Kendskab til sammensætningen af Phloem saft samt den mekanisme af sin læsning og fjerntrafik er afgørende for forståelsen af langdistance-signalering i plantens udvikling og stress / patogen respons og assimilere transport. Dette håndskrift beskriver indsamling af phloem exudater bruger EDTA-lettet metode.
Anlægget Phloem er afgørende for fjerntransport af (foto-) assimilerer samt af signaler transportanlæg biotisk eller abiotisk stress. Den indeholder sukre, aminosyrer, proteiner, RNA, lipider og andre metabolitter. Mens der er en stor interesse i at forstå sammensætning og funktion phloem, rolle mange af disse molekyler og dermed deres betydning i plantens udvikling og stress reaktion er endnu ikke fastlagt. En barriere til Phloem analyse ligger i det faktum, at de phloem sæler selv upon såret. Som et resultat heraf er antallet af planter, hvorfra Phloem saft kan opnås begrænset. En metode, der tillader samling af phloem udsondringer fra flere plantearter uden tilsat udstyr er EDTA-faciliteret Phloem ekssudat samling beskrevet her. Mens det er let at bruge, det dog fører til den såret af celler og pleje skal tages for at fjerne indholdet af beskadigede celler. Desuden flere kontrol viser renheden af ekssudater nødvendige. Fordi det er en udsondring snarere end en direkte samling af phloem saft (ikke muligt i mange arter) kun relativ kvantificering af dens indhold kan forekomme. Fordelen ved denne metode i forhold til andre er, at det kan bruges i mange urteagtige eller træagtige plantearter (Perilla, Arabidopsis, poppel, osv.) og kræver minimal udstyr og uddannelse. Det fører til rimeligt store mængder ekssudater, der kan anvendes til efterfølgende analyse af proteiner, sukkerarter, lipider, RNA, virus og metabolitter. Det er simpelt nok, at det kan bruges i såvel forskning såvel som i en undervisning laboratorium.
Planter kan ikke flytte at undslippe ugunstige forhold. Derfor er de nødt til at udvikle mekanismer til at spore miljøbelastninger, fremkalde og sende et relateret signal i hele anlægget, og justere udviklingen i overensstemmelse hermed. To transportsystemer for fordelingen af vand, næringsstoffer og andre (signalanlæg) forbindelser. Den første er den veddet, som typisk transporterer vand og mineraler taget op af rødderne hele planten. Det andet er Phloem. Visningen af phloem er ændret fra et simpelt assimilere transportsystem til en ledning for RNA, protein, vira, lipider og andre små molekyler. Det spiller en vigtig rolle i assimilere og transport af næringsstoffer, reaktion på biotisk og abiotisk stress, såvel som i planters vækst og udvikling. Det er nu kaldt "informationsmotorvejen" af anlægget 18 år.
Phloem består af flere celletyper: Phloem parenkym, samt specialiserede ledsager ceLLS og si elementer. Sien element er stedet for langdistance-bevægelse. At tillade uhindret langsgående strømning, der si elementer mangler fleste organeller samt kerner og menes at indeholde i bedste fald en begrænset translationel maskiner 21, 33.. Det menes, at ledsagende celler syntetiserer proteiner og andre forbindelser, der rejser i phloem strøm. Disse forbindelser er derefter transporteret ind sigten elementet via plasmodesmata og kan fungere som langdistance signaler 4,16.
Adskillige grupper af forbindelser kan findes i phloem udsondringer:
Udfordringen i at arbejde med plante Phloem ligger i dens evne til at forsegle sig ved såret. Der er fire store metoder til at indsamle phloem udsondringer, men de arbejder kun i udvalgte arter:
1) Cucurbitae er det muligt at opnå rimelige mængder Phloem ekssudat gennem nedskæringer af stilk. Når den første dråbe med forurening af skadede celler er fjernet, er det muligt at finde rimeligt store mængder af ren Phloem sap 1, 15. Men med stigende indsamlingen tid, det ekssudat tykkere, hvilket gør det stadig uegnet til væskekromatografi strategier (ikke offentliggjort). Seneste publikationer antyder, at afhængig af arten, er denne Phloem saft stammer fra eitheR fascicular (FP) eller extrafascicular phloem (EP), og at, mens den indeholder "mobil" Phloem saft fra sien elementer (FP), er det også udsat for kontaminering fra andre celletyper, herunder veddet 40, 41 .
2) En anden metode er at opnå Phloem sap gennem lavvandede nedskæringer eller punkteringer i stilken eller petiole. Denne metode er blevet anvendt med succes i lupin 17, 25, agurker 36, og Brassica napus 12.. Her forurening fra beskadigede celler er minimal og ekssudaterne meget ren. Men planter har brug for at være sund og godt vandes, da det er meget udfordrende at selektivt punktere bare si elementer. Hvis veddet fartøjer hakker, er alt ekssudat trukket ind i veddet stream. Dette gør metoden uegnet til anlæg med meget skrøbelige eller meget lignified bladstilke eller stængler.
3) Bladlus stylectomy tillader bladlus at indsætte deres stiletten i sien elementern fjerne bladlus med en laser. Phloem saft er exuded gennem den resterende stiletten 2, 9, 10, 35, 38. I teorien kan enhver plante, der kan blive inficeret af bladlus anvendes til denne fremgangsmåde. Dog vil de fleste drivhus eller vækstkammer, ledere understøtter ikke brug af et patogen. I øvrigt indfører bladlus adskillige proteiner i phloem med deres spyt 19, 33.. Dette fører til en begrænset transkriptionel omprogrammering 30 og har potentialet til at ændre phloem sammensætning 26..
4) Den her beskrevne fremgangsmåde er EDTA-lettet udsondring af Phloem saft. Denne fremgangsmåde anvender EDTA for at forhindre forsegling af phloem 20.. EDTA chelaterer Ca2 +-ioner, der ellers ville deltage i processer, der forsegler Phloem. Mens EDTA kan føre til celleskader 30, har flere grupper brugt denne metode, og observerede ingen negativ effekt af EDTA koncentrationer fra 10 til 20 mm på cellen ultrastruktur eller på phloem lastning og transport 5. 24.. For at reducere eventuelle skadelige effekt samt indblanding af EDTA med chromatografi og gelelektroforese, er planter flyttet ind vand efter 1 time og kun den senere del af ekssudat bruges 14. Således, snarere end udsondring i EDTA er Phloem exudated i vand (EDTA-lettet udsondring). Det er et straight-forward, lave omkostninger, og lavteknologisk metode til indsamling af phloem udsondringer. Phloem saft opnået på denne måde kan anvendes til at analysere proteiner, små molekyler, lipider og RNA'er og har været anvendt med succes i mange planter. Mens et begrænset antal forsøg er blevet udført i enkimbladede planter 11, hvilken fremgangsmåde synes at være mere egnet til tokimbladede (Perilla 17, 20, Arabidopsis 8, 13, 14, Poplar 7). Indsamling af udsondringer har at forekomme i et fugtigt miljø for at undgå tab af udsondringer gennem transpiration. Afhængigt af planten, er inkubering i EDTA i én til to timertilstrækkeligt til at forhindre forsegling af phloem / si elementer. Samlingen kan da opstå i vand. Dette har den fordel at forhindre negative virkninger EDTA har på cellestruktur og stabilitet. Det fjerner også interferens EDTA med metoder som HPLC eller SDS-side. Det er vist som det gælder for Arabidopsis. For større anlæg, har inkubering i EDTA og eksudat samlinger skal skaleres op og er udført i bægre snarere end i 1,7 ml reagensglas.
EDTA-lettet samling af Phloem udsondringer er meget enkel, kræver minimal udstyr, og er relevant for de fleste planter. Samlet denne fremgangsmåde udvider evnen til at analysere phloem udsondringer fra flere arter. Selvom ekssudat fortyndes, er det nemt at samle mange forskellige prøver eller fra mange planter at skalere op til en stor mængde materiale. Dette tillader derefter til påvisning af hidtil ukendte forbindelser, som er i meget lav tæthed og som ellers ville blive overset.
Denne metode kan bruges til flere plantearter og virker som beskrevet for dem, der er anført i dette håndskrift. Hvis nye arter er blevet undersøgt, de to aspekter, der eventuelt kræver ændring er antallet af anvendte blade og tidspunktet for udsivning. I de fleste tilfælde bør en fem til otte timer udsondring være egnet. For at bekræfte anvendelsen af denne fremgangsmåde til en ny planteart, ekssudat skal indsamles, og en eller flere af de efterfølgende analyse som beskrevet i protokol del 4 needs skal udføres. Afhængig af intensiteten af den observerede signal, kan indsamlingen volumen skal skaleres op. I almindelighed vil lipid og protein analyse kræver mere materiale end sukker og metabolit analyse, idet førstnævnte er mindre rigelige i phloem udsondringer.
Fordi EDTA-lettet ekssudat samling indebærer snitfladerne samt en potentielt skadelig effekt af EDTA, flere punkter skal overvejes: (1) efter den ene times inkubering med EDTA, har stilke skal vaskes grundigt. Dette fjerner alle forbindelser opnået fra sårede celler samt EDTA selv, som kan beskadige celler eller forstyrre udvinding. (2) Positive og negative kontroller skal indgå for at sikre opnåede data stammer fra Phloem saft, og ikke fra sårede celler (se kritiske trin nedenfor). (3) Phloem sap gør indeholde flere enzymer, som kunne være aktiv under ekssudat samling. Derfor, i nogle tilfælde kan det være nyttigt at indsamle for forskellige mængder af tid. (4) Da metoden involveret exudat i vand, en absolut kvantificering af forbindelserne er ikke mulig.
Kritiske trin: Nøglen til en vellykket brug af denne metode er brugen af forsigtighed under håndtering af prøven til ikke skade nogen celler samt anvendelse af passende kontroller (se ref 14..). Et passende kontrol er indsamling af phloem udsondringer uden forudgående behandling med EDTA. I dette tilfælde phloem vil tætne sig selv og ingen ekssudat kan indsamles. Kontaminerende forbindelser fra de sårede celler vil blive opdaget her. En anden kontrol ville være analysen af sukker i ekssudat. I Arabidopsis, bør saccharose være den fremherskende metabolit i phloem saft, med fructose saccharose forholdet 1:04 til 01:08 (ref. 8, 14).
Til RNA-ekstraktion anvendelse af en RNAse-inhibitor er nødvendig. Hertil kommer en positiv kontrol af hidtil described Phloem lokaliseret mRNA (UBC9: ubiquitinkonjugerende enzym 9, At4g27960, 8, 14) og en negativ kontrol med for eksempel en kloroplast mRNA (RuBisCO LSU) er tilrådeligt.
Fordi ekssudatet indeholder aktive enzymer er et tidsforløb rådes til at sørge for ændringer i Phloem profilen er ikke blot som følge af variationer i samlingen tid. I nogle tilfælde kan det være fordelagtigt at anvende proteinaseinhibitorer. Men efterforskerne har brug for at huske på, at de indsamlede ekssudat vil blive koncentreret og at eventuelle tilsatte stoffer vil stort set koncentreret. Et andet afgørende skridt i protokol er den recutting af stilk under EDTA. Dette trin tjener et dobbelt formål: For det første fjerner eventuelle forseglede si plader, mens forhindre dannelsen af nye stikpropper dermed giver mulighed for frit flow af Phloem SAP. For det andet, det fjerner kavitation boble i den genererede veddet, mens der skæres, og dermed giver mulighed for xylem transport. Størrelsen af den anden cut afhænges på de anvendte planter. I anlæg med større bladstilke det bør være flere millimeter (op til 1 cm) over den første skæring, i planter som Arabidopsis, 1-2 mm er tilstrækkelig.
Brugen af denne metode kan føre til opdagelsen af nye forbindelser i Phloem ekssudater, som kunne have signalering, udviklingsmæssige eller biomedicinske implikationer. Det har medført en mere dybdegående kig på langdistance-lipid signalering, hvilket var en lidet studerede felt inden plante videnskab på grund af den manglende adgang til Phloem.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev støttet af National Science Foundation NSF-IOS tilskud # 1144391 til SHB.
K2-EDTA | Sigma-Aldrich | ED2P-500G | |
Shallow Glass or plastic Petri Dish (7-15 cm) | PYREX or Corning | Any clean, shallow dish will work | |
Chloroform | EMD | CX1054-1 | Only open containers in fume hood |
Methanol | J.T.Baker | 9070-03 | |
Screw cap tubes | VWR International | 53283-800 | |
Screw cap tubes | Sun Sri | 13-425 | |
Eppendorf tubes | Denville | C2170 |