Summary
Hier beschreiben wir einen Weg, korrekt gefaltete und funktionelle Influenza-Virus-Oberflächenantigene von den neuen chinesischen H7N9-Virus in Insektenzellen abgeleitet auszudrücken. Die Technik lässt sich an beliebigen Ektodomänen viraler oder zellulärer Oberflächenproteine exprimieren.
Abstract
Das Baculovirus-Expressionssystem ist ein leistungsfähiges Werkzeug für die Expression von rekombinanten Proteinen. Hier verwenden wir es richtig gefaltet und glykosylierten Varianten des Influenza-A-Virus-Oberflächen Glykoproteinen produzieren - das Hämagglutinin (HA) und Neuraminidase (NA). Als Beispiel haben wir die HA-und NA-Proteinen durch das neuartige H7N9-Virus, das vor kurzem in China entstanden ausgedrückt. Jedoch kann das Protokoll leicht für HA-und NA-Proteine von einem anderen Influenza A-und B-Virus-Stämmen exprimiert angepasst werden. Rekombinante HA (rHA) und NA (RNA)-Proteine sind wichtige Reagenzien für immunologische Tests wie ELISA und ELISPOT und sind auch im breiten Einsatz für die Impfstoff-Standardisierung, Antikörper-Entdeckung, Isolierung und Charakterisierung. Darüber hinaus können rekombinante NA-Moleküle Bild für kleine Moleküle als Inhibitoren verwendet werden und sind nützlich für die Charakterisierung der enzymatischen Funktion der NA, sowie seiner Empfindlichkeit gegenüber antiviralen Mitteln. Rekombinanten HA-Proteine sind auch being getestet experimentelle Vakzine in Tiermodellen, und ein Impfstoff auf Basis von rekombinanten HA wurde kürzlich von der FDA zur Verwendung bei Menschen zugelassen. Die Methode, die wir hier beschreiben, diese Moleküle zu erzeugen ist einfach und kann die Forschung in Labors Influenza zu erleichtern, da es für die Produktion von großen Mengen von Proteinen schnell und zu geringen Kosten. Obwohl hier konzentrieren wir uns auf Influenza-Virus Oberflächen-Glycoproteine, kann diese Methode auch verwendet werden, um andere virale und zelluläre Oberflächenproteine zu produzieren.
Introduction
Als eine erste Reaktion auf die jüngste Aufkommen der neuen H7N9 Influenzavirusstamm in China, haben wir Plasmide die genomischen Sequenzen für Hämagglutinin (HA) und Neuraminidase (NA)-Gene der ersten zwei Isolate. Unter Verwendung dieser Plasmide waren wir in der Lage, schnell zu konstruieren Baculovirus-Expressionsvektoren zur Produktion von rekombinanten HA-und NA in Insektenzellen. Dieses Expressionssystem ist in unserem Labor etabliert und ist entscheidend für viele unserer laufenden Forschungsprojekte 8.1 bewiesen. Insektenzellen sind in der Lage, korrekt zu falten und post-translational komplexe Proteine ändern. Diese Modifikationen umfassen N-verknüpften Glykosylierung, die für viele virale Glykoproteine ist. Als solches ist es nicht verwunderlich, dass das Baculovirus-System exprimiert wird ganz für Influenzavirus-Oberflächenantigen hergestellt. In der Tat sind viele der HA-und NA-Kristallstrukturen unter Verwendung von Insektenzellen exprimierte Proteine 9-11 gelöst. Ein weiterer Vorteil derSystems liegt in seiner zuverlässigen hohen Protein-Ausbeuten von bis zu 30 mg HA / L Zellkultur (basierend auf unserer Erfahrung mit mehr als 50 verschiedene HA-Proteine) - eine Folge von Virus-Infektion Ausdruck angetrieben von der starken Polyhedrinpromotor.
Entfernung der Transmembran-und Endodomäne der HA-und NA-Proteine können für die Expression von sezernierbaren lösliche Versionen der Proteine und somit das Reinigungsverfahren erheblich vereinfacht. Darüber hinaus sind diese Ektodomäne Hexahistidin markiert und kann daher unter Verwendung von Affinitätschromatographie unter Verwendung von Ni 2 +-Harz gereinigt werden. Die Transmembrandomänen von HA und NA-Proteine tragen zu Homotrimer Homotetramer und Bildung auf. Um diese Oligomerisierungen bewahren, eine C-terminale Trimerisierungsdomäne fügen wir die HA-und ein N-terminales Tetramerisierungsdomäne zum NA konstruiert (Abb. 1). Wir haben eindeutig gezeigt, dass eine solche Trimerisierungsdomäne stabilisiert funktional, Folgenrved Konformationsepitope auf dem Halm-Domäne von HA 1. Die richtige Tetramerisierungsdomäne des NA könnte auch Falt-und NA-Funktion 10 zu korrigieren beitragen. Sequenzen und Baculo-Transfer-Vektoren, Trimerisierung oder Tetramerisierung Domains können von den Autoren oder von anderen Laboratorien auf dem Gebiet, 9,10,12 angefordert werden.
Eine weitere wichtige Frage für die Expression von sezernierten Proteinen in Insektenzellen ist die Auswahl der richtigen Zelllinie. Während Spodoptera frugiperda Sf9-Zellen abgeleitet unterstützen Baculovirus-Replikation sehr gut und werden im Allgemeinen für die Virusausbreitung und Rettungs verwendet, sie haben Kapazität, große Mengen an Protein zu sezernieren beschränkt. Trichoplusia ni gewonnen BTI-TN-5B1-4-Zellen (allgemein bekannt als High Five) eine höhere Kapazität und Sekretion sind die Zelllinie der Wahl, die für die Expression in diesem Protokoll 13,14. Darüber hinaus ist es hilfreich, zu reduzieren oder sogar beseitigen fötalem Rinderserum (FBS) von Expressionskulturen. Wir verwenden daher mit Medien reduziert (3%) FBS Inhalt für das Wachstum der Viren-Arbeits Aktien, und wir haben die Proteinexpression in Serum-freien Medien durchzuführen.
Rekombinanten HA-und NA-Proteine für viele immunologische Techniken verwendet. Vielleicht die häufigste ist in ELISA-Tests zur Messung der Serumkonversion bei der Impfung von Menschen oder Tieren 4,6,7,15. Aufweist und NA sind auch in ELISPOT Assays sowohl stimulierende Moleküle und Nachweisreagenzien für Antikörper sekretierende Zellen 16 verwendet. Ihre Verwendung als molekulare Köder ermöglicht, die speziell für Plasmablasten oder andere Arten von B-Zellen, die dann verwendet werden kann, um (therapeutische) monoklonalen Antikörpern (mAbs) zu isolieren, zu sortieren. Rekombinanten HA-und NA-Moleküle werden in der Charakterisierung dieser mAbs 8 verwendet. Weitere Beispiele sind die pH-Stabilität zu studieren oder Rezeptorspezifität wurde von anderen Virus-Isolate ausgedrückt, oder quantitativ Beurteilung spezifischer NA enzymatischeAktivität oder Resistenz gegenüber Inhibitoren. Außerdem rekombinante, gereinigte HA HA verwendet werden, um Inhalte von inaktivierten Influenza-Virus-Impfstoffen zu standardisieren.
Wichtig ist, rHA (und zu einem gewissen Grad NA)-Impfstoff-Kandidaten werden derzeit in Tiermodellen und klinischen Studien am Menschen mit einem Impfstoff von der FDA im Jahr 2013 zugelassen 2,17-19 getestet. Der Vorteil dieser neuartigen Impfstoffen ist, dass aufgrund der Natur der rekombinanten Proteine, die arbeitsintensive Prozess der Erzeugung von hohen Wachstums reassortanten Viren vermieden werden. Vielleicht noch relevant ist die Tatsache, dass ihre Ausbeute an HA hohe und reproduzierbare von Stamm zu Stamm. Da diese Impfstoffe in einer Eierfreien System hergestellt, sie enthalten keine Proteinverunreinigungen, die problematisch für Menschen mit Allergien Ei sind.
Hier haben wir uns für die HA-und NA-Proteine aus zwei Isolate des neuen chinesischen H7N9 Influenza-Virus A / Anh ausdrückenui/1/13 und A/Shanghai/1/13 20,21. Das sind zeitnahe Beispiele, aber die beschriebene Protokoll kann zur Expression Influenza A-und B-HA-oder NA-Proteine verwendet werden, und kann angepasst werden, um irgendwelche anderen sekretierten virale oder zelluläre Proteine zu exprimieren. Trimeres oder tetrameres Transmembranproteine können in die Expressionskassetten für HA und NA verwendet kloniert sind. Allerdings sind die meisten löslichen sekretierten zelluläre Proteine, wie Interferone, zum Beispiel nicht einen zusätzlichen Domänen zur Stabilisierung brauchen, und kann nur mit einem C-terminalen Hexahistidin-Tag ausgedrückt werden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Erzeugung von rekombinantem Baculovirus
- Die Klonierung in Baculovirus-Transfer-Plasmide
- Klon H7 HA und NA N9 Ektodomäne (oder jede andere HA oder NA-Gen) in modifizierte pFastBac Transferplasmide (siehe Einleitung). Vektoren für die HA mit einer C-terminalen Domäne und Trimerisierung einen Hexahistidin-Tag, wie auch für NA, das einen N-terminalen Tetramerisierungsdomäne und Hexahistidin-Tag, wurden beschrieben, 1,10,11,22 (Fig. 1) und können angefordert werden, die Autoren.
Erläuterung: HA Ektodomänen ausgedrückt ohne Trimerisierungsdomäne wird vor allem in den Stiel Domain falsch gefaltet werden, was zum Verlust von Konformationsänderungen neutralisierende Epitope. Ebenso stützt sich die NA enzymatische Funktion zur richtigen Tetramerisierungsdomäne. - Generierung von Bacmide
Transformation Baculovirus-Transfer-Plasmide, die HA-und NA-Gene in Bakterien gemäß DH10Bac Verwendung eines Baculovirus-ExpressionsSystem gemäß Anweisungen des Herstellers. Isolieren und zu reinigen Bacmide mit einem Midiprep Kit nach Herstellerangaben (Abbildung 2).
- Klon H7 HA und NA N9 Ektodomäne (oder jede andere HA oder NA-Gen) in modifizierte pFastBac Transferplasmide (siehe Einleitung). Vektoren für die HA mit einer C-terminalen Domäne und Trimerisierung einen Hexahistidin-Tag, wie auch für NA, das einen N-terminalen Tetramerisierungsdomäne und Hexahistidin-Tag, wurden beschrieben, 1,10,11,22 (Fig. 1) und können angefordert werden, die Autoren.
- Rettung der rekombinanten Baculovirus und Überprüfung der Proteinexpression
Erläuterung: Die folgenden Schritte müssen aseptisch in einer Sterildurchgeführt werden. Führen Sie dieses Verfahren unabhängig für HA und NA (oder jedes andere Gen von Interesse). Insektenzellen werden in der Regel bei 28 ° C ohne CO 2 gezüchtet. Sf9-Zellen für dieses Protokoll werden in voller TNM-FH Insektenzellmedium mit 10% FBS, 1% Pen-Strep * und 0,1% Pluronic F68-Lösung, ergänzt gewachsen, wenn nicht anders angegeben, agiert und 01.04 Uhr zweimal pro Woche. High Five-Zellen in Serum-freien Medien SFX gewachsen und agiert 01.15 Uhr zweimal pro Woche.
* Zusatz von Antibiotika sollte in der gesamten Protokoll als optional angesehen werden und entsprechend den in jedem Labor eingesetzt Praktiken angepasst.- Platte Sf9 Insektenzellen in 6-Well-Platten in einer Dichte von 2 x 10 5 Zellen / cm 2 und stehen lassen für 20 Minuten in einem 28 ° C-Inkubator (ohne CO 2).
- Mix 2 ug (konz. 0,5-2 ug / ul) von rekombinanter Bacmid mit 100 ul TNM-FH-Medium (serumfrei, 1% Pen-Strep). Mix 6 ul Transfektionsagens mit 100 ul TNM-FH-Medium (serumfrei, Pen-Strep). Kombinieren Sie die zwei Bände, vorsichtig mischen und lassen Sie sich für 20 Minuten bei Raumtemperatur (Transfektion Mischung). Fügen Sie ein Mock-Transfektion als Kontrolle (Abbildung 3).
- Überstand entfernen aus beschichtetem Sf9-Zellen (Zellen werden nun auf die Platte kleben) und ersetzen mit 2 ml Serum-freiem TNM-FH-Medium, das Pen-Strep (1%). Fügen Sie das komplette Volumen der Transfektion Mischung (aus Schritt 1.2.2) und rocken die 6-Well-Platte vorsichtig 5 Sekunden. Inkubieren in einem 28 ° C Inkubator ohne CO 2 für 6 h (Fig. 3).
- Ersetzen Medien with frisch TNM-FH-Medium (mit 10% FBS, 1% Pen-Strep und 0,1% Pluronic F68). Inkubation in einem 28 ° C-Inkubator ohne CO 2 für 6 Tage. Prüfen Sie gelegentlich Zellen unter dem Mikroskop. Infizierte Zellen in der Regel größer, runder erscheinen, haben Kerne vergrößert, und beginnen zu (Abbildung 4) zu lösen.
- Ernte der Zellen und die Bestätigung der Proteinexpression
- Erntezellen 6 Tage nach der Transfektion durch Zentrifugation bei 2.000 × g für 5 min bei Raumtemperatur. Der Überstand enthält das rekombinante Baculovirus - diese werden verwendet, um Arbeitsstamm direkt zu erzeugen, oder können bei 4 ° C über Jahre gelagert werden.
- Um die Proteinexpression überprüfen sammeln Pellets und resuspendieren in 500 ul PBS. Mischungs 50 ul der Suspension mit 50 ul SDS-PAGE-Ladepuffer (enthaltend ein Reduktionsmittel). SDS-PAGE laufen und führen eine Western Blot-Analyse mit einem anti-Hexa-Histidin-Antikörpers, um die Genexpression zu bestätigen. Fügen Zellen aus dem MockTransfektion als negative Kontrollen (Fig. 3).
- Herstellung der Arbeitsvorräte
- Platte 5 x 10 5 Sf9 Zellen / cm 2 in einem T175 cm 2-Kolben und lassen Sie sich für 20 Minuten damit sie in die Schale legen. Ersetzen vollständige TNM-FH-Medium mit TNM-FH-Medium mit 3% FBS (und 1% Pen-Strep, 0,1% Pluronic F68).
- Infizieren Zellen mit 100 &mgr; l des Überstands Rettungs. Inkubation in einem 28 ° C-Inkubator ohne CO 2 für 6 Tage und prüfen Sie gelegentlich, wenn die Zellen infiziert (wie in Schritt 1.2.5 beschrieben.).
- Spin bei 2.000 × g bei Raumtemperatur für 5 min und sammeln Stand. Das ist jetzt Ihre P2 Lager. Diese Aktie kann auf unbestimmte Zeit bei 4 ° C gelagert werden Wiederholen Sie den Vorgang mit der Infektion 100 ul des Aktien P2, Zellen zu infizieren. Die daraus resultierende Aktien heißt P3 oder Arbeits Lager, die bei 4 ° C gelagert oder direkt für die Proteinexpression verwendet werden kann. Die P3-Lager enthält in der Regel 10 <sup> 7 10 9 Plaque-bildende Einheiten / ml.
2. Protein Expression and Purification
Erläuterung: Sf9-Zellen unterstützen das Wachstum von Baculovirus sehr gut. Allerdings ist ihre Fähigkeit, große Mengen an rekombinantem Protein zu sezernieren begrenzt. Deshalb verwenden wir eine andere Insektenzelllinie, High Five-Zellen, die für die Expression der sekretierten rekombinanten Proteinen. Diese Zellen unterstützen keine Baculovirus-Replikation auf sehr hohe Titer 13, aber haben hohe sekretorischen Kapazität.
- Growing up High Five-Zellen
High Five-Zellen wachsen in SFX Insektenzellkulturmedium, in T175-cm 2-Kolben. Passage jeden zweiten Tag 01.03. Für eine 200 ml Expressionskultur müssen Sie 5 Flaschen konfluent wachsen. - Ernte und High Five-Zellen infizieren
- Nehmen High Five-Zellen von 5 T175 cm 2-Kolben, indem die Flaschen mit der Hand. Sammeln Sie die Zelle UntBrnsion und Transfer in 50 ml Zentrifugenröhrchen.
- Spin bei 1200 × g für 7 min bei Raumtemperatur. Überstand entfernen durch Dekantieren und vereinen die Pellets durch Resuspendieren in 15 ml P3 Lager.
- Lassen Sie sitzen für 15 Minuten in der Flow-Haube (Abbildung 5).
- Bringen Sie 200 ml Hyclone SFX Kulturmedium in einen sauberen, sterilen 1.000 ml Schüttelkolben (ohne buffles, mit Aluminiumfolie vor dem Autoklavieren verschlossen sind, müssen nicht für Bakterienkulturen verwendet haben).
- Übertragen Sie die P3/cell Suspension in den Schüttelkolben. Siegel mit steriler Aluminiumfolie und Transferkolben in einen Shaker. Schütteln bei 70 Umdrehungen pro Minute bei 28 ° C für 72-96 Std.
- Ernten rekombinanten Protein aus High Five Zellexpressionsüberständen
- 72-96 Stunden nach der Infektion Übertragung Kulturüberständen in 500 ml Zentrifugation Eimer. Spin bei 5.500 × g für 20 min bei 4 ° C. In der Zwischenzeit spülen Sie die Schüttelkolben 3x mit doppelt destilliertem Wasser(DdH 2 O).
- Übertragungs 3 ml Ni-Harz-Aufschlämmung in einen 50-ml-Röhrchen mit 45 ml PBS (man braucht pro 200 ml Kultur). Gut schütteln und drehen sich mit 3.000 × g bei Raumtemperatur für 10 min. Dekantiert die PBS und halten die Pellets. Mischen Sie die Insektenzellüberstand mit der Ni-Harz-Pellet und Überführung in den bereits gespült Schüttelkolben. Inkubation bei 4 ° C für 2-4 h unter Schütteln (Abbildung 6).
- Berg 10 ml Polypropylen-Säule auf einer Klemme auf einem Standfuß. Entfernen Sie die beiden Kappen und setzen Sie ein Becherglas unter der Spalte um den Fluss durch (Abfall) zu sammeln. Nehmen Sie die Schüttelkolben aus dem Shaker und beginnen, den Überstand / Schlammgemisch auf die Säule zu übertragen, es wird die Ni-Harz erhalten und nur der Überstand wird durch fließen. Geben über das gesamte Volumen der Säule (7).
- Mit 15 ml Waschpuffer (50 mM Na 2 HCO 3, 300 mM NaCl, 20 mM Imidazol, pH 8) Waschen des Harzes 4x. Lassen Sie alle Waschpuffer Ablaufaus der Spalte und schließen Sie es mit der Kappe (untere Seite).
- 2 ml Elutionspuffer (50 mM Na 2 HCO 3, 300 mM NaCl, 300 mM Imidazol, pH 8) und lassen Sie sich für 5 min. Öffnen Spalte und sammeln das Eluat. Wiederholen Sie diesen Vorgang 3 mal (mit insgesamt 8 ml Elutionspuffer). Eluat, die hohe Konzentrationen von Protein enthält, zeigt typischerweise Schaum beim Schütteln (Abbildung 7). Halten Eluat auf nassem Eis, wann immer möglich.
- Pufferaustausch und Konzentration
- Prespin 15 ml Ultrafiltrationseinheiten Zentrifugation bei 3.000 × g bei 4 ° C für 20 Minuten (30 kDa cut-off für HA / NA, kann aber je nach dem gereinigten Protein der Größe variieren) mit PBS (pH 7,4-7,6). Verwerfen und durch Last Eluat fließen auf die Spin-Säule. Füllen Sie 5 ml sterilem, eiskaltem PBS und Spin für 60 min bei 3000 × g bei 4 ° C
- Fördermenge durch wieder auffüllen mit 15 ml eiskaltem PBS und Spin für 60 min bei 3000 × g bei 4 ° C Wiederholen Sie diesen VerfahDure noch einmal.
- Nehmen Sie die Spin-Säule aus der Zentrifuge und sammeln den Puffer ausgetauscht Konzentrat (typischerweise 200 ul). Dies ist hoch konzentriert rekombinanten Proteins. Mit 400 ul sterilem eiskaltem PBS spülen Spin-Säule und fügen Sie diese dem Konzentrat. Halten Sie das Konzentrat auf Eis zu allen Zeiten.
3. Charakterisierung und Qualitätskontrolle
- Messung der Proteinkonzentration
Einen aliquoten des Konzentrats und messen, indem Sie Ihre Proteinquantifizierung Methode der Wahl. Eingestellt Proteinkonzentration auf 1 mg / ml durch Zugabe von PBS und gefrier kleinen Aliquoten bis -80 ° C Einfrieren und Auftauen schadet der Proteinstruktur und können, um die Aggregation führen. - SDS-PAGE und Coomassie-Färbung
Führen Sie 500 ng Ihres Proteins auf einem SDS-PAGE und Coomassie-Färbung durchführen. Für eine schnelle und bequeme Färbung verwenden Coomassie Reagenz in Kombination mit einer Mikrowelle Protokoll. HA-Proteine bei 64 erscheinen in der RegelkDa wohin NA Proteine sollten bei einer Größe von ca. 56 kDa (8A und B) durchgeführt. Mit dem beschriebenen Protokoll sollten Sie sehen keine Abbauprodukte. Wenn Abbau auftritt, ist es meist ein Zeichen von Hefe / Pilz-Kontamination während der Expression. In diesem Fall wiederholen Sie den Vorgang und stellen Sie sicher, alles steril zu halten. - Western-Blot / ELISA
Um die Protein Identität zu überprüfen empfehlen wir tun, um eine Western-Blot-oder ELISA-Test mit einem spezifischen Antikörper. Idealerweise werden ELISA-Tests mit einem Antikörper, der an konformationelle Epitope (z. B. Anti-HA-Antikörper Stiel 1) bindet, durchgeführt. Unter Verwendung eines solchen Antikörpers kann die korrekte Faltung des Proteins bestätigt (Fig. 8C). - Mess NA-Aktivität
Die korrekte Faltung des viralen NA kann auch durch Messen NA-Aktivität bestimmt werden. Wir empfehlen, diesen Test mit den im Handel erhältlichen NA * STAR-Assay (folgen Sie einfach den Benutzerrichtlinien) durchzuführen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
HA-Moleküle aus A/Shanghai/1/13 und A/Anhui/1/13 gut mit Ausbeuten von etwa 20 mg / l Kultur ausgedrückt. NA-Moleküle beider Stämme zeigte moderate Expressionsniveaus im Bereich von 0,2 mg / l Kultur A/Shanghai/1/13 bis 0,7 mg / l für A/Anhui/1/13. Alle vier Proteinpräparate hatten sehr wenig bis gar keine Verunreinigungen (8A und B) mit HAS wobei der höhere Reinheit als NA, die durch die Expressionsniveau erklärt werden kann. A/Shanghai/1/13 HA wurde weiter mittels ELISA mit dem breit neutralisierenden Stiel-reaktiven menschlichen mAb CR9114 23 analysiert. Dieser mAb bindet an ein Konformations-Epitop empfindlich im Stiel Domäne und als Sonde für die korrekte Faltung dieser Domäne verwendet. Der Antikörper zeigt eine gute Bindung, die Zuversicht, dass die HA ist in der Tat korrekt gefaltet (8C) gibt. Ein zweiter ELISA mit anti-Maus-polyklonalem Serum H7 wurde durchgeführt, um die Identität des erhaltenen Proteins als H7 Ursprungs bestätigen (8D).
Fig. 1 ist. Schema HA-und NA-Expressionskonstrukte. Das Expressionskonstrukt für die HA (A) ein N-terminales Signalpeptid, gefolgt von der HA-Ektodomäne, eine Thrombin-Spaltstelle, einer T4 Trimerisierungsdomäne und einem Hexahistidin-Tag. Der NA-Expressionskonstrukt (B) enthält einen N-terminalen Signalpeptid, gefolgt von einem Hexahistidin-Tag, ein Vasodilatator stimulierenden Phosphoprotein (VASP) Tetramerisierungsdomäne und dem NA-Ektodomäne. Klicken Sie hier, um eine größere Abbildung anzuzeigen .
Abbildung 2. Schema Bacmid generiereIonen (wie in Schritt 1.1.2 beschrieben). ein Baculovirus-Transfervektor, enthaltend HA und NA-Gene in transformierten Bakterien DH10Bac. Rekombination in das Baculovirus-Genom, die diese Bakterien tragen eine Weiß Kolonie Phänotyp auf Selektionsplatten. Eine weiße Kolonie aufgenommen und ausgestrichen. Eine einzelne Kolonie von der Platte ausgestrichen wird ein Midiprep Kultur zu beimpfen.
3. Schema des Baculovirus Rettungs-und Arbeits Lager Generation (wie in den Schritten 1.2.1-6). Rekombinante Bacmid und Transfektionsreagenz in Serum-freiem TNM-FH-Medium verdünnt. Die beiden Lösungen werden vereinigt, die Mischung wird für 20 min inkubiert und auf Sf9-Zellen transferiert dann. Sechs Stunden nach der Transfektion die Transfektion Medien ist durch vollständige TNM-FH-Medium ersetzt. Sechs Tage nach der Transfektion der Überstand geerntet und das Zellpellet ist analfür die Expression von rekombinanten Proteinen yzed.
4. Gesunden und infizierten Sf9-Zellen. Sf9-Zellen (A) und nicht-infizierte gesunde. Sie werden in die Kulturschale angebracht ist, teilweise aussehen polymorph und relativ klein. Zellen in (B) sind mit Baculovirus infizierten, losgelöst von der Kulturschale, sind groß und rund und haben Kerne vergrößert. Der Kern zeigt auch ein körniges Aussehen.
5. Die Infektion von High Five-Zellen mit rekombinanten Baculovirus (Arbeits Lager, wie in Schritt 2.2 beschrieben). Fünf konfluenten T175-Flaschen mit High Five-Zellen werden durch Zentrifugation bei niedriger Geschwindigkeit geerntet und mit 15 ml P3 Baculovirus Lager. Nach 15 min incubation die Zell / Virus-Gemisch wird in 1000 ml-Schüttelkolben mit 200 ml SFX Medium übertragen.
6. Ernte der Zellüberstand von 72 bis 96 Stunden nach der Infektion und Inkubation mit Ni-NTA-Harz (wie in Schritt 2.3 beschrieben). Infizierte Zellsuspensionen werden durch langsame Zentrifugation geerntet. Kulturüberstände werden mit PBS äquilibrierte Ni-Harz vermischt und für 2-4 h unter Schütteln inkubiert.
Abbildung 7. Reinigungsverfahren (wie in 2.3 und 2.4 beschrieben) und Qualitätskontrolle (wie in den Schritten 3.1.1-4 beschrieben). Nach Inkubation die gesamte Überstand / Harz-Mischung wird auf Polypropylensäulen geladen. Das Harz wird von den Säulen gehalten und dann viermal mit Wasch gewaschen buffer und das rekombinante Protein wird mit 8 ml Elutionspuffer in 2 ml Schritten aufgebracht eluiert. Das Eluat wird dann gegen Puffer und mit einer Ultrafiltrationsspinsäule konzentriert, aliquotiert und eingefroren. Qualitätskontrolltests umfassen SDS-PAGE, Western Blot, ELISA und Messung der Aktivität von rekombinantem NA NA.
Abbildung 8. Repräsentative Ergebnisse. HA (A) und NA (B) Proteine A/Anhui/1/13 und A/Shanghai/1/13 wurden mittels SDS-PAGE und Coomassie-Färbung analysiert. Strukturelle Integrität der HA A/Shanghai/1/13 wurde unter Verwendung des breit neutralisierenden menschlichen stängelreaktive Antikörper CR9114, die zu einer empfindlichen Konformationsepitop (C) bindet bewertet. Die Identität der gleichen HA wurde durch einen polyklonalen anti-H7 Mausserum (D) bestätigt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Obwohl die Expression von Influenzavirus HA-und NA-Proteinen in Insektenzellen unter Verwendung des Baculovirus-Expressionssystem ist in der Regel geradlinig, gibt es einige wichtige Punkte zu beachten. Es ist wichtig, wie in der Einleitung erwähnt, dass die Ektodomäne von HA und NA werden in Fusion mit Trimerisierung oder Tetramerisierung Domänen exprimiert sind. Diese Bereiche gewährleisten eine korrekte Faltung der Moleküle in der Regel von der Transmembran-Domäne, die nicht vorhanden ist, wenn nur die Ektodomäne exprimiert unterstützt. Zum Beispiel die Expression des HA-Ektodomäne ohne Trimerisierungsdomäne zu Oligomerisierung und Destabilisierung wichtig neutralisierende Epitope in Domäne 1 des Stiels. Ferner ist die Stabilität der Proteine verringert und Abbau durch Insektenzelle und Baculovirus Proteasen auftritt. Die Wahl der Trimerisierung oder Tetramerisierung Domäne ist weniger wichtig, eine Anzahl von ihnen von Leucin-Zipper-Domänen 22T4-Phagen Foldons 11 wurden bisher getestet und zeigten alle zufriedenstellende Ergebnisse. Es ist wichtig zu beachten, dass multibasischen Schnittstellen, wie sie in der hoch pathogenen H5N1 24 oder 25 H7N7-Isolate (aber nicht in H7N9) auftreten, müssen vor der Ausdruck entfernt werden, da sie durch Furin-ähnliche Proteasen, die zu allen Zeiten gegenwärtig sind gespalten die Baculovirusexpressionssystems 1,12.
Ein weiterer möglicher Grund für die abbau Produkte ist die Verunreinigung mit Hefe oder Schimmel. Dies kann bereits während der Arbeit stock Generation geschehen und kann unbemerkt während der Lagerung der Bestände bei 4 ° C gehen Viele Hefen und Schimmelpilze bevorzugen Temperaturen zwischen 20-30 ° C für optimales Wachstum und tatsächlich bei 37 ° C, die Temperatur für gemeinsame Kultur von Säugerzellen inhibiert. Da die meisten Antibiotika, die in der Zellkultur verwendet werden, sind nicht wirksam gegen eukaryotische Organismen wie Hefe und Schimmel und Insektenzellkultur ist performe d bei optimalen Wachstumsbedingungen dieser Keime zusätzliche Pflege muss in Bezug auf die Handhabung der Kulturen aseptisch entnommen werden. Zusätzlich zu überwuchern Insektenzellen und Versauerung Medien, Schimmelpilze und Hefen auszudrücken vielen löslichen Proteasen und kann somit komplett rekombinante Proteine abbauen.
Ein Problem, das manchmal auftritt, ist die Fällung im Elutionspuffer. Dies wird selten und mehr oder weniger spezifischen Belastung (zB A/Vietnam/1203/04 H5 HA neigt auszufallen) gesehen, kann aber durch schnelle und vollständige Pufferaustausch zu PBS verhindert werden. Lagerung von Proteinen in Imidazol enthaltenden Elutionspuffer wird nicht empfohlen. Das Reinigungsverfahren von der Ernte auf das Einfrieren von Aliquots bis -80 ° C sollte innerhalb eines Arbeitstages und die Lagerung von gereinigten Protein an anderen als -80 ° C Temperatur sollte vermieden werden, durchgeführt werden. Auch wiederholte Frost-Tau-Zyklen haben bewiesen, dass sich negativ auf die Stabilität bestimmter Epitope 1 auswirken.
_content "> Renditen erwartet werden sollte, um im Bereich von 0,2 bis 30 mg / L Kultur. Viele in den oberen Bereich auszudrücken, während NA neigen dazu, auf den unteren Ebenen zum Ausdruck bringen. Auch Expressionsniveaus für HAs scheinen umgekehrt proportional mit der Anzahl korrelieren von Glykosylierungsstellen. hat sich von menschlichen saisonalen H3N2 und H1N1-Isolate Saison Präpandemie zeigen in der Regel niedrige Expressionsniveaus, während die meisten HAs des Vogelgrippevirus Ursprung haben hohe Expressionsniveaus. Um die Expression zu verbessern, wird empfohlen, die Zelldichte in der Flasche erhöhen oder zu versuchen, sein, mit weniger oder mehr Arbeitsmaterial pro Ausdruck. 10fache Zunahme oder Abnahme des Arbeits Lager positiv auf die Expressionsniveaus auswirken können. Ein weiterer Faktor, der auf die Expressionsniveaus auswirken können, ist die Zeit zwischen der Infektion und der Ernte. 96 Stunden sind ideal für die meisten ist, und NA aber kürzere Inkubationszeiten könnte tatsächlich erhöhen die Renditen einiger Proteine.Insektenzellen sind in der Lage, posttranslationale Modifikationen in einem fast Säugetieren durchführenn artig und sind in der Lage, sehr komplexe Proteinstrukturen mit ähnlichen Wirkungsgrade Säugerzellen (aber höhere Erträge) falten. In Bezug auf die Glykosylierung, zeigen sie ein Muster, das etwas anders aus Säugerzellen ist und verfügt meist paucimannosidic N-Glykane, die Sialinsäure Änderungen 19 fehlt. Allerdings, Insektenzelllinien, die so modifiziert wurden, wie Säugetier-Glykosylierung (einschließlich Terminal Sialinsäure) produzieren sind im Handel erhältlich 14.
Das Baculovirus-Expressionssystem ist ein äußerst nützliches Werkzeug für die Expression von rekombinanten Glycoproteinen der Influenzaoberfläche - HA und NA. Diese rekombinanten Proteine werden für viele immunologische und biochemische Untersuchungen sowie für die Normung der Antigengehalt von Impfstoffen und als Antigen für die Impfung Experimente in Tiermodellen verwendet werden. Baculovirus-exprimierten HA und NA zeigen volle biologische Funktion und die korrekte Faltung, wenn im Rahmen mit trimerizati ausgedrücktauf und Tetramerisierungsdomäne Domänen sind. Dies unterscheidet sie von bakteriellen Ausdruck gebracht hat, die nicht-glykosylierte sind und es fehlt funktionale Epitope in der Stiel-Domäne. Weiterhin deutlich höhere Proteinausbeuten als Säugerzellsysteme 26 und Handhabung und Upscaling sind die Baculovirusexpressionssystems Exponate einfacher. Zusammenfassend beschreiben wir ein einfaches und effizientes Protokoll zur Expression großer Mengen von rekombinantem Influenzavirus-HA-und NA-Molekülen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Die Autoren haben nichts zu offenbaren.
Acknowledgments
Wir möchten Patrick C. Wilson für monoklonale Antikörper CR9114 danken. Wir danken auch Debeauchamp Jennifer und Richard Webby für die ursprünglichen A/Anhui/1/13 Plasmide. Teilweise Unterstützung für diese Arbeit wurde durch das Nationale Institut für Allergie-und Infektionskrankheiten vorgesehen finanzierte Programm Projektstipendium AI097092-01A1 und CEIRS (Centers of Excellence für Influenza-Forschung und Überwachung, HHSN26620070010C). FK wurde von einem Erwin-Schrödinger-Stipendium (J 3232) aus dem österreichischen Wissenschaftsfonds (FWF) unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Bac-to-Bac Baculovirus expression system | Invitrogen | 10359-016 | Follow manufacturer's instructions |
| TNM-FH insect medium | Gemini Bioproducts | 600-311 | |
| HyClone SFX-Insect | Thermo Fisher | SH30278.02 | |
| Cellfectin II Reagent | Invitrogen | P/N58760 | |
| Pluronic F68 | Sigma | 1000702664 | |
| SimplyBlue SafeStain | Invitrogen | LC6060 | |
| Ni-NTA Agarose | Qiagen | 1018240 | |
| Amicon Ultra Centrigual filters Ultracel 30K | Millipore | UFC902024 | |
| Pen Strep | Gibco | 15140-122 | |
| Polypropylene Columns (5 ml) | Qiagen | 34964 | |
| Max efficiency DH10Bac bacteria | Invitrogen | 10361-012 | |
| PureLink HiPure Plasmid Filter Midiprep Kit | Invitrogen | K210015 | |
| Imidazole | Sigma-Aldrich | I2399-100G | for elution and wash buffers |
| Sf9 cells | ATCC | CRL-1711 | |
| High Five cells | Invitrogen | B85502 |
References
- Krammer, F., et al. A carboxy-terminal trimerization domain stabilizes conformational epitopes on the stalk domain of soluble recombinant hemagglutinin substrates. PLoS One. 7, e43603 (2012).
- Krammer, F., Pica, N., Hai, R., Margine, I., Palese, P. Chimeric hemagglutinin influenza virus vaccine constructs elicit broadly-protective stalk-specific antibodies. J. Virol. , (2013).
- Leyva-Grado, V. H., Mubareka, S., Krammer, F., Cárdenas, W. B. Influenza virus infection in Guinea pigs raised as livestock, ecuador. Emerg. Infect. Dis. 18, 1135-1138 (2012).
- Margine, I., et al. H3N2 influenza virus infection induces broadly reactive hemagglutinin stalk antibodies in humans and mice. J. Virol. , (2013).
- Miller, M. S., et al. 1976 and 2009 H1N1 Influenza Virus Vaccines Boost Anti-Hemagglutinin Stalk Antibodies in Humans. J. Infect. Dis. 652, (1976).
- Pica, N., et al. Hemagglutinin stalk antibodies elicited by the 2009 pandemic influenza virus as a mechanism for the extinction of seasonal H1N1 viruses. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, 2573-2578 (2012).
- Sangster, M. Y., et al. The B cell response and hemagglutinin stalk-reactive antibody production in different age cohorts following 2009 H1N1 influenza vaccination. Clin. Vaccine Immunol. , (2013).
- Tan, G. S., et al. A pan-h1 anti-hemagglutinin monoclonal antibody with potent broad-spectrum efficacy in vivo. J. Virol. 86, 6179-6188 (2012).
- Ekiert, D. C., et al. Antibody recognition of a highly conserved influenza virus epitope. Science. 324, 246-251 (2009).
- Xu, X., Zhu, X., Dwek, R. A., Stevens, J., Wilson, I. A. Structural characterization of the 1918 influenza virus H1N1 neuraminidase. J. Virol. 82, 10493-10501 (2008).
- Stevens, J., et al. Structure of the uncleaved human H1 hemagglutinin from the extinct 1918 influenza virus. Science. 303, 1866-1870 (2004).
- Wei, C. J., et al. Comparative efficacy of neutralizing antibodies elicited by recombinant hemagglutinin proteins from avian H5N1 influenza virus. J. Virol. 82, 6200-6208 (2008).
- Krammer, F., et al. Trichoplusia ni cells (High Five) are highly efficient for the production of influenza A virus-like particles: a comparison of two insect cell lines as production platforms for influenza vaccines. Mol. Biotechnol. 45, 226-234 (2010).
- Palmberger, D., et al. Insect cells for antibody production: evaluation of an efficient alternative. J. Biotechnol. 153, 160-166 (2011).
- Santiago, F. W., Lambert Emo, K., Fitzgerald, T., Treanor, J. J., Topham, D. J. Antigenic and immunogenic properties of recombinant hemagglutinin proteins from H1N1 A/Brisbane/59/07 and B/Florida/04/06 when produced in various protein expression systems. Vaccine. 30, 4606-4616 (2012).
- Wrammert, J., et al. Broadly cross-reactive antibodies dominate the human B cell response against 2009 pandemic H1N1 influenza virus infection. J. Exp. Med. 208, 181-193 (2011).
- Treanor, J. J., et al. Protective efficacy of a trivalent recombinant hemagglutinin protein vaccine (FluBlok) against influenza in healthy adults: a randomized, placebo-controlled trial. Vaccine. 29, 7733-7739 (2011).
- Dalakouras, T., Smith, B., Platis, D., Cox, M., Labrou, N. Development of recombinant protein-based influenza vaccine. Expression and affinity purification of H1N1 influenza virus neuraminidase. J. Chromatogr. A. 1136, 48-56 (2006).
- Krammer, F., Grabherr, R. Alternative influenza vaccines made by insect cells. Trends Mol. Med. 16, 313-320 (2010).
- Gao, R., et al. Human Infection with a Novel Avian-Origin Influenza A (H7N9) Virus. N. Engl. J. Med. , (2013).
- Goff, P. H., et al. Induction of cross-reactive antibodies to novel H7N9 influenza virus by recombinant Newcastle disease virus expressing a North American lineage H7 subtype hemagglutinin. J. Virol. , (2013).
- Weldon, W. C., et al. Enhanced immunogenicity of stabilized trimeric soluble influenza hemagglutinin. PLoS One. 5, (2010).
- Dreyfus, C., et al. Highly conserved protective epitopes on influenza B viruses. Science. 337, 1343-1348 (2012).
- Steel, J., et al. Live attenuated influenza viruses containing NS1 truncations as vaccine candidates against H5N1 highly pathogenic avian influenza. J. Virol. 83, 1742-1753 (2009).
- Fouchier, R. A., et al. Avian influenza A virus (H7N7) associated with human conjunctivitis and a fatal case of acute respiratory distress syndrome. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 1356-1361 (2004).
- Kost, T., Condreay, J., Jarvis, D. Baculovirus as versatile vectors for protein expression in insect and mammalian cells. Nat. Biotechnol. 23, 567-575 (2005).
