फ्लोएम रस की रचना के साथ ही इसकी लदान और लंबी दूरी की परिवहन की व्यवस्था का ज्ञान संयंत्र विकास और तनाव / रोगज़नक़ प्रतिक्रिया में और परिवहन आत्मसात की लंबी दूरी के संकेत को समझने के लिए आवश्यक है. यह पांडुलिपि ईडीटीए-मदद की पद्धति का उपयोग फ्लोएम exudates के संग्रह का वर्णन करता है.
संयंत्र फ्लोएम की लंबी दूरी की परिवहन (फोटो) के रूप में अच्छी तरह से जैविक या अजैव तनाव की सूचना के संकेत के रूप में assimilates के लिए आवश्यक है. यह शक्कर, अमीनो एसिड, प्रोटीन, आरएनए, लिपिड और अन्य मेटाबोलाइट्स होता है. इस प्रकार की संरचना और समारोह फ्लोएम की, इन अणुओं में से कई की भूमिका और समझने में एक बड़ी रुचि नहीं है, संयंत्र विकास और तनाव में उनके महत्व प्रतिक्रिया अभी तक निर्धारित किया गया है. फ्लोएम विश्लेषण करने के लिए एक बाधा पर फ्लोएम जवानों खुद घायल हो गए हैं कि इस तथ्य में निहित है. नतीजतन, फ्लोएम रस प्राप्त किया जा सकता है, जहां से पौधों की संख्या सीमित है. जोड़ा उपकरणों के बिना कई प्रजातियों के पौधे से फ्लोएम exudates के संग्रह की अनुमति देता है कि एक विधि ईडीटीए-मदद की फ्लोएम पीब संग्रह यहाँ वर्णित है. यह प्रयोग करने में आसान है, यह कोशिकाओं के लोग घायल हो गए करने के लिए नेतृत्व करता है और देखभाल क्षतिग्रस्त कोशिकाओं की सामग्री को हटाने के लिए लिया जाना है. इसके अलावा, कई नियंत्रण पीब की पवित्रता साबित करने के लिएजरूरी हैं. यह बल्कि उसकी सामग्री का केवल रिश्तेदार मात्रा का ठहराव हो सकता फ्लोएम रस (कई प्रजातियों में संभव नहीं) के एक प्रत्यक्ष संग्रह से एक रसकर बहना है. दूसरों पर इस विधि का लाभ यह है कि कई घास या वुडी पौधों की प्रजातियों (Perilla, Arabidopsis, चिनार, आदि) में प्रयोग किया जाता है और कम से कम उपकरण और प्रशिक्षण की आवश्यकता हो सकती है. यह प्रोटीन, शर्करा, लिपिड, शाही सेना, वायरस और मेटाबोलाइट्स के बाद के विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है कि exudates की काफी बड़ी मात्रा में होता है. यह दोनों एक शोध में और साथ ही एक शिक्षण प्रयोगशाला में इस्तेमाल किया जा सकता है कि काफी सरल है.
पौधों को प्रतिकूल परिस्थितियों से बचने के लिए कदम नहीं कर सकते. नतीजतन, वे, पर्यावरण तनाव का पता लगाने के लिए तंत्र विकसित प्रकाश में लाना और संयंत्र भर में एक संबंधित संकेत संचारित, और तदनुसार विकास को समायोजित करने के लिए किया था. दो परिवहन व्यवस्था पानी, पोषक तत्वों और अन्य (संकेत) यौगिकों के वितरण के लिए मौजूद हैं. पहले जाइलम है, आम तौर पर पानी के परिवहन और खनिजों संयंत्र भर जड़ों से ऊपर ले लिया है. दूसरी फ्लोएम है. फ्लोएम के मद्देनजर शाही सेना के लिए एक सरल आत्मसात परिवहन प्रणाली से एक नाली के लिए बदल गया है, प्रोटीन, वायरस, लिपिड और अन्य छोटे अणुओं. यह करने में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है आत्मसात और पोषक तत्व परिवहन, जैविक और अजैविक तनाव की प्रतिक्रिया है, साथ ही पौधों की वृद्धि और विकास के रूप में. अब यह संयंत्र 18 के "सूचना सुपर हाइवे" कहा जाता है.
फ्लोएम पैरेन्काइमा, साथ ही विशेष साथी CE: फ्लोएम कई प्रकार की कोशिकाओं के शामिल हैऔर LLS चलनी तत्वों. चलनी तत्व लंबी दूरी की आंदोलन की साइट है. अबाधित अनुदैर्ध्य प्रवाह के लिए अनुमति देने के लिए, चलनी तत्वों के साथ नाभिक के रूप में सबसे organelles याद कर रहे हैं और सबसे अच्छे रूप में एक सीमित अनुवादकीय मशीनरी 21, 33 को रोकने के लिए लगा रहे हैं. यह साथी की कोशिकाओं को प्रोटीन और फ्लोएम धारा में यात्रा जो अन्य यौगिकों, synthesize माना जाता है. इन यौगिकों तो plasmodesmata के माध्यम से चलनी तत्व में ले जाया जाता है और लंबी दूरी के संकेत 4,16 के रूप में कार्य कर सकते हैं.
यौगिकों के कई समूहों फ्लोएम exudates में पाया जा सकता है:
संयंत्र फ्लोएम के साथ काम करने में चुनौती लोग घायल हो गए पर ही सील करने के लिए अपनी क्षमता में निहित है. वहाँ फ्लोएम exudates इकट्ठा किया चार प्रमुख तरीके हैं, फिर भी वे चुनिंदा प्रजातियों में ही काम करते हैं:
1) cucurbits में यह डंठल की कटौती के माध्यम से फ्लोएम पीब का उचित मात्रा में प्राप्त करने के लिए संभव है. घायल कोशिकाओं के संक्रमण के साथ प्रारंभिक बूंद निकाल दिया जाता है एक बार, यह शुद्ध फ्लोएम रस 1, 15 की काफी बड़ी मात्रा में प्राप्त करने के लिए संभव है. हालांकि, बढ़ती संग्रह समय के साथ, तरल क्रोमैटोग्राफी दृष्टिकोण (अप्रकाशित) के लिए यह तेजी से अनुपयुक्त इस पीब गाढ़ा बना रही है. हाल के प्रकाशनों प्रजातियों पर निर्भर करता है, इस फ्लोएम रस eithe से प्राप्त होता है, सुझावयह चलनी तत्वों (एफपी) से "मोबाइल" फ्लोएम रस को नियंत्रित करता है, जबकि आर स्तबकीय (एफपी) या extrafascicular फ्लोएम (ईपी) और कहा कि, यह भी जाइलम 40 सहित अन्य प्रकार की कोशिकाओं, 41 से संक्रमण होने का खतरा है .
2) एक दूसरा दृष्टिकोण स्टेम या डंठल में उथले कटौती या छिद्र के माध्यम से फ्लोएम रस प्राप्त करने के लिए है. इस विधि वृक 17, 25, cucurbits 36, और ब्रेसिका napus 12 में सफलतापूर्वक इस्तेमाल किया गया है. यहां घायल कोशिकाओं से प्रदूषण को कम से कम है और बहुत शुद्ध exudates. हालांकि, पौधों के लिए यह बहुत ही चुनिंदा पंचर बस चलनी तत्वों को चुनौती दे रहा है, क्योंकि स्वस्थ और अच्छी तरह से पानी पिलाया होने की जरूरत है. जाइलम वाहिकाओं nicked रहे हैं, सभी पीब जाइलम धारा में तैयार की है. यह बहुत ही कमजोर या अत्यधिक lignified पर्णवृन्त या तनों के साथ पौधों के लिए अनुपयुक्त विधि बनाता है.
3) Aphid stylectomy एफिड्स चलनी तत्वों में अपने ख़ंजर डालने के लिए अनुमति देता हैn एक लेजर के साथ एफिड हटा. फ्लोएम रस शेष ख़ंजर 2, 9, 10, 35, 38 के माध्यम से जताया है. सिद्धांत रूप में, एफिड से संक्रमित हो सकता है कि किसी भी संयंत्र इस दृष्टिकोण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. हालांकि, सबसे ज्यादा ग्रीन हाउस या विकास कक्ष प्रबंधकों को एक रोगज़नक़ के उपयोग का समर्थन नहीं करेंगे. इसके अलावा, एफिड्स उनके लार 19, 33 के साथ फ्लोएम में कई प्रोटीन का परिचय. यह 30 reprogramming एक सीमित ट्रांसक्रिप्शनल की ओर जाता है और फ्लोएम रचना 26 बदलने की क्षमता है.
4) यहाँ वर्णित विधि फ्लोएम रस के ईडीटीए-मदद की स्त्राव है. इस विधि फ्लोएम 20 की सीलिंग रोकने के लिए ईडीटीए कार्यरत हैं. EDTA के सीए 2 + अन्यथा फ्लोएम सील कि प्रक्रियाओं में भाग लेंगे कि आयनों chelates. EDTA के सेल नुकसान 30 के लिए नेतृत्व कर सकते हैं, कई समूहों सेल फैटी पर या phloe पर 20 मिमी के लिए इस विधि का इस्तेमाल किया और 10 मिमी से ईडीटीए सांद्रता का कोई प्रतिकूल प्रभाव देखा हैमीटर लदान और परिवहन 5, 24. किसी भी हानिकारक प्रभाव के साथ ही क्रोमैटोग्राफी और जेल वैद्युतकणसंचलन साथ EDTA के हस्तक्षेप को कम करने के लिए, पौधों 1 घंटे के बाद पानी में चले गए हैं और पीब के केवल बाद के हिस्से 14 प्रयोग किया जाता है. इस प्रकार, बल्कि ईडीटीए में रिसाव से, फ्लोएम पानी (EDTA-मदद की स्त्राव) में exudated है. यह फ्लोएम exudates के संग्रह के लिए एक सीधे आगे, कम लागत, और कम तकनीकी विधि है. फ्लोएम रस इस तरह प्रोटीन, छोटे अणुओं, लिपिड, और RNAs का विश्लेषण करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता प्राप्त की और कई पौधों में सफलतापूर्वक इस्तेमाल किया गया है. प्रयोगों की एक सीमित मात्रा में monocots 11 में प्रदर्शन किया गया है, वहीं विधि डाइकोटों (Perilla 17, 20, Arabidopsis 8, 13, 14, चिनार 7) के लिए अधिक उपयुक्त प्रतीत होता है. Exudates का संग्रह स्वेद के माध्यम से exudates के नुकसान से बचने के लिए एक नम वातावरण में होती है. संयंत्र पर निर्भर करता है, एक से दो घंटे के लिए EDTA में ऊष्मायन हैफ्लोएम / चलनी तत्वों की सीलिंग रोकने के लिए पर्याप्त. संग्रह फिर पानी में हो सकता है. इस ईडीटीए सेल संरचना और स्थिरता पर है नकारात्मक प्रभाव को रोकने का लाभ दिया है. यह भी HPLC या एसडीएस पृष्ठ जैसे तरीकों के साथ EDTA के हस्तक्षेप को समाप्त. यह Arabidopsis पर लागू होता है के रूप में यह दिखाया गया है. बड़े पौधों के लिए, EDTA और पीब संग्रह में ऊष्मायन को बढ़ाया जाना है और नहीं बल्कि 1.7 मिलीलीटर प्रतिक्रिया ट्यूबों में से बीकर में किया जाता है.
फ्लोएम exudates की ईडीटीए-सुगम संग्रह बहुत सरल है, न्यूनतम उपकरणों की जरूरत है, और सबसे अधिक पौधों के लिए लागू है. कुल मिलाकर, इस विधि से अधिक प्रजातियों से फ्लोएम exudates विश्लेषण करने की क्षमता प्रदान करता है. पीब पतला है, यह सामग्री की एक बड़ी राशि के लिए पैमाने पर करने के लिए कई अलग अलग नमूने लेने या कई पौधों से करने के लिए आसान है. यह तो बहुत कम बहुतायत में हैं और अन्यथा की अनदेखी हो जाएगा कि उपन्यास यौगिकों का पता लगाने के लिए अनुमति देता है.
यह विधि कई प्रजातियों के पौधे के लिए इस्तेमाल किया और इस पांडुलिपि में सूचीबद्ध लोगों के लिए वर्णित के रूप में काम करता है हो सकता है. नई प्रजातियों का पता लगाया जाता है, तो संशोधन की आवश्यकता हो सकती है कि दो पहलुओं इस्तेमाल किया पत्तियों और स्त्राव के समय की संख्या में हैं. ज्यादातर मामलों में, पांच को आठ घंटे स्त्राव उपयुक्त होना चाहिए. एक नए संयंत्र प्रजातियों के लिए इस विधि का उपयोग की पुष्टि करने के लिए, पीब प्रोटोकॉल भाग 4 n में वर्णित के रूप में एकत्र की है और बाद के विश्लेषण के लिए एक या अधिक होने की जरूरतeeds प्रदर्शन किया जाएगा. मनाया संकेत की तीव्रता पर निर्भर करता है, संग्रह की मात्रा को बढ़ाया जा करना पड़ सकता है. पूर्व फ्लोएम exudates में कम प्रचुर मात्रा में होते हैं, सामान्य में, लिपिड और प्रोटीन विश्लेषण चीनी और metabolite विश्लेषण से अधिक सामग्री की आवश्यकता होगी.
ईडीटीए-मदद की पीब संग्रह कटौती सतहों के साथ ही EDTA के एक संभावित हानिकारक प्रभाव शामिल है, कई बिंदुओं पर विचार किया जाना है: (1) EDTA के साथ एक घंटे ऊष्मायन के बाद, पर्णवृन्त अच्छी तरह से धोया जाना है. इस घायल कोशिकाओं के रूप में अच्छी तरह से कोशिकाओं को नुकसान या निकासी के साथ हस्तक्षेप कर सकता है जो ईडीटीए ही है, से प्राप्त किसी भी यौगिकों को हटा. (2) सकारात्मक और नकारात्मक नियंत्रण प्राप्त आंकड़ों फ्लोएम रस से प्राप्त कर रहे हैं सुनिश्चित करने के लिए शामिल किया जाना चाहिए और न घायल कोशिकाओं से (नीचे महत्वपूर्ण कदम देखें). (3) फ्लोएम रस पीब संग्रह के दौरान सक्रिय हो सकता है जो कई एंजाइमों, नियंत्रित करता है. इसलिए, कुछ मामलों में यह के लिए इकट्ठा करने के लिए उपयोगी हो सकता हैसमय के आर विभिन्न मात्रा. विधि पानी में रिसाव शामिल के बाद से (4), यौगिकों की एक पूर्ण मात्रा का ठहराव संभव नहीं है.
महत्वपूर्ण कदम: (. रेफरी देख 14) उचित नियंत्रण के किसी भी कोशिकाओं के रूप में भी उपयोग चोट पहुंचाना नहीं करने के लिए नमूना से निपटने जबकि इस विधि का सफल प्रयोग करने के लिए महत्वपूर्ण सतर्कता का इस्तेमाल होता है. एक उपयुक्त नियंत्रण EDTA के साथ पूर्व इलाज के बिना फ्लोएम exudates का संग्रह है. इस मामले में फ्लोएम ही सील होगा और कोई पीब एकत्र किया जा सकता है. घायल कोशिकाओं से आने वाले किसी भी contaminating यौगिकों यहाँ पता लगाया जाएगा. एक दूसरा नियंत्रण पीब में शर्करा का विश्लेषण किया जाएगा. Arabidopsis में, सूक्रोज 1:04 और 1:08 (रेफरी 8, 14) के बीच की sucrose के अनुपात को फ्रुक्टोज के साथ, फ्लोएम रस के भीतर प्रमुख मेटाबोलाइट होना चाहिए.
शाही सेना निकासी के लिए एक RNase अवरोध का उपयोग आवश्यक है. पहले describ के अलावा, एक सकारात्मक नियंत्रणएड फ्लोएम स्थानीयकृत mRNA (UBC9: Ubiquitin conjugating एंजाइम 9, At4g27960, 8, 14) और उदाहरण के लिए की एक नकारात्मक नियंत्रण एक क्लोरोप्लास्ट mRNA (Rubisco LSU) की सलाह दी जाती हैं.
पीब सक्रिय एंजाइम होता है, क्योंकि एक समय पाठ्यक्रम संग्रह समय में बदलाव करने के लिए बस की वजह से नहीं कर रहे हैं फ्लोएम प्रोफ़ाइल में यकीन बदलाव करने की सलाह दी है. कुछ मामलों में, यह proteinase अवरोधकों का उपयोग करने के लिए फायदेमंद हो सकता है. हालांकि, जांचकर्ताओं एकत्र पीब ध्यान केंद्रित किया है और किसी भी जोड़ा यौगिकों मोटे तौर पर ध्यान केंद्रित किया जाएगा कि हो जाएगा कि, मन में रखने की जरूरत है. प्रोटोकॉल के भीतर एक दूसरा महत्वपूर्ण कदम EDTA के तहत डंठल की recutting है. यह कदम एक दोहरे उद्देश्य में कार्य करता है: नई इस प्रकार फ्लोएम रस के मुक्त प्रवाह की अनुमति के लिए प्लग के गठन को रोकने, जबकि सबसे पहले, यह किसी भी सील चलनी प्लेटें निकाल देता है. दूसरा, यह जबकि काटने उत्पन्न जाइलम में cavitation बुलबुले को निकालता है और इस प्रकार जाइलम परिवहन के लिए अनुमति देता है. दूसरी कट का आकार निर्भरइस्तेमाल पौधों पर है. बड़ा पर्णवृन्त साथ पौधों में यह Arabidopsis जैसे पौधों में पहली कट, ऊपर कई मिलीमीटर (1 सेमी) होना चाहिए, 1-2 मिमी के लिए पर्याप्त हैं.
इस विधि का उपयोग, विकास या जैव चिकित्सा निहितार्थ संकेत हो सकता है कि फ्लोएम exudates में उपन्यास यौगिकों की खोज करने के लिए नेतृत्व कर सकते हैं. यह फ्लोएम लिए उपयोग की कमी के कारण संयंत्र विज्ञान के भीतर एक छोटे से अध्ययन क्षेत्र था जो लंबी दूरी लिपिड संकेत, पर में गहराई से देखो एक अधिक प्रेरित किया है.
The authors have nothing to disclose.
यह काम राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन NSF-आईओएस अनुदान # 1144391 तक SHB द्वारा समर्थित किया गया था.
K2-EDTA | Sigma-Aldrich | ED2P-500G | |
Shallow Glass or plastic Petri Dish (7-15 cm) | PYREX or Corning | Any clean, shallow dish will work | |
Chloroform | EMD | CX1054-1 | Only open containers in fume hood |
Methanol | J.T.Baker | 9070-03 | |
Screw cap tubes | VWR International | 53283-800 | |
Screw cap tubes | Sun Sri | 13-425 | |
Eppendorf tubes | Denville | C2170 |