Summary
Aquí se describe una forma de expresar antígenos de superficie del virus de la influenza correctamente plegadas y funcionales derivadas del nuevo virus H7N9 chino en células de insecto. La técnica se puede adaptar para expresar ectodominios de cualquiera de las proteínas de superficie virales o celulares.
Abstract
El sistema de expresión de baculovirus es una herramienta poderosa para la expresión de proteínas recombinantes. Aquí lo utilizamos para producir versiones correctamente plegadas y glicosilados de la influenza A virus glicoproteínas de superficie - la hemaglutinina (HA) y la neuraminidasa (NA). A modo de ejemplo, hemos elegido las proteínas HA y NA expresadas por el nuevo virus H7N9 que emergió recientemente en China. Sin embargo, el protocolo se puede adaptar fácilmente para las proteínas HA y NA expresadas por cualquier otro de la gripe A y B cepas de virus. Proteínas recombinantes HA (rHA) y NA (ARN) son reactivos importantes para ensayos inmunológicos tales como ELISPOT y ELISA, y también son de uso generalizado para la normalización de la vacuna, el descubrimiento de anticuerpos, el aislamiento y la caracterización. Además, las moléculas de NA recombinantes pueden usarse para la detección de inhibidores de moléculas pequeñas y son útiles para la caracterización de la función enzimática de la AN, así como su sensibilidad a los antivirales. Proteínas HA recombinantes también son being probado como vacunas experimentales en modelos animales, y una vacuna basada en HA recombinante fue autorizado recientemente por la FDA para su uso en seres humanos. El método como se describe aquí para producir estas moléculas es sencillo y puede facilitar la investigación en laboratorios de la gripe, ya que permite la producción de grandes cantidades de proteínas rápidas y a un bajo costo. Aunque aquí nos centramos en las glicoproteínas de superficie del virus de la gripe, este método también puede ser usado para producir otras proteínas de superficie virales y celulares.
Introduction
Como primera respuesta a la reciente aparición de la nueva cepa del virus de la influenza H7N9 en China, adquirimos plásmidos portadores de las secuencias genómicas de la hemaglutinina (HA) y la neuraminidasa (NA) genes de los dos primeros aislamientos. El uso de estos plásmidos que pudimos construir rápidamente los vectores de expresión de baculovirus para la producción de HA y NA recombinante en células de insecto. Este sistema de expresión está bien establecida en nuestro laboratorio y ha demostrado ser fundamental para muchos de nuestros proyectos de investigación en curso 1-8. Las células de insectos son capaces de doblar correctamente y después de la traducción modificar proteínas complejas. Estas modificaciones incluyen la glicosilación ligada a N, lo cual es importante para muchas glicoproteínas virales. Como tal, no es sorprendente que el sistema de baculovirus es bastante establecido para la expresión de antígenos de superficie del virus de la gripe. De hecho, muchas de las estructuras cristalinas de HA y NA han sido resueltos utilizando proteínas de las células de insectos expresado 9-11. Otra ventaja de lasistema se encuentra en sus rendimientos fiables de alto valor proteico de hasta 30 mg de cultivo celular HA / L (en base a nuestra experiencia con más de 50 diferentes proteínas HA) - Una consecuencia de la expresión dirigida por virus la infección por el fuerte promotor de la polihedrina.
La eliminación de la transmembrana y endodominio de las proteínas HA y NA permite la expresión de versiones secretables, solubles de las proteínas y por lo tanto facilita en gran medida el proceso de purificación. Además, estos ectodominios se hexahistidina etiquetados y por lo tanto se pueden purificar utilizando cromatografía de afinidad utilizando Ni 2 +-resina. Los dominios transmembrana de las proteínas HA y NA contribuyen a la formación de homotrímero y homotetrámero, respectivamente. Con el fin de preservar estas oligomerizaciones, se añade un dominio de trimerización C-terminal para el HA-, y un tetramerización dominio N-terminal a la AN construcciones (Figura 1). Hemos demostrado de manera concluyente que tal dominio de trimerización estabiliza funcional, conserved epítopos conformacionales en el tallo en el dominio de HA 1. El tetramerización correcta de la NA también podría contribuir a corregir el plegado y la función NA 10. Secuencias y vectores de baculovirus de transferencia de albergar dominios de trimerización o tetramerización pueden solicitarse a los autores o de otros laboratorios en el campo, 9,10,12.
Otra cuestión importante para la expresión de proteínas secretadas en células de insecto es la elección de la línea celular de la derecha. Mientras Spodoptera frugiperda deriva células Sf9 soportan la replicación de baculovirus muy bien y se utilizan generalmente para el rescate y la propagación del virus, que tienen una capacidad de secretar grandes cantidades de proteína limitado. Trichoplusia ni deriva BTI-TN-5B1-4 células (comúnmente conocidos como High Five) tener una capacidad mayor secreción y son la línea celular de elección para la expresión en este protocolo 13,14. Además, es útil para reducir o incluso eliminar el suero bovino fetal (FBS) a partir de cultivos de expresión. Por lo tanto, utilizamos los medios de comunicación con reducida (3%) Contenido de FBS para el crecimiento de las reservas de trabajo de virus, y llevamos a cabo la expresión de proteínas en medio libre de suero.
Proteínas HA y NA recombinantes se utilizan para muchas técnicas inmunológicas. Tal vez la más común se encuentra en ensayos de ELISA para medir la seroconversión tras la vacunación en humanos o animales 4,6,7,15. HAs y NAS también se utilizan en ensayos de ELISPOT como ambas moléculas estimuladoras y reactivos de detección de células secretoras de anticuerpos 16. Su uso como cebos moleculares permite ordenar específicamente para plasmablasts u otros tipos de células B, que luego se pueden utilizar para aislar anticuerpos monoclonales (terapéuticos) (mAbs). Recombinantes HA y NA moléculas son más utilizados en la caracterización de estos mAb 8. Otros ejemplos incluyen el estudio de la estabilidad del pH o de la especificidad del receptor de ha expresado por diferentes cepas de virus, o cuantitativamente evaluar enzimática específica NAla actividad o la resistencia a los inhibidores. Además, recombinante, purificada de HA se puede utilizar para normalizar el contenido de HA de las vacunas de virus de la gripe inactivados.
Es importante destacar que rHA (y hasta cierto punto NA) vacunas candidatas están actualmente en evaluación en modelos animales y ensayos clínicos en humanos con una vacuna candidata está autorizada por la FDA en 2013 2,17-19. La ventaja de estas nuevas vacunas es que, debido a la naturaleza recombinante de estas proteínas, el proceso de trabajo intensivo de generación de virus de genomas reordenados de alto crecimiento podría ser evitado. Quizás aún más importante es el hecho de que su rendimiento HA es alta y reproducible de cepa a cepa. También, ya que estas vacunas se producen en un sistema libre de huevo, que no contienen contaminantes proteicos que son problemáticos para individuos con alergia al huevo.
Aquí hemos elegido para expresar las proteínas HA y NA de dos aislamientos del nuevo virus de influenza H7N9 Chino, A / Anhui/1/13 y A/Shanghai/1/13 20,21. Estos son ejemplos oportunos, pero el protocolo descrito se pueden utilizar para la expresión de cualquier gripe A y B proteínas HA o NA y se pueden adaptar para expresar cualquier otras proteínas virales o celulares secretadas. Proteínas transmembrana trimérica o tetraméricas pueden ser clonados en los casetes de expresión utilizados para la HA y NA, respectivamente. Sin embargo, las proteínas celulares secretadas más solubles, como los interferones, por ejemplo, no es necesario un dominio adicional para la estabilización y se pueden expresar únicamente con una etiqueta de hexahistidina C-terminal.
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Protocol
1. Generación de baculovirus recombinante
- Clonación en transferencia de plásmidos de baculovirus
- Clon H7 HA y NA N9 ectodominio (o cualquier otro gen HA o NA) en plásmidos de transferencia pFastBac modificados (véase la introducción). Vectores para HA que contiene un dominio de trimerización C-terminal y una etiqueta de hexahistidina, así como para NA que contiene un dominio de tetramerización N-terminal y la etiqueta de hexahistidina, se han descrito 1,10,11,22 (Figura 1) y pueden ser solicitada desde los autores.
Nota explicativa: ectodominios HA expresadas sin un dominio de trimerización se pliegan de forma incorrecta, lo que lleva a la pérdida de epítopos neutralizantes conformacionales, especialmente en el dominio de tallo. Del mismo modo, la función enzimática de NA se basa en tetramerización adecuada. - Generación de bácmidos
Transformar de transferencia de baculovirus-plásmidos que contienen los genes HA y NA en bacterias DH10Bac de acuerdo con una de expresión de baculovirussistema según las instrucciones del fabricante. Aislar y purificar bácmidos utilizando un kit Midiprep de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Figura 2).
- Clon H7 HA y NA N9 ectodominio (o cualquier otro gen HA o NA) en plásmidos de transferencia pFastBac modificados (véase la introducción). Vectores para HA que contiene un dominio de trimerización C-terminal y una etiqueta de hexahistidina, así como para NA que contiene un dominio de tetramerización N-terminal y la etiqueta de hexahistidina, se han descrito 1,10,11,22 (Figura 1) y pueden ser solicitada desde los autores.
- Rescate de baculovirus recombinante y la verificación de la expresión de proteínas
Nota explicativa: Los siguientes pasos se deben realizar de forma aséptica en una campana de flujo laminar. Realice este procedimiento independiente para HA y NA (o cualquier otro gen de interés). Las células de insecto son generalmente cultivadas a 28 ° C sin CO 2. Células Sf9 para este protocolo se cultivan en medios completos de células de insecto TNM-FH suplementado con 10% de FBS, 1% de Pen-Strep * y solución Pluronic F68 0,1%, si no se indica lo contrario, y se pasaron 1:04 dos veces a la semana. Células High Five se cultivan en suero libre de los medios de comunicación SFX y se pasaron 1:15 dos veces a la semana.
* La adición de antibióticos debe ser considerada opcional en todo el protocolo y ajustarse de acuerdo con las prácticas utilizadas en cada laboratorio.- Placa células de insecto Sf9 en placas de 6 pocillos a una densidad de 2 x 10 5 células / cm 2 y deje reposar durante 20 minutos en una incubadora de 28 ° C (sin CO 2).
- Mezcle 2 g (concentración 0,5-2 mg / l) de bácmido recombinante con 100 l de medio TNM-FH (sin suero, 1% Pen-Strep). Mezclar 6 l de agente de transfección con 100 l de medio TNM-FH (sin suero, Pen-Strep). Combinar los dos volúmenes, mezclar suavemente y dejar reposar durante 20 minutos a temperatura ambiente (mezcla de transfección). Incluya una maqueta de transfección como control (Figura 3).
- Aspirar el sobrenadante de las células Sf9 chapados (células serán ahora se adhieren a la placa) y reemplazar con 2 ml de medio TNM-FH libre de suero que contenía Pen-Strep (1%). Añadir el volumen total de la mezcla de transfección (del paso 1.2.2) y el rock de la placa de 6 pocillos cuidadosamente durante 5 segundos. Incubar en una incubadora de 28 ° C sin CO 2 durante 6 horas (Figura 3).
- Reemplace wi mediosmedios th frescas completo TNM-FH (que contienen 10% de FBS, 1% de Pen-Strep y 0,1% de Pluronic F68). Incubar en una incubadora de 28 ° C sin CO 2 durante 6 días. Compruebe células de vez en cuando bajo un microscopio. Las células infectadas suelen aparecer más grande, más redondo, se han ampliado los núcleos, y comienzan a desprenderse (Figura 4).
- Cosecha de células y la confirmación de la expresión de la proteína
- Células Cosecha 6 días después de la transfección por centrifugación a 2000 xg durante 5 min a temperatura ambiente. El sobrenadante contiene el baculovirus recombinante - esto se utiliza para generar reservas de trabajo de inmediato, o se puede almacenar a 4 ° C por año.
- Para comprobar la expresión de proteínas recoger pellets y resuspender en 500 l de PBS. Mezclar 50 l de la suspensión con 50 l de tampón SDS-PAGE de carga (que contiene un agente reductor). Ejecutar SDS-PAGE y realizar un análisis de transferencia Western con un anticuerpo anti-hexahistidina para confirmar la expresión de genes. Incluya las células de la maquetatransfección como controles negativos (Figura 3).
- Preparación de las reservas de trabajo
- La placa 5 x 10 5 células Sf9 / cm 2 en un matraz T175 cm 2 y deje reposar por 20 min les permiten adherirse al plato. Reemplace completa medios TNM-FH con medios TNM-FH que contiene 3% de SFB (y 1% Pen-Strep, 0,1% de Pluronic F68).
- Infectar las células con 100 l del sobrenadante de rescate. Incubar en una incubadora de 28 ° C y sin CO 2 durante 6 días y comprobar de vez en cuando si las células se infectan (como se describe en el paso 1.2.5.).
- Giran a 2000 x g a temperatura ambiente durante 5 min y se recoge el sobrenadante. Esta es ahora tu P2 de valores. Esta acción se puede almacenar indefinidamente a 4 ° C. Repita el procedimiento de infección usando 100 l de la población P2 para infectar células. La acción resultante se denomina P3 o de stock de trabajo, que se puede almacenar a 4 º C o se usa directamente para la expresión de la proteína. El P3 valores por lo general contiene 10 <sup> 7 -10 9 unidades formadoras de placa / ml.
2. Expresión y Purificación de Proteínas
Nota explicativa: células Sf9 apoyar el crecimiento de baculovirus muy bien. Sin embargo, su capacidad para secretar grandes cantidades de proteína recombinante es limitada. Por ello utilizamos otra línea de células de insecto, células High Five, para la expresión de proteínas recombinantes secretadas. Estas células no apoyar la replicación de baculovirus a títulos muy altos 13 pero tienen alta capacidad secretora.
- Al crecer las células High Five
Se cultivan las células High Five en SFX medio de cultivo de células de insecto en T175 cm 2 frascos. Pasaje cada otro día 01:03. Por una cultura 200 ml expresión tendrá que crecer matraces confluentes 5. - La cosecha y la infección de células High Five
- Separe las células High Five de 5 T175 cm 2 frascos tocando los frascos con la mano. Recoger el suspe celularnsion y transferir a tubos de 50 ml de centrifugación.
- Gira a 1.200 xg durante 7 minutos a temperatura ambiente. Aspirar el sobrenadante por decantación y unir los gránulos mediante resuspensión en 15 ml de stock P3.
- Deje reposar durante 15 minutos en la campana de flujo (Figura 5).
- Transferir 200 ml de medio de cultivo Hyclone SFX en un estéril 1,000 ml frasco agitador limpio (sin buffles, sellado con papel de aluminio antes de esterilizar, no debería haber sido utilizado para cultivos de bacterias antes).
- Transferir la suspensión P3/cell en el matraz agitador. Selle con papel de aluminio estéril y frasco de transferencia en una coctelera. Agitar a 70 rpm a 28 ° C durante 72-96 horas.
- La cosecha de la proteína recombinante de High Five sobrenadantes de expresión de células
- 72-96 h después de la infección de transferencia de los sobrenadantes del cultivo en 500 ml cubos de centrifugación. Gira a 5.500 xg durante 20 min a 4 ° C. Mientras tanto enjuague los matraces de agitación 3 veces con agua bidestilada(DdH2O).
- Transferencia de 3 ml de suspensión de Ni-resina en un tubo de 50 ml con 45 ml de PBS (uno necesita por 200 ml de cultivo). Agitar bien y centrifugar a 3000 xg a temperatura ambiente durante 10 min. Decantar el PBS y mantener el pellet. Mezclar el sobrenadante de células de insecto con el sedimento de Ni-resina y transferir en los matraces de agitación ya enjuagados. Se incuba a 4 º C durante 2-4 horas, mientras se agita (Figura 6).
- Columna de polipropileno ml Monte 10 en una pinza en un soporte de apoyo. Retire las dos tapas y coloque un vaso debajo de la columna para recoger el flujo a través (de residuos). Tome el matraz de agitador de la coctelera y empezar a transferir la mezcla de sobrenadante / suspensión sobre la columna; retendrá la resina Ni-y sólo el sobrenadante fluirá a través. Pasar todo el volumen sobre la columna (Figura 7).
- Lavar los 4x de resina con 15 ml de tampón de lavado (50 mM de Na 2 HCO 3, NaCl 300 mM, imidazol 20 mM, pH 8). Deje que todo el drenaje de tampón de lavadode la columna y cerrarlo con la tapa (lado inferior).
- Añadir 2 ml de tampón de elución (50 mM Na 2 HCO 3, NaCl 300 mM, imidazol 300 mM, pH 8) y dejar reposar durante 5 minutos. Abra la columna y recoger el eluido. Repita esto 3 veces más (un total de 8 ml de tampón de elución). El eluato que contiene altas concentraciones de proteína típicamente muestra de espuma cuando se agitan (Figura 7). Mantenga eluido en hielo húmedo siempre que sea posible.
- El cambio de tampón y la concentración
- Prespin 15 ml unidades de centrifugación de ultrafiltración (30 kDa de corte para HA / NA, pero puede variar dependiendo del tamaño de la proteína purificada) con PBS (pH 7.4 a 7.6) a 3.000 xga 4 º C durante 20 min. Deseche el flujo a través y eluido carga sobre la columna de centrifugación. Llenar con 5 ml de, helada PBS estéril y centrifugado durante 60 minutos a 3000 xga 4 º C.
- Flujo de descarga a través de nuevo, vuelva a llenar con 15 ml de PBS helado y centrifugado durante 60 minutos a 3000 xga 4 º C. Repita este procedimientoDuré una vez más.
- Tome la columna de centrifugación de la centrífuga y se recoge el tampón intercambiado concentrado (típicamente 200 l). Esto está muy concentrado de proteína recombinante. Enjuague la columna de centrifugación con 400 l de hielo frío PBS estéril y añadir este al concentrado. Mantener el concentrado en hielo en todo momento.
3. Caracterización y Control de Calidad
- Medición de la concentración de proteínas
Tomar una alícuota del concentrado y medirlo usando su método de cuantificación de proteínas de elección. Establecer la concentración de proteínas a 1 mg / ml mediante la adición de PBS y congelar pequeñas alícuotas a -80 ° C. Ciclos de congelación y descongelación dañan la estructura de la proteína y pueden conducir a la agregación. - SDS-PAGE y tinción de Coomassie
Correr 500 ng de su proteína en una SDS-PAGE y realizar una tinción de Coomassie. Para la tinción rápida y conveniente utilizar el reactivo de Coomassie en combinación con un protocolo de microondas. Proteínas HA suelen aparecer a los 64 añoskDa mientras que las proteínas NA deben ejecutar en un tamaño de alrededor de 56 kDa (Figuras 8A y B). Utilizando el protocolo descrito no debería ver cualquiera de los productos de degradación. Si se produce la degradación por lo general es una señal de contaminación de levadura / hongos durante la expresión. En este caso, repita el procedimiento y asegúrese de mantener todo estéril. - Western blot / ELISA
Con el fin de verificar la identidad de proteínas se recomienda hacer para una transferencia de Western o ensayo ELISA con un anticuerpo específico. Idealmente, los ensayos de ELISA se realizan con un anticuerpo que se une a epítopos conformacionales (por ejemplo, anticuerpos anti-HA tallo 1). Uso de un anticuerpo tal el correcto plegamiento de la proteína se puede confirmar (Figura 8C). - Medición de la actividad de NA
Plegamiento correcto de la NA viral también se puede determinar midiendo la actividad de NA. Se recomienda realizar esta prueba utilizando el ensayo NA * STAR disponible comercialmente (sólo tienes que seguir las directrices para el usuario).
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Representative Results
Moléculas de HA de A/Shanghai/1/13 y A/Anhui/1/13 expresaron bien con rendimientos de aproximadamente 20 cultura mg / l. Moléculas de NA de ambas cepas mostraron niveles de expresión moderados que van desde 0,2 mg / l de cultivo para A/Shanghai/1/13 a 0,7 mg / L para A/Anhui/1/13. Los cuatro preparaciones de proteína tenían muy poco o nada de las impurezas (Figuras 8A y B) con El ser de mayor pureza que AN que puede explicarse por el nivel de expresión. A/Shanghai/1/13 HA se analizaron mediante ELISA con el ampliamente neutralizantes tallo reactiva humana mAb CR9114 23. Este mAb se une a un epítopo conformacional sensible en el dominio de tallo y se utiliza aquí como una sonda para el correcto plegamiento de este dominio. El anticuerpo muestra una buena unión que da la confianza de que el HA está hecho correctamente plegada (Figura 8C). Un segundo ELISA con anti-H7 suero policlonal de ratón se realizó para confirmar la identidad de la proteína obtenida como de origen H7 (Figura 8D).
Figura 1. Esquema de HA y NA construcciones de expresión. La construcción de expresión para el HA (A) contiene un péptido señal N-terminal seguido por el ectodominio de HA, un sitio de escisión de trombina, un dominio de trimerización T4 y una etiqueta de hexahistidina. La construcción de expresión NA (B) contiene un péptido señal N-terminal seguido de una etiqueta de hexahistidina, una fosfoproteína vasodilatador estimulante (VASP) dominio de tetramerización y el ectodominio NA. Haga clic aquí para ver más grande la figura .
Figura 2. Esquema de ge bácmidoion (como se describe en el paso 1.1.2). Un vector de baculovirus-transferencia que contiene genes HA y NA se transforma en bacterias DH10Bac. La recombinación en el genoma de baculovirus que estas bacterias llevan produce un fenotipo colonia blanca sobre placas de selección. Una colonia blanco se recogió y se volvieron a sembrar. Una sola colonia de la placa se volvieron a sembrar se utiliza para inocular un cultivo Midiprep.
Figura 3. Esquema de rescate baculovirus y trabajar la generación de valores (como se describe en los pasos 1.2.1-6). Bácmido recombinante y transfección de reactivos se diluyen en un medio libre de suero TNM-FH. Las dos soluciones se combinan, la mezcla se incuba durante 20 min y después se transfirieron a células Sf9. Seis horas después de la transfección el medio de transfección se sustituye por completo los medios de comunicación TNM-FH. Seis días después de la transfección se recoge el sobrenadante y el sedimento celular es analyzed para la expresión de proteínas recombinantes.
Figura 4. Células Sf9 células sanas e infectadas. Sf9 en (A) son sanos y no infectados. Ellos están unidos a la placa de cultivo, mira parcialmente polimórfica y relativamente pequeña. Las células en (B) están infectadas con baculovirus, separados de la placa de cultivo, son grandes y redondos y se han ampliado los núcleos. El núcleo también muestra un aspecto granular.
Figura 5. La infección de células High Five con baculovirus recombinante (acciones de trabajo, tal como se describe en el paso 2.2). Cinco frascos T175 confluentes con células High Five se recogen por centrifugación a baja velocidad y se combinaron con 15 ml de P3 de baculovirus. Después de 15 min de enincubación de la mezcla de células / virus se transfiere a 1000 ml de matraces de agitación con 200 ml de los medios de comunicación SFX.
Figura 6. Cosecha de células sobrenadante 72-96 horas después de la infección y la incubación con resina Ni-NTA (como se describe en el paso 2.3). Suspensiones de células infectadas se recogieron por centrifugación a baja velocidad. Los sobrenadantes de cultivo se mezclan con resina de Ni-equilibrada con PBS y se incubaron durante 2-4 horas mientras se agita.
Figura 7. Procedimiento de purificación (tal como se describe en 2.3 y 2.4) y control de calidad (como se describe en los pasos 3.1.1-4). Después de la incubación de la totalidad de la mezcla de sobrenadante / resina se carga en columnas de polipropileno. La resina es retenida por las columnas y luego se lavó cuatro veces con el lavado BUFFer y la proteína recombinante se eluye con 8 ml de tampón de elución aplicadas en 2 ml pasos. El eluato es luego a intercambio de tampón y se concentró con una columna de centrifugación de ultrafiltración, se dividió en alícuotas y congelado. Ensayos de control de calidad incluyen SDS-PAGE, Western Blot, ELISA y la medición de la actividad de NA de NA recombinante.
Figura 8. Los resultados representativos. HA (A) y NA (B) proteínas de A/Anhui/1/13 y A/Shanghai/1/13 se analizaron mediante SDS-PAGE y tinción de Coomassie. La integridad estructural de la HA del A/Shanghai/1/13 se evaluó mediante la CR9114 ampliamente neutralizantes humana tallo de reactivo anticuerpo que se une a un epítopo conformacional sensible (C). La identidad de la misma de HA fue confirmada por un suero de ratón anti-H7 policlonal (D).
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Discussion
Aunque la expresión de virus de la gripe HA y NA proteínas en células de insecto utilizando el sistema de expresión de baculovirus es generalmente sencillo, hay varios puntos importantes a considerar. Es importante, como se ha señalado en la introducción, que los ectodominios de HA y NA se expresan en fusión con dominios de trimerización o tetramerización, respectivamente. Estos dominios garantizar el correcto plegado de las moléculas normalmente ayudado por el dominio de transmembrana, que no está presente si sólo el ectodominio se expresa. Por ejemplo, la expresión del ectodominio de HA sin un dominio de trimerización conduce a la oligomerización y la desestabilización de importantes epítopos neutralizantes en el dominio de tallo 1. Además, la estabilidad de las proteínas se disminuye y la degradación por proteasas de células de insecto y de baculovirus se produce. La elección del dominio de trimerización o tetramerización es menos importante, un número de ellas que van desde dominios de cremallera de leucina 22a foldons fago T4 11 se han probado hasta ahora y todos mostraron resultados satisfactorios. Es importante tener en cuenta que los sitios de escisión multibásicos como ocurren en la altamente patógena H5N1 o H7N7 24 25 aislamientos (pero no en H7N9) deben ser removidos antes de la expresión, ya que están escindidos por furina como proteasas que están presentes en todo momento en el 1,12 sistema de expresión de baculovirus.
Otra posible razón para productos degradational es la contaminación con levaduras o moho. Esto puede ocurrir tan temprano como durante el trabajo de generación de valores y puede pasar desapercibida durante el almacenamiento de las existencias a 4 ° C. Muchas levaduras y mohos prefieren temperaturas entre 20-30 ° C para un crecimiento óptimo y en realidad son inhibidas a 37 ° C, que es la temperatura de cultivo común para las células de mamíferos. Como la mayoría de los antibióticos que se utilizan en el cultivo celular no son eficaces contra organismos eucariotas como la levadura y el moho, y cultivo celular de insecto es Performe d en condiciones óptimas de crecimiento de estos gérmenes cuidado tiene que ser tomado en términos de manejo aséptico de las culturas. Además de sobrecrecimiento de células de insecto y la acidificación de los medios de comunicación, mohos y levaduras expresan muchas proteasas solubles y por lo tanto pueden degradar completamente proteínas recombinantes.
Un problema que se produce a veces es la precipitación en el tampón de elución. Esto raramente se ve y más o menos específico cepa (por ejemplo A/Vietnam/1203/04 H5 HA tiende a precipitar), pero se puede prevenir mediante intercambio rápida y completa tampón a PBS. No se recomienda el almacenamiento de proteínas en tampón de elución que contiene imidazol. El procedimiento de purificación de la cosecha a la congelación de las alícuotas a -80 ° C se debe realizar dentro de un día de trabajo y de almacenamiento de la proteína purificada a temperatura distinta de -80 ° C debe ser evitado. Además, los ciclos de congelación-descongelación se han demostrado tener un impacto negativo en la estabilidad de ciertos epítopos 1.
_content "> Los rendimientos se debe esperar a estar en el rango de 0,2 a 30 mg / L de la cultura. muchos se ha de expresar en el rango superior, mientras que las agencias nacionales tienden a expresar en los niveles inferiores. Además, los niveles de expresión de HA parece correlacionarse inversamente con el número de sitios de glicosilación ha hecho. desde H3N2 estacional humana H1N1 y estacional prepandémica aísla generalmente muestran bajos niveles de expresión, mientras que más ha de origen del virus de la gripe aviar tienen altos niveles de expresión. Mejorar la expresión se recomienda para aumentar la densidad de las células en el matraz o para tratar de usar menos o acciones más trabajando por la expresión. 10 veces mayor o disminución de la reserva de trabajo pueden tener un impacto positivo en los niveles de expresión. Otro factor que puede influir en los niveles de expresión es el tiempo entre la infección y la cosecha. 96 hr son ideales para la mayoría tiene y NAS, pero los tiempos de incubación más cortos en realidad podría incrementar los rendimientos de algunas proteínas.Las células de insectos son capaces de realizar las modificaciones posteriores a la traducción de una manera casi mamíferosN-manera similar y son capaces de plegar estructuras de proteínas muy complejas con eficiencias similares como células de mamífero (pero producir rendimientos más altos). En términos de la glicosilación, que exhiben un patrón que es ligeramente diferente de las células de mamíferos y cuenta sobre todo paucimannosidic N-glicanos que carecen de modificaciones de ácido siálico 19. Sin embargo, las líneas de células de insectos que han sido modificados para producir mamíferos como la glicosilación (incluyendo el ácido siálico terminal) están comercialmente disponibles 14.
El sistema de expresión de baculovirus es una herramienta extremadamente útil para la expresión de las glicoproteínas de la superficie de la gripe recombinantes - HA y NA. Estas proteínas recombinantes se utilizan para muchos ensayos inmunológicos y bioquímicos, así como para la normalización del contenido de antígeno de vacunas y como antígeno para experimentos de vacunación en modelos animales. Expresadas por baculovirus HA y NA exhiben función biológica completa y plegamiento correcto si se expresa en el marco con trimerizatien y dominios de tetramerización respectivamente. Esto los distingue de bacteriano expresado tiene esa son no glicosilada y carecen de epítopos funcionales en el dominio tallo. Además, las exposiciones del sistema de expresión de baculovirus rendimientos de proteína significativamente más altos que los sistemas de células de mamíferos 26 y la manipulación y ampliación de la escala son más fáciles. En resumen se describe un protocolo fácil y eficiente para expresar grandes cantidades de virus de la influenza recombinante HA y NA moléculas.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Nos gustaría dar las gracias a Patrick C. Wilson para CR9114 anticuerpo monoclonal. También agradecemos a Jennifer Debeauchamp y Richard Webby para los plásmidos originales A/Anhui/1/13. Soporte parcial para este trabajo fue proporcionado por el Instituto Nacional de Alergias y Enfermedades Infecciosas-financiado Proyecto Programa de Subvención AI097092-01A1 y CEIRS (Centros de Excelencia para la Investigación de la Influenza y Vigilancia, HHSN26620070010C). FK fue apoyado por una beca de Erwin Schrödinger (3232 J) del Fondo de Ciencias de Austria (FMF).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Bac-to-Bac Baculovirus expression system | Invitrogen | 10359-016 | Follow manufacturer's instructions |
| TNM-FH insect medium | Gemini Bioproducts | 600-311 | |
| HyClone SFX-Insect | Thermo Fisher | SH30278.02 | |
| Cellfectin II Reagent | Invitrogen | P/N58760 | |
| Pluronic F68 | Sigma | 1000702664 | |
| SimplyBlue SafeStain | Invitrogen | LC6060 | |
| Ni-NTA Agarose | Qiagen | 1018240 | |
| Amicon Ultra Centrigual filters Ultracel 30K | Millipore | UFC902024 | |
| Pen Strep | Gibco | 15140-122 | |
| Polypropylene Columns (5 ml) | Qiagen | 34964 | |
| Max efficiency DH10Bac bacteria | Invitrogen | 10361-012 | |
| PureLink HiPure Plasmid Filter Midiprep Kit | Invitrogen | K210015 | |
| Imidazole | Sigma-Aldrich | I2399-100G | for elution and wash buffers |
| Sf9 cells | ATCC | CRL-1711 | |
| High Five cells | Invitrogen | B85502 |
References
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