Kennis van de samenstelling van het floëem sap en het mechanisme van de lading en langeafstandsvervoer is essentieel voor het begrijpen van de lange afstand signalering bij ontwikkeling en stress / pathogeen respons planten en assimileren transport. Dit manuscript beschrijft de verzameling van floëem exsudaten gebruik van de EDTA-gefaciliteerd methode.
De plant floëem is essentieel voor het vervoer over lange afstand van de (foto-) assimileert alsook van signalen overbrengen van biotische of abiotische stress. Het bevat suikers, aminozuren, eiwitten, RNA, lipiden en andere metabolieten. Hoewel er een grote belangstelling voor het begrijpen van de samenstelling en functie van het floëem, de rol van veel van deze moleculen en dus hun belang in ontwikkeling en stress plantenrespons moet nog worden bepaald. Een hindernis bij floëem analyse ligt in het feit dat het floëem zeehonden zich op verwonden. Dientengevolge, het aantal planten waaruit floëem sap kan worden verkregen beperkt. Een methode die collectie van floëem afscheidingen laat uit verschillende plantensoorten zonder toegevoegde apparatuur is de EDTA-gefaciliteerde floëem exsudaat collectie hier beschreven. Hoewel het gemakkelijk is te gebruiken, leidt wel tot het verwonden van cellen en zorg moet worden genomen om de inhoud van beschadigde cellen te verwijderen. Bovendien hebben verschillende controles zuiverheid van het exsudaat tonennoodzakelijk. Omdat het een afscheiding in plaats van een directe inning van het floëem sap (niet mogelijk in veel soorten) slechts relatieve kwantificering van de inhoud kan ontstaan. Het voordeel van deze methode boven anderen is dat het kan worden gebruikt in vele kruidachtige en houtachtige plantensoorten (Perilla, Arabidopsis, populier, enz.) en vereist minimale uitrusting en training. Het leidt tot redelijk grote hoeveelheden exsudaten die kan worden gebruikt voor daaropvolgende analyse van eiwitten, suikers, lipiden, RNA, virussen en metabolieten. Het is eenvoudig genoeg dat het kan worden gebruikt in zowel onderzoek als in het onderwijs laboratorium.
Planten kunnen niet bewegen om ongunstige omstandigheden te ontsnappen. Bijgevolg moesten ze mechanismen om milieu-invloeden te detecteren ontwikkelen, uitlokken en zenden een bijbehorende signaal door de plant, en de ontwikkeling aan te passen. Twee transportsystemen bestaan voor de distributie van water, voedingsstoffen en andere (signalering) verbindingen. De eerste is het xyleem, die typisch transporteert water en mineralen opgenomen door de wortels in de plant. De tweede is het floëem. Volgens de floëem is veranderd van een eenvoudige assimileren transportsysteem met een leiding voor RNA, eiwitten, virussen, lipiden en andere kleine moleculen. Het speelt een belangrijke rol bij assimileren en transport van nutriënten, respons op biotische en abiotische stress, en in plantengroei en-ontwikkeling. Het wordt nu genoemd de "informatiesnelweg" van de plant 18.
De floëem bestaat uit verschillende celtypes: floëem parenchym, alsmede gespecialiseerde companion cells en zeef elementen. De zeef element is de plaats van de lange afstand beweging. Te zorgen voor onbelemmerde langsstroming, worden zeef elementen ontbreken de meeste organellen evenals kernen en worden verondersteld om in het beste geval een beperkte translatiemachinerie 21, 33 bevatten. Men gelooft dat companion cellen synthetiseren eiwitten en andere verbindingen, die reizen op het floëem stroom. Deze verbindingen worden vervolgens in de zeef element via plasmodesmata vervoerd en kan functioneren als lange afstand signalen 4,16.
Verschillende groepen van verbindingen kunnen worden gevonden in floëem exsudaten:
De uitdaging in het werken met planten floëem ligt in zijn vermogen om zichzelf te verzegelen na verwonding. Er zijn vier belangrijke methoden die worden gebruikt om floëem afscheidingen te verzamelen, maar ze werken alleen in een beperkt aantal soorten:
1) In komkommerachtigen is het mogelijk om redelijke hoeveelheden floëem exsudaat vinden doorsnijdingen van de bladsteel. Zodra de eerste druppel met verontreiniging van verwonde cellen wordt verwijderd, is het mogelijk om redelijk grote hoeveelheden van zuiver sap floëem 1, 15 te verkrijgen. Echter, met toenemende verzamelen tijd, dit exsudaat verdikt, zodat het steeds ongeschikt voor vloeistofchromatografie benaderingen (niet gepubliceerd). Recente publicaties suggereren, dat afhankelijk van de soort, dit floëem sap wordt afgeleid van either de fasciculair (FP) of de extrafascicular floëem (EP) en dat, terwijl het bevat "mobiele" floëem sap uit de zeef elementen (FP), het is ook gevoelig voor besmetting van andere celtypen, waaronder de xyleem 40, 41 .
2) Een tweede benadering is om floëem sap te verkrijgen via ondiepe sneden of lekken in de stengel of bladsteel. Deze werkwijze is met succes gebruikt in lupine 17, 25, 36 pompoenen en Brassica napus 12. Hier de verontreiniging door verwonde cellen is minimaal en de uitscheidingen zeer zuiver. Echter, planten nodig hebben om gezond en goed van water te zijn, omdat het is zeer uitdagend om selectief punctie gewoon de zeef elementen. Als houtvaten zijn gejat, wordt alle exsudaat getrokken in de houtvaten stroom. Dit maakt de methode geschikt voor planten met zeer fragiel of sterk verhoute bladstelen of stengels.
3) Bladluis stylectomy laat bladluizen hun stilet voegen in de zeef elementen den verwijderen van de bladluis met een laser. Floëem sap wordt afgescheiden door de overgebleven stilet 2, 9, 10, 35, 38. In theorie kunnen alle planten die kunnen worden geïnfecteerd door bladluizen worden gebruikt voor deze aanpak. Toch zullen de meeste kassen of klimaatkamers managers ondersteunt het gebruik van een ziekteverwekker. Bovendien bladluizen introduceer eiwitten in het bastweefsel hun speeksel 19, 33. Dit leidt tot een beperkte transcriptionele herprogrammering 30 en heeft de potentie om de samenstelling floëem 26 wijzigen.
4) De hier beschreven methode is de EDTA-gefaciliteerd uitzweten van floëem sap. Deze methode maakt EDTA om afdichting van de floëem 20 voorkomen. EDTA chelaat Ca2 + ionen die anders zouden deelnemen processen die dicht de floëem. Terwijl EDTA kan leiden tot celbeschadiging 30, hebben verschillende groepen deze methode en acht geen nadelig effect van EDTA concentraties van 10 mM tot 20 mM aan de cel ultrastructuur of phloem laden en transport 5, 24. Om schadelijk effect, en ook interferentie van EDTA met chromatografie en gelelektroforese verminderen, worden de planten verplaatst naar water na 1 uur en alleen het laatste deel van het exsudaat wordt gebruikt 14. Dus, in plaats van afscheiding in EDTA, wordt phloem exudated in water (EDTA-gefaciliteerd uitzweten). Het is een straight-forward, lage kosten, en de low-tech methode voor het verzamelen van floëem afscheidingen. Floëem sap deze wijze verkregen kan worden gebruikt om eiwitten, kleine moleculen, lipiden en RNA analyse en is met succes gebruikt in veel planten. Terwijl een beperkt aantal experimenten werd uitgevoerd in eenzaadlobbigen 11, wordt de methode meer geschikt voor tweezaadlobbigen (Perilla 17, 20, Arabidopsis 8, 13, 14, populier 7). Verzameling van exudaten moet plaatsvinden in een vochtige omgeving om verlies van uitscheidingen voorkomen door transpiratie. Afhankelijk van de installatie, incubatie in EDTA gedurende 1-2 uur isvoldoende afdichting van het floëem / zeef elementen te voorkomen. De collectie kan dan plaatsvinden in het water. Dit heeft het voordeel van het voorkomen van de negatieve gevolgen EDTA op celstructuur en stabiliteit. Tevens elimineert de interferentie van EDTA met methoden zoals HPLC of SDS-PAGE. Aangetoond zoals dit geldt voor Arabidopsis. Voor grotere installaties incubatie in EDTA en exsudaat verzamelingen moet worden opgeschaald en wordt uitgevoerd in bekers plaats in 1,7 ml reageerbuisjes.
De EDTA-gefaciliteerd collectie van floëem afscheidingen is heel simpel, moet een minimale uitrusting, en is van toepassing op de meeste planten. Kortom, deze werkwijze breidt de mogelijkheid floëem uitscheidingen analyseren van meer species. Hoewel het exsudaat wordt verdund, is het gemakkelijk om verschillende monsters of veel planten te schalen tot een grote hoeveelheid materiaal. Dit maakt vervolgens de detectie van nieuwe verbindingen die in zeer lage abundantie en anders zouden worden gezien.
Deze methode kan gebruikt worden voor verschillende plantensoorten en werkt zoals beschreven in dit manuscript opgegeven talen. Als er nieuwe soorten worden verkend, de twee aspecten die wijziging nodig zou kunnen hebben zijn het aantal bladeren gebruikt en het tijdstip van de afscheiding. In de meeste gevallen moet een uur exudaat 07:55 geschikt. Om het gebruik van deze methode voor een nieuwe plantensoorten bevestigen exsudaat moet worden verzameld en een of meer van de volgende als beschreven in protocol deel 4 needs te voeren. Afhankelijk van de intensiteit van het signaal waargenomen, kan de opvangcapaciteit moet worden opgeschaald. In het algemeen zullen lipiden en eiwitanalyse meer materiaal dan suiker en metabolietanalyse worden omdat de eerstgenoemde minder overvloedig in floëem exudaten.
Omdat EDTA gefaciliteerde exudaat verzameling omvat gesneden oppervlakken en een potentieel schadelijke effect van EDTA, diverse punten moeten worden overwogen: (1) na een uur incubatie met EDTA, de bladstelen moeten grondig worden gewassen. Dit verwijdert alle samenstellingen uit gewonde cellen alsmede de EDTA zelf, die cellen kunnen beschadigen of die de extractie. (2) Positieve en negatieve controles moeten worden opgenomen om ervoor te zorgen verkregen gegevens zijn afgeleid van floëem sap en niet die van gewonde cellen (zie hieronder kritische stappen). (3) bastweefsel sap bevat verschillende enzymen, die tijdens wondvocht collectie actief kon zijn. Vandaar dat in sommige gevallen het nuttig om voor verzamelen kanr verschillende hoeveelheden tijd. (4) Aangezien de werkwijze betrokken exudatie in water, een absolute kwantificering van de verbindingen niet mogelijk.
Kritische stappen: De sleutel tot het succesvol gebruik van deze methode is het gebruik van voorzichtigheid tijdens het hanteren van het monster aan alle cellen, alsook het gebruik van passende controles niet verwonden (zie ref 14.). Een geschikte controle is de collectie van floëem afscheidingen zonder voorafgaande behandeling met EDTA. In dit geval zal het floëem zelf dichten en geen exsudaat kunnen worden verzameld. Elke vervuilende stoffen afkomstig van de gewonde cellen zullen hier worden gedetecteerd. Een tweede controle zou de analyse van suikers in het exsudaat zijn. In Arabidopsis, moet sucrose zijn de belangrijkste metaboliet in het floëem sap, met fructose naar sacharose verhouding van 1:04-01:08 (ref 8, 14).
Voor RNA-extractie het gebruik van een RNAse inhibitor noodzakelijk. Bovendien, een positieve controle van eerder described floëem-gelokaliseerde mRNA (UBC9: Ubiquitine conjugerend enzym 9, At4g27960, 8, 14) en een negatieve controle voor bijvoorbeeld een chloroplast mRNA (Rubisco LSU) te bepalen.
Omdat het exsudaat bevat actieve enzymen, is een tijdsverloop geadviseerd om zeker veranderingen in het floëem profiel te maken zijn niet alleen te wijten aan variaties in de collectie tijd. In sommige gevallen kan het nuttig zijn om proteaseremmers gebruiken. Echter, de onderzoekers moeten in gedachten houden, dat de verzamelde wondvocht zal worden geconcentreerd en dat eventuele toegevoegde verbindingen zal grotendeels worden geconcentreerd. Een tweede belangrijke stap in het protocol is de Versnijden van de bladsteel onder EDTA. Deze stap heeft een tweeledig doel: ten eerste, het verwijdert alle geasfalteerde zeef platen terwijl het voorkomen van de vorming van nieuwe pluggen waardoor voor vrije doorstroming van het floëem sap. Ten tweede, het verwijdert de cavitatie zeepbel in de houtvaten gegenereerd tijdens het snijden en dus zorgt voor xyleem vervoer. De grootte van de tweede snede afhangenTussen de planten gebruikt. In installaties met grotere bladstelen moet verscheidene millimeters (1 cm) boven het aansnijden in planten zoals Arabidopsis, 1-2 mm voldoende.
Het gebruik van deze werkwijze kan leiden tot de ontdekking van nieuwe verbindingen in floëem exsudaten die kunnen signaleren, ontwikkelings-of biomedische gevolgen. Het heeft een meer gevraagd diepgaande blik op lange afstand lipide signalering, wat een weinig onderzocht gebied was binnen de plantkunde te wijten aan het gebrek aan toegang tot het floëem.
The authors have nothing to disclose.
Dit werk werd ondersteund door de National Science Foundation NSF-IOS subsidie # 1144391 aan SHB.
K2-EDTA | Sigma-Aldrich | ED2P-500G | |
Shallow Glass or plastic Petri Dish (7-15 cm) | PYREX or Corning | Any clean, shallow dish will work | |
Chloroform | EMD | CX1054-1 | Only open containers in fume hood |
Methanol | J.T.Baker | 9070-03 | |
Screw cap tubes | VWR International | 53283-800 | |
Screw cap tubes | Sun Sri | 13-425 | |
Eppendorf tubes | Denville | C2170 |