Kunskap om sammansättningen av floem sav samt mekanismen för dess lastning och långväga transporter är avgörande för förståelsen av långväga signalering i växtens utveckling och stress / patogen respons och assimilera transporter. Detta manuskript beskriver insamling av floem utsöndringar använder EDTA-underlättas metoden.
Anläggningen phloem är viktigt för långväga transporter av (bild-) assimilerar samt av signaler förmedlar biotisk eller abiotisk stress. Den innehåller socker, aminosyror, proteiner, RNA, lipider och andra metaboliter. Medan det finns ett stort intresse för att förstå sammansättning och funktion av floem, den roll som många av dessa molekyler och därmed deras betydelse för växtens utveckling och stress har ännu inte fastställts. Ett hinder för floem analys ligger i det faktum att de floem förseglar sig själv vid såra. Som ett resultat, är det antal växter från vilka floem sav kan erhållas begränsad. En metod som möjliggör insamling av floem utsöndringar från flera växtarter utan tillsatt utrustningen är EDTA-underlättas phloem exsudat kollektion beskrivs här. Även om det är lätt att använda, leder det till såra av celler och försiktighet måste vidtas för att ta bort innehållet i skadade celler. Dessutom till flera kontroller bevisa renhet exsudatär nödvändiga. Eftersom det är en utsöndring snarare än en direkt samling av floem sav (inte möjligt i många arter) endast relativ kvantifiering av dess innehåll kan förekomma. Fördelen med denna metod framför andra är att det kan användas i många örtartade eller vedartade växtarter (Perilla, Arabidopsis, poppel, etc.) och kräver minimal utrustning och utbildning. Det leder till rimligt stora mängder utsöndringar som kan användas för efterföljande analys av proteiner, sockerarter, lipider, RNA, virus och metaboliter. Det är enkelt nog att den kan användas både i forskning och i en undervisning laboratorium.
Växter kan inte flytta fly ogynnsamma förhållanden. Därför var de tvungna att utveckla mekanismer för att upptäcka miljöpåkänningar, framkalla och sända en relaterad signal i hela anläggningen, och justera utvecklingen därefter. Två transportsystem finns för distribution av vatten, näringsämnen och andra (signalering) föreningar. Den första är den xylem, som normalt transporterar vatten och mineraler tas upp av rötterna hela anläggningen. Den andra är floemet. Vyn floemet har ändrats från en enkel assimilera transportsystem till en ledning för RNA, protein, virus, lipider och andra små molekyler. Den spelar en viktig roll i assimilera och näringstransporten, respons mot biotisk och abiotisk stress, liksom i växtens tillväxt och utveckling. Det som nu kallas "digitala motorvägen" av anläggningen 18.
Den phloem består av flera celltyper: phloem levervävnad, samt specialiserade följeslagare ceLLS och sikt element. Sikten elementet är platsen för långväga rörelse. För att möjliggöra obehindrad längsgående flöde är såll element saknas flesta organeller samt kärnor och tros innehålla i bästa fall en begränsad translationell maskiner 21, 33. Man tror att följeslagare celler syntetisera proteiner och andra föreningar, som reser i floem strömmen. Dessa föreningar transporteras sedan in i sikten elementet via plasmodesmata och kan fungera som långväga signaler 4,16.
Flera grupper av föreningar kan återfinnas i floem utsöndringar:
Utmaningen i att arbeta med växter phloem ligger i dess förmåga att täta sig vid sårskada. Det finns fyra stora metoder som används för att samla in floem utsöndringar, men de fungerar bara i utvalda arter:
1) I gurkväxter är det möjligt att erhålla rimliga mängder phloem exsudat genom nedskärningar av bladskaft. När den första droppe med kontaminering av skadade celler har tagits bort är det möjligt att erhålla rimligt stora mängder ren floem sap 1, 15. Men med ökande samling tid, denna exsudat tjocknar, vilket gör det allt olämpligt för vätskekromatografi tillvägagångssätt (opublicerad). Nya publikationer antyder, att beroende på art, är detta phloem SAP härstammar från either fascicular (FP) eller extrafascicular floem (EP) och att, medan det innehåller "mobil" floem sav från sikten elementen (FP), är det också benägna att kontaminering från andra celltyper, inklusive xylem 40, 41 .
2) Det andra alternativet är att skaffa phloem sap genom grunda nedskärningar eller punktering i stammen eller bladskaft. Denna metod har använts framgångsrikt i lupin 17, 25, 36 gurkväxter, och Brassica napus 12. Här förorening från skadade celler är minimal och utsöndringar mycket ren. Men växter behöver för att vara friska och väl vattnade eftersom det är mycket svårt att selektivt punktera bara sikten element. Om xylem fartyg trasiga all sårsekret dras in i xylem strömmen. Detta gör metoden olämplig för anläggningar med mycket ömtåliga eller starkt förvedade bladskaft eller stjälkar.
3) Bladlöss stylectomy tillåter bladlöss att sätta sin stilett i sikten elementen in avlägsna aphid med en laser. Floem sav exuded genom den återstående mandrängen 2, 9, 10, 35, 38. I teorin kan vilken som helst växt som kan infekteras av bladlöss användas för detta tillvägagångssätt. Men de flesta växthus eller tillväxt chefer kammare stöder inte användning av en patogen. Dessutom bladlöss introducera flera proteiner i floem med deras saliv 19, 33. Detta leder till en begränsad transkriptionell omprogrammering 30 och har potential att förändra floemet sammansättning 26.
4) Den metod som beskrivs här är EDTA-underlättas utsöndring av phloem sav. Denna metod använder EDTA för att förhindra tätning av floem 20. EDTA kelaterar Ca 2 + joner som annars skulle delta i processer som tätar floem. Även EDTA kan leda till cellskador 30, har flera grupper använt denna metod och observerades ingen negativ effekt av EDTA koncentrationer från 10 till 20 mm på cellens ultrastrukturen eller på phloem lastning och transport 5, 24. För att minska eventuella skadliga effekter samt störning av EDTA med kromatografi och gelelektrofores, är växter flyttade in vatten efter 1 h och endast den senare delen av exsudat används 14. Således, snarare än utsvettning i EDTA, är floem exudated i vatten (EDTA-underlättas utsvettning). Det är en rättfram, låg kostnad och låg-tech metod för insamling av floem utsöndringar. Floem sap erhållits på detta sätt kan användas för att analysera proteiner, små molekyler, lipider, och RNA och har använts framgångsrikt i många växter. Medan ett begränsat antal experiment har utförts i monokotyledoner 11 verkar denna metod att vara mer lämpade för dikotyledoner (Perilla 17, 20, Arabidopsis 8, 13, 14, Poppel 7). Insamling av utsöndringar måste ske i en fuktig miljö för att undvika förlust av utsöndringar genom transpiration. Beroende på växten, är inkubering i EDTA under en till två timmartillräcklig för att förhindra försegling av floem / sil element. Samlingen kan då uppstå i vatten. Detta har fördelen av att förhindra den negativa effekten EDTA har på cellstruktur och stabilitet. Det eliminerar också inblandning av EDTA med metoder som HPLC eller SDS-PAGE. Det visas eftersom det gäller Arabidopsis. För större anläggningar, har inkubation i EDTA och exsudat samlingar måste skalas upp och utförs i bägare istället i 1,7 ml provrör.
Den EDTA-underlättade samling phloem utsöndringar är mycket enkel, kräver minimal utrustning, och är tillämplig på de flesta växter. Totalt sträcker sig denna metod förmågan att analysera floem utsöndringar från att fler arter. Även exsudatet späds, är det enkelt att samla många olika prover eller från många växter att skala upp till en stor mängd material. Detta möjliggör sedan för detektion av nya föreningar som är i mycket begränsad omfattning och annars skulle förbises.
Denna metod kan användas för flera växtarter och fungerar såsom beskrivits för de som förtecknas i detta manuskript. Om nya arter utforskas, de två aspekter som kan behöva ändras är antalet använda löv och tiden för utsöndring. I de flesta fall bör en 07:55 timmars exudation vara lämpliga. För att bekräfta användningen av denna metod för en ny växtart måste exsudat som skall samlas in och en eller flera av den följande analysen som beskrivs i protokoll del 4 nEEDS som skall utföras. Beroende på intensiteten av den observerade signalen kan uppsamlingsvolymen måste skalas upp. I allmänhet kommer lipid och proteinanalys kräver mer material än socker och metabolitanalys eftersom den förstnämnda är mindre rikligt förekommande i floem utsöndringar.
Eftersom EDTA-underlättat exsudat kollektion innebär snittytor samt en potentiellt skadlig effekt av EDTA, flera punkter måste beaktas: (1) efter en timmes inkubering med EDTA, bladskaft måste tvättas noggrant. Detta tar bort alla föreningar, erhållen från skadade celler liksom EDTA själv, vilket kan skada celler eller störa utvinning. (2) Positiva och negativa kontroller måste ingå för att säkerställa erhållna data härrör från phloem sav och inte från skadade celler (se kritiska stegen nedan). (3) phloem SAP gör innehåller flera enzymer, vilket skulle kunna vara aktiva under exsudat samling. Följaktligen, i vissa fall kan det vara användbart att samla for olika lång tid. (4) Eftersom metoden involverade exsudation i vatten, är en absolut kvantifiering av föreningarna inte möjlig.
Kritiska steg: Nyckeln till framgångsrik användning av denna metod är att använda försiktighet vid hantering av provet för att inte skada några celler samt användning av lämpliga kontroller (se ref 14.). En lämplig kontroll är den samling av floem utsöndringar utan tidigare behandling med EDTA. I detta fall floem kommer att försegla sig själv och ingen exsudat kan uppsamlas. Eventuella kontaminerande föreningar som kommer från de sårade cellerna kommer att upptäckas här. En andra kontroll skulle vara analys av socker i exsudat. I Arabidopsis, bör sackaros vara den dominerande metaboliten inom floem sav, med fruktos till sackaros förhållande av 1:04 till 1:08 (ref 8, 14).
För RNA-extraktion användning av en RNas inhibitor är nödvändigt. Dessutom, en positiv kontroll av tidigare som beskrivered floem-lokaliserad mRNA (UBC9: ubikvitinkonjugerande enzym 9, At4g27960, 8, 14) och en negativ kontroll av exempelvis en kloroplast-mRNA (Rubisco LSU) är att rekommendera.
Eftersom exsudat innehåller aktiva enzymer, är ett tidsförlopp uppmanas att se förändringar i floem profilen är inte bara på grund av variationer i samlingen tiden. I vissa fall kan det vara fördelaktigt att använda proteinasinhibitorer. Men utredarna måste ha i åtanke att den insamlade exsudat ska vara koncentrerad och att eventuella tillsatta föreningar kommer att till stor del koncentrerad. Ett andra viktigt steg i protokollet är recutting av bladskaftets enligt EDTA. Detta steg tjänar ett dubbelt syfte: det första, det tar bort alla förseglade silplattor samtidigt förhindra bildandet av nya pluggar vilket möjliggör fritt flöde av floem sav. Det andra, det tar bort den kavitationsbubbla i genererade xylem medan skärning och därmed möjliggör xylem transport. Storleken på det andra snittet beros på de använda växterna. I anläggningar med större bladskaft det borde vara flera millimeter (upp till 1 cm) ovanför den första snittet, i växter som Arabidopsis, 1-2 mm är tillräckliga.
Användningen av denna metod kan leda till upptäckten av nya föreningar i floem utsöndringar som kunde ha signalering, utvecklingsmässiga eller biomedicinsk konsekvenser. Det har föranlett en mer ingående titt på långväga lipid signalering, som var lite studerade fält inom vetenskap växt på grund av bristande tillgång till floemet.
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete stöddes av National Science Foundation NSF-IOS bevilja # 1144391 till SHB.
K2-EDTA | Sigma-Aldrich | ED2P-500G | |
Shallow Glass or plastic Petri Dish (7-15 cm) | PYREX or Corning | Any clean, shallow dish will work | |
Chloroform | EMD | CX1054-1 | Only open containers in fume hood |
Methanol | J.T.Baker | 9070-03 | |
Screw cap tubes | VWR International | 53283-800 | |
Screw cap tubes | Sun Sri | 13-425 | |
Eppendorf tubes | Denville | C2170 |