. Kehr, J. Phloem sap proteins: their identities and potential roles in the interaction between plants and phloem-feeding insects. J. Exp. Bot. 57, 767-774 (2006).
  20. King, R. W., Zeevaart, J. A. Enhancement of phloem exudation from cut petioles by chelating-agents. Plant Physiol. 53, 96-103 (1974).
  21. Lin, M. -K., Lee, Y. -J., Lough, T. J., Phinney, B., Lucas, W. J. Analysis of the pumpkin phloem proteome provides functional insights into angiosperm sieve tube function. Mol. Cell. Proteomics. 8, 343-356 (2009).
  22. Lough, T. J., Lucas, W. J. Integrative plant biology: role of phloem long-distance macromolecular trafficking. Annu.Rev. Plant Biol. 57, 203-232 (2006).
  23. Madey, E., Nowack, L. M., Thompson, J. E. Isolation and characterization of lipid in phloem sap of canola. Planta. 214, 625-634 (2002).
  24. Maeda, H., Song, W., Sage, T. L., DellaPenna, D. Tocopherols playa crucial role in low-temperature adaptation and phloem loading in Arabidopsis. The Plant Cell. 18, 2710-2732 (2006).
  25. Marentes, E., Grusak, M. A. Mass determination of low-molecular-weight proteins in phloem sap using matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry. J. Exp. Bot. 49, 903-911 (1998).
  26. Prado, E., Tjallingii, W. Behavioral evidence for local reduction of aphid-induced resistance. Journal ofInsect Science. 7, 48 (2007).
  27. Ruiz-Medrano, R., Xoconostle-Cázares, B., Lucas, W. J. Phloem long-distance transport of CmNACP mRNA: implications for supracellular regulation in plants. Development. 126, 4405-4419 (1999).
  28. Ryabov, E. V., Robinson, D. J., Taliansky, M. E. A plant virus-encoded protein facilitates long-distance movement of heterologous viral RNA. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 96, 1212-1217 (1999).
  29. Schilmiller, A. L., Howe, G. A. Systemic signaling in the wound response. Curr.Opin. Plant Biol. 8, 369-377 (2005).
  30. Thompson, G. A., Goggin, F. L. Transcriptomics and functional genomics of plant defence induction by phloem-feeding insects. J. Exp. Bot. 57, 755-766 (2006).
  31. Thorpe, M. R., Ferrieri, A. P., Herth, M. M., Ferrieri, R. A. (11)C-imaging: methyl jasmonate moves in both phloem and xylem, promotes transport of jasmonate, and of photoassimilate even after proton transport is decoupled. Planta. (11), 226-541 (2007).
  32. Truman, W., Bennett, M. H., Kubigsteltig, I., Turnbull, C., Grant, M. Arabidopsis systemic immunity uses conserved defense signaling pathways and is mediated by jasmonates. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 104, 1075-1080 (2007).
  33. van Bel, A. J. E., Knoblauch, M. Sieve element and companion cell: the story of the comatose patient and the hyperactive nurse. Aust. J. Plant Physiol. 27, 477-487 (2000).
  34. van Bel, A. J. E., Hess, P. H. Hexoses as phloem transport sugars: the end of a dogma. J. Exp. Bot. 59, 261-272 Forthcoming.
  35. Walz, C., Juenger, M., Schad, M., Kehr, J. Evidence for the presence and activity of a complete antioxidant defence system in mature sieve tubes. Plant J. 31, 189-197 (2002).
  36. Walz, C., Giavalisco, P., Schad, M., Juenger, M., Klose, J., Kehr, J. Proteomics of curcurbit phloem exudate reveals a network of defence proteins. Phytochemistry. 65, 1795-1804 (2004).
  37. Wang, Z., Benning, C. Arabidopsis thaliana Polar Glycerolipid Profiling by Thin Layer Chromatography (TLC) Coupled with Gas-Liquid Chromatography (GLC). J. Vis. Exp. (49), e2518 (2011).
  38. Will, T., van Bel, A. J. E. Physical and chemical interactions between aphids and plants. J. Exp. Bot. 57, 729-737 (2006).
  39. Yoo, B. C., Kragler, F., Varkonyi-Gasic, E., Haywood, V., Archer-Evans, S., Lee, Y. M., Lough, T. J., Lucas, W. J. A systemic small RNA signaling system in plants. Plant Cell. 16, 1979-2000 (2004).
  40. Zhang, B., Tolstikov, V., Turnbull, C., Hicks, L. M., Fiehn, O. Divergent metabolome and proteome suggest functional independence of dual phloem transport systems in cucurbits. PNAS USA. 107, 13532-13537 (2010).
  41. Zhang, C., Yu, X., Ayre, B. G., Turgeon, R. The Origin and Composition of Cucurbit "Phloem" Exudate. Plant Physiology. 158, 1873-1882 (2012).
  42. Zhang, S., Sun, L., Kragler, F. The Phloem-Delivered RNA Pool Contains Small Noncoding RNAs and Interferes with Translation. Plant Physiol. 150, 378-387 (2009).
Indsamling og analyse af<em&gt; Arabidopsis</em&gt; Phloem exudater Brug af EDTA-lettet Method
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Tetyuk, O., Benning, U. F., Hoffmann-Benning, S. Collection and Analysis of Arabidopsis Phloem Exudates Using the EDTA-facilitated Method. J. Vis. Exp. (80), e51111, doi:10.3791/51111 (2013).More

Tetyuk, O., Benning, U. F., Hoffmann-Benning, S. Collection and Analysis of Arabidopsis Phloem Exudates Using the EDTA-facilitated Method. J. Vis. Exp. (80), e51111, doi:10.3791/51111 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter