Summary
Burada böcek hücrelerinde yeni Çin H7N9 virüsünden türetilen doğru katlanmış ve işlevsel bir influenza virüsü yüzey antijenlerini eksprese etmek için bir yol tarif eder. Bu teknik, bir viral veya hücre yüzey proteinlerinin ektoalanlarının ifade etmek için uyarlanabilir.
Abstract
Bakulovirüs sentezleme sistemi, rekombinant proteinlerin ifadesi için güçlü bir araçtır. Hemagglutinin (HA) ve nöraminidaz (NA) - Burada grip doğru katlanmış ve glikosile edilmiş versiyonları A virüsü yüzey glikoproteinleri üretmek için kullanır. Örnek olarak, son zamanlarda Çin'de ortaya çıkan yeni H7N9 virüsü tarafından ifade HA ve NA proteinleri seçti. Ancak Protokol kolayca başka bir influenza A ve B virüs türleri tarafından ifade edilen HA ve NA proteinler için uyarlanabilir. Yeniden birleştirici HA (rHA) ve NA (RNA) proteinleri, ELISPOT ve ELISA gibi immünolojik tahliller için önemli olan reaktif maddeler ve aşı standardizasyon, antikor keşfi, izolasyonu ve karakterizasyonu için yaygın olarak kullanılan da vardır. Bundan başka, rekombinant NA moleküllerinin, küçük molekül inhibitörleri için taranması için kullanılabilir ve NA enzimatik fonksiyonunun karakterizasyonu yanı sıra antiviral için duyarlılığı için yararlıdır edilebilir. Yeniden birleştirici HA proteinleri de vardır being hayvan modellerinde deneysel aşı olarak test edilmiş ve yeniden birleştirici HA göre bir aşı son zamanlarda, insanlarda kullanım için FDA tarafından lisanslı oldu. Hızlı ve düşük maliyetle proteinleri büyük miktarlarda üretimi sağlar beri bu molekülleri üretmek için burada açıklamak yöntemi, yalındır ve grip laboratuarlarında araştırma kolaylaştırabilir. İnfluenza virüsü yüzey glikoproteinler odak burada da, bu yöntem, aynı zamanda, diğer viral ve hücre yüzeyi proteinleri üretmek için kullanılabilir.
Introduction
Çin yeni H7N9 influenza virüsü suşunun yakın zamanda ortaya çıkmasına bir ilk tepki olarak, hemagglutinin (HA) ve nöraminidaz (NA) ilk iki izolatın genlerinin genomik sekansları taşıyan plazmid aldı. Hızlı bir şekilde böcek hücrelerinde rekombinant HA ve NA üretimi için bakuloviral ifade vektörlerini oluşturmak için mümkün olan bu plazmidler kullanılarak. Bu ifade sistem iyi laboratuvarımızda kurulan ve devam eden araştırma projeleri 1-8 birçok önemli kanıtlanmıştır. Böcek hücreleri doğru katlayın ve çeviri sonrası kompleks proteinleri değiştirmek edebiliyoruz. Bu modifikasyonlar, pek çok viral glikoproteinler için önemli olan N-bağlı glikosilasyon içerir. Bu nedenle, bu bakulovirüs sistemi oldukça influenza virüsü yüzey antijenlerini eksprese etmek için kurulmuş olduğu şaşırtıcı değildir. Aslında, HA ve NA kristal yapılarının birçok böcek hücresi ifade edilen proteinler, 9-11 kullanılarak çözüldü. Diğer bir avantajıGüçlü polihedrin promoterinden virüs enfeksiyonu sürülen ifadesinin sonucu - sistemi (50'den fazla farklı HA proteinleri ile deneyime dayalı) HA / L hücre kültürü kadar 30 mg onun güvenilir, yüksek protein verimi yatıyor.
HA ve NA proteinlerin transmembran ve endodomain çıkarılması proteinlerin salgılanabilir, çözünür versiyonları ekspresyonu sağlar ve böylece büyük ölçüde saflaştırma işlemini kolaylaştırır. Ayrıca, bu ektodomenleridir hekzahistidin etiketlenir ve bu nedenle Ni 2 +-reçinesi kullanılarak afinite kromatografisi kullanılarak saflaştırılabilir. HA ve NA proteinlerin transmembran domainleri, ayrı ayrı, homotrimer ve homotetramer oluşumu katkıda bulunur. Bu oligomerizations korumak amacıyla, HA-ve NA için bir N-terminal tetramerizasyon alan (Şekil 1) oluşturur, bir C-terminal alanı trimerleştirme ekleyin. Biz böyle bir trimerleştirme alanı işlev, sırayla nu stabilize olduğunu kesin olarak göstermiştirHA 1 sap-etki şekilsel epitoplarını SVEd. NA doğru tetramerizasyon katlanma ve NA fonksiyonu 10 düzeltmek için katkıda bulunabilir. Trimerleştirme veya tetramerizasyon etki barındıran Diziler ve bakulo transfer vektörleri yazarların ya da alanında, 9,10,12 diğer laboratuarlardan talep edilebilir.
Böcek hücrelerinde salgılanan proteinlerin ifadesi için diğer bir önemli konu, doğru hücre çizgisinin bir seçimdir. Spodoptera frugiperda Sf9 hücreleri, bakulovirüs çok iyi kopyalanmasını desteklemek ve genellikle virüs kurtarma ve yayılması için kullanılan türetilmiş olmakla birlikte, yüksek miktarda protein salgılaması için kısıtlı bir kapasiteye sahiptir. Trichoplusia ni (genellikle High Five olarak da bilinir) BTI-TN-5B1-4 hücrelerini türetilmiş Daha yüksek bir salgılama kapasitesine sahiptir ve bu protokol 13,14 ekspresyon için tercih edilen bir hücre çizgisidir. Bundan başka, cenin sığır serumu azaltmak ve hatta ortadan kaldırmak için yararlı olan (FBSentezleme kültürlerinden S). Bu nedenle çalışma stokları, virüs büyümesi için indirgenmiş (% 3) FBS içerikli ortamını kullanın, ve serum içermeyen medya içinde protein ekspresyonu gerçekleştirir.
Yeniden birleştirici HA ve NA proteinleri birçok immünolojik teknikler kullanılmaktadır. Belki de en yaygın olanı, insanlarda veya hayvanlarda 4,6,7,15 aşılama üzerine serum dönüşüm ölçülmesi için ELISA deneyleri bulunmaktadır. Ve UA'lar aynı zamanda, antikor salgılayan hücreler 16 için uyarıcı moleküllerin ve saptama reaktifleri olarak hem ELISPOT analizlerinde kullanılır. Moleküler yemler olarak kullanılması özellikle plazmablastlar ya da daha sonra (terapötik) monoklonal antikorların (mAb 'ler) izole etmek için kullanılabilir B-hücrelerinin diğer türleri için sıralamak sağlar. Yeniden birleştirici HA ve NA molekülleri ayrıca bu mAb'lerin 8 karakterizasyonunda kullanılır. Diğer örnekler pH stabilitesini veya reseptör özelliklerini farklı virüs izolatları tarafından dile gelmiştir, ya da kantitatif değerlendirilmesi belirli NA enzimatik çalışma bulunmaktadırinhibitörleri ile faaliyet veya direnç. Bundan başka, rekombinant, arıtılmış, HA hareketsizleştirilmiş grip aşılarının HA içeriği standardize etmek için kullanılabilir.
Önemlisi, rHA (ve belli bir dereceye kadar NA) aşı adayları şu anda bir aşı adayı 2013 2,17-19 yılında FDA tarafından lisanslı olması ile hayvan modellerinde ve insan klinik deneylerle test ediliyor. Bu yeni aşıların avantajı, bu proteinlerin rekombinant doğası gereği, yüksek büyüme reassortant virüs üretme emek yoğun bir işlemi önlenebilir, yani. Belki daha uygun kendi HA verimi yüksek ve gerginlik gerginlik tekrarlanabilir olduğu gerçektir. Bu aşılar bir yumurta serbest sistemi üretilmektedir beri Ayrıca, onlar yumurta alerjisi olan bireyler için sorunlu olan protein kirletici içermez.
Burada yeni Çin H7N9 influenza virüsü, A / Anh iki izolatlardan HA ve NA proteinleri ifade seçtiui/1/13 ve A/Shanghai/1/13 20,21. Bu zamanında örnekler, ancak tarif edilen protokol bir influenza A ve B HA veya NA proteinlerin ifadesi için kullanılabilir ve herhangi bir başka salgılanmış viral veya hücresel proteinleri ifade etmek için uyarlanabilir. Trimerik, tetramerik ya da zar proteinleri, sırasıyla HA ve NA için kullanılan ekspresyon kasetleri içerisine klonlanabilir. Ancak, çoğu çözünür salgılanmış hücresel proteinler, örneğin interferonlar gibi, stabilizasyon için ek bir etki gerek yoktur ve bir C-ucu heksahistidin etiketi ile sadece ifade edilebilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1.. Rekombinant Bakulovirüsün Üretimi
- Bakulovirüs transfer-plasmidler içine klonlanması
- Klon H7 HA ve modifiye edilmiş plazmid aktarma pFastBac içine N9 NA ekto-saha (veya başka bir HA ya da NA geni) (giriş bölümüne bakınız). HA, bir N-terminal domain ve tetramerizasyon hekzahistidin etiketi ihtiva eden bir C-terminal domain ve bir trimerleştirme hekzahistidin etiketi ihtiva eden, hem de NA için vektörler, (Şekil 1) 1,10,11,22 tarif edilmiş ve talep edilebilir yazarlar.
Açıklayıcı Not: trimerleştirme etki olmadan ifade HA ektodomenleridir özellikle sap etki, uygun nötralize epitoplardan kaybına yol açan, yanlış katlanmış olacak. Benzer şekilde, NA enzimatik fonksiyonu uygun bir tetramerizasyon dayanır. - Bacmid Üretimi
Bir bakulovirüs ifadesi kullanarak göre DH10Bac bakteri içine HA ve NA genlerini içeren bakulovirüs transfer plasmidlerini Dönüşümü, üretici talimatlarına göre sistem. Izole edin ve üreticinin talimatlarına (Şekil 2) uygun bir kit kullanılarak Midiprep bakmitler arındırmak.
- Klon H7 HA ve modifiye edilmiş plazmid aktarma pFastBac içine N9 NA ekto-saha (veya başka bir HA ya da NA geni) (giriş bölümüne bakınız). HA, bir N-terminal domain ve tetramerizasyon hekzahistidin etiketi ihtiva eden bir C-terminal domain ve bir trimerleştirme hekzahistidin etiketi ihtiva eden, hem de NA için vektörler, (Şekil 1) 1,10,11,22 tarif edilmiş ve talep edilebilir yazarlar.
- Protein ekspresyonunun rekombinan bakulovirüs ve doğrulama Kurtarma
Açıklayıcı Not: Aşağıdaki adımlar, bir laminer akış kaputu aseptik yapılması gerekir. HA ve NA (veya ilgi herhangi bir başka gen) bağımsız bu yordamı gerçekleştirin. Böcek hücreleri genellikle CO 2 olmadan 28 ° C'de yetiştirilir. Bu protokol için Sf9 hücreleri, aksi belirtilmedikçe,% 10 FBS,% 1 Pen-Strep ve% 0.1 * Pluronic F68 çözeltisi ile takviye edilmiş TNM-FH tam böcek hücre ortamında yetiştirilen ve haftada iki kez 01:04 pasajlanır. High Five hücreleri SFX serumsuz ortam içinde büyümüş ve haftada iki kez 01:15 pasajlanır.
* Antibiyotiklerin eklenmesi protokol boyunca isteğe bağlı olarak kabul edilir ve her bir laboratuarda kullanılan uygulamalara göre ayarlanmalıdır.- / Cm 2 2 x 10 5 hücre yoğunluğunda 6 oyuklu plakalar içerisinde Sf9 böcek hücreleri Plate ve (CO 2 olmadan) 28 ° C kuluçka makinesi içinde 20 dakika boyunca bekletin.
- Karışım 2 ug TNM-FH ortamı (serumsuz,% 1 Pen-Strep) içinde 100 ul ile yeniden birleştirici bakmit bölgesinin (kons. 0.5-2 ug / ul). TNM-FH ortamı (serumsuz, Pen-Strep) içinde 100 ul transfeksiyon ajanı 6 ul karıştırın. , Iki cilt birleştirin, yavaşça karıştırın ve oda sıcaklığında (transfeksiyon karışımı), 20 dakika boyunca bekletin. Kontrol olarak bir mock-transfeksiyonunu (Şekil 3) içerir.
- (Hücreler artık plaka sopa) ve Pen-strep (% 1) içeren serumsuz TNM-FH ortamı 2 ml ile değiştirin kaplama Sf9 hücrelerinden süpernatantı. (Aşama 1.2.2) transfeksiyon karışımı tam hacmi ilave edin ve 5 saniye için dikkatli bir şekilde 6-çukurlu plaka sallayın. 6 saat (Şekil 3) için CO 2 olmayan bir 28 ° C kuluçka makinesi içinde inkübe edin.
- Medya wi değiştirinth taze tam TNM-FH ortamı (% 10 FBS,% 1 Pen-Strep ve% 0.1 Pluronic F68 ihtiva eden). 6 gün için CO 2 olmayan bir 28 ° C kuluçka makinesi içinde inkübe edin. Bir mikroskop altında bazen hücreleri kontrol ediniz. Enfekte hücreler genellikle, yuvarlak, büyük görünür çekirdek genişlemiş olması, ve (Şekil 4) ayırmak başlar.
- Hücre ve protein ekspresyonu teyit hasat
- Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 2000 x g'de santrifüj ile hasat hücreleri 6 gün sonra transfeksiyon. Süpernatan, rekombinant bakulovirüs içerir - bu hemen çalışma stokları elde etmek için kullanılabilir, ya da yıl boyunca 4 ° C'de saklanabilir.
- Protein ifadesini kontrol etmek için 500 ul PBS içinde tekrar süspansiyon ve pelet toplamak. (Indirgeyici bir ajan içeren) SDS-PAGE yükleme tamponu 50 ul süspansiyon 50 ul karıştırın. SDS-PAGE çalıştırın ve gen ifadesini teyit etmek için, bir anti-hekzahistidin antikoru ile Western leke analizi. Mock hücreleri dahilNegatif kontrol olarak transfeksiyon (Şekil 3).
- Çalışma stoklarının hazırlanması
- Levha 5 x 10 5 Sf9 hücre / a T175 cm 2 şişeye cm 2 ve 20 dk onlara çanak takmak için izin bekletin. TNM-FH ortamı 3% FBS (ve% 1 Pen-strep,% 0.1 Pluronic F68) içeren tam bir TNM-FH ortamı değiştirin.
- Kurtarma süpernatan 100 ul hücre, Infect. 6 gün boyunca CO 2 olmadan 28 ° C inkübatör ve hücreleri enfekte olsun bazen kontrol edin (adım 1.2.5 açıklandığı gibi.).
- 5 dakika boyunca oda sıcaklığında 2000 x g'de Spin ve supernatant toplamak. Bu artık P2 stok. Bu stok 4 ° C'de süresiz olarak saklanabilir Hücreleri enfekte etmek için P2 stokunun 100 ul ile enfeksiyon prosedürü tekrarlayın. Elde edilen stok P3 ya da 4 ° C'de saklandı veya protein ekspresyonu için direkt olarak kullanılabilir çalışma stok olarak adlandırılır. P3 stok genellikle 10 içeriyor <sup> 7 -10 9 plak oluşturan ünite / ml oluşturulması.
2. Protein Expression and Purification
Açıklayıcı Not: Sf9 hücreleri çok iyi baculovirus'un büyümesini desteklemek. Bununla birlikte, yeniden birleştirici proteinin büyük miktarlarda salgılama kapasitesi sınırlıdır. Bu nedenle, salgılanmış rekombinant proteinlerin ifadesi için bir böcek hücre hattı, High Five hücreleri kullanır. Bu hücreler çok yüksek titreleri 13 baculovirus çoğaltılmasını desteklemek ancak yüksek salgı kapasitesi yok.
- High Five hücreleri büyüyor
T175 cm2 şişelerde SFX böcek hücre kültürü ortamı içinde High Five hücreleri büyütün. Passage her gün 01:03. 200 ml ifade kültür için, 5 konfluan şişeleri büyümeye ihtiyacımız olacak. - High Five hücreleri hasat ve enfekte
- Elinizle şişeler dokunarak 5 T175 cm 2 matara High Five hücreleri ayırın. Hücre süspansiyon haline toplamaknsion ve 50 ml santrifüj tüplerine aktarılır.
- Oda sıcaklığında 7 dakika boyunca 1200 x g'de dönerler. Süzülerek süpernatantı ve P3 stokunun 15 ml bunları yeniden süspanse ile granül birleştirmek.
- (Şekil 5) akış başlığı içinde, 15 dakika boyunca bekletin.
- Temiz, steril 1000 ml'lik bir çalkalama şişesi içine Hyclone SFX kültür ortamının 200 ml aktarın (otoklavlamadan önce alüminyum folyo ile sızdırmaz Buffles olmadan önce bakteri kültürleri için kullanılmış olmamalıdır).
- Çalkalayıcı balona P3/cell süspansiyonu aktarın. Bir karıştırıcı içine steril alüminyum folyo ve transfer şişesi ile kapatılmalıdır. 72-96 saat boyunca 28 ° C'de 70 rpm'de çalkalanır.
- High Five hücre ifade süpernatanlarından yeniden birleştirici protein Hasat
- 500 ml santrifüj kova içine 72-96 saat sonrası enfeksiyon transferi kültürü yüzerler. 4 ° C'de 20 dakika boyunca 5500 x g'de Spin Bu sırada çalkalama şişeleri, iki kez damıtılmış su ile 3 kez yıkayın(GKD 2 O).
- PBS (bir 200 ml kültür başına gerekli olan) 45 ml bir 50 ml tüp içine aktarın 3 ml Ni-reçine bulamacı. İyice çalkalayın ve 10 dakika oda sıcaklığında 3.000 xg'de dönerler. PBS Durusu ve pelet tutun. Ni-reçine pelet ile böcek hücresi süpernatant karıştırın ve daha önce çalkalandı çalkalama şişeleri içine aktarın. (Şekil 6) çalkalandı, 2-4 saat boyunca 4 ° C'de inkübe edin.
- Bir sopalı bir kelepçe Mount 10 ml polipropilen sütun. Hem kapaklarını çıkarın ve (atık) aracılığıyla akışını toplamak için sütunun altında bir beher yerleştirin. Çalkalayıcı dışarı çalkalama şişesi al ve bu kolona süpernatan / çamur karışımı aktarmak başlar, bu Ni-reçine korumak ve süpernatanının akacaktır. Sütun üzerinde, tüm birimi (Şekil 7) geçmektedir.
- Yıkama tamponu, 15 ml (50 mM Na HCO3 2, 300 mM NaCl, 20 mM imidazol, pH 8) ile reçinenin 4x yıkayın. Tüm yıkama tamponu kurutalımKolondan ve kapağın (alt yan) ile kapatın.
- Elüsyon tamponu 2 ml (50 mM Na HCO3 2, 300 mM NaCl, 300 mM imidazol, pH 8) ilave edin ve 5 dakika boyunca bekletin. Sütunu açın ve eluatın toplamak. (Elüsyon tamponu 8 ml toplam), bu 3 kez daha tekrarlayın. (Şekil 7) çalkalandığında proteini yüksek konsantrasyonlarını içeren Yıkama sıvısı, tipik olarak köpük gösterir. Mümkün Islak buz üzerinde eluatın tutun.
- Tampon değişimi ve konsantrasyon
- Prespin 15 ml santrifüj, ultrafiltrasyon birimi 20 dakika boyunca 4 ° C'de 3000 x g'de, PBS (pH 7.4-7.6) ile (HA / NA 30 kDa kesme ancak saflaştırılmış protein boyutuna bağlı olarak değişebilir). Spin kolona yoluyla ve yük Eluat akış atın. 4 ° C'de 5 steril, buz gibi soğuk PBS ml ve 3.000 x g'de 60 dakika boyunca bir dönüş ile doldurun
- Tekrar yoluyla boşaltım akış, 15, buz gibi soğuk PBS eklenir ve 4 ° C'de 3000 x g'de 60 dakika boyunca bir dönüş ile doldurun Bu prosedürü tekrarlayınbir kez daha Duré.
- Santrifüj dışarı spin kolon almak ve tampon alışverişinde konsantre (tipik olarak 200 ul) toplamak. Bu son derece rekombinant protein konsantre edilir. Steril, buz gibi soğuk PBS ile 400 ul spin kolon durulayın ve bu konsantre, bu ekleyin. Her zaman buz üzerinde konsantre edin.
3. Karakterizasyonu ve Kalite Kontrol
- Protein konsantrasyonunun ölçülmesi
Konsantresinin bir kısım almak ve seçtiğiniz protein ölçümü yöntemini kullanarak ölçeriz. PBS eklenerek 1 mg / ml protein konsantrasyonu getirin ve -80 ° C'ye kadar az miktar dondurma Donma çözülme döngüleri protein yapısına zarar ve toplama yol açabilir. - SDS-PAGE ve Coomassie boyama
SDS-PAGE üzerinde protein 500 ng çalıştırın ve Comassie lekelenme gerçekleştirin. Hızlı ve kolay bir boyama için bir mikro dalga protokolü ile kombine Coomassie reaktif kullanın. HA proteinler genellikle 64 görünürkDa NA proteinleri etrafında 56 kDa (Şekil 8A ve B) bir boyutu çalışmalıdır oysa. Açıklanan protokolünü kullanarak herhangi bir bozunma ürünleri görmek gerekir. Bozulma meydana gelirse, genellikle ifade sırasında maya / mantar bulaşma bir işaretidir. Bu durumda prosedürü tekrarlayın ve steril her şeyi tutmak için emin olun. - Western blot / ELISA
Protein kimliğini doğrulamak için biz belirli bir antikor ile bir Western Blot veya ELISA deneyi yapmak öneririz. İdeal olarak, ELISA deneyleri, konformasyonel epitopları (örneğin anti-HA antikor sapı 1) bağlanan bir antikor ile gerçekleştirilir. Bu tür bir antikor kullanılarak proteinin doğru katlanır (Şekil 8C) teyit edilebilir. - Etkinlik NA Ölçme
Viral NA doğru katlanması da NA aktivitesi ölçülerek belirlenebilir. Biz piyasada mevcut NA * YILDIZ deneyi (sadece kullanıcı yönergeleri izleyin) kullanarak bu testi yapılmasını önermekteyiz.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
A/Shanghai/1/13 ve A/Anhui/1/13 HA molekülleri, yaklaşık 20 mg / L kültür verimleri ile de ifade edilmiştir. Her iki soylarının NA molekülleri A/Shanghai/1/13 için 0.2 mg / L kültür A/Anhui/1/13 için 0.7 mg / L arasında değişen orta derecede ifade seviyeleri göstermiştir. Dört protein preparatları ekspresyon seviyesi ile açıklanabilir UA daha yüksek saflıkta olmak vardır ile (Şekil 8A ve B) herhangi bir yabancı madde için çok az vardı. A/Shanghai/1/13 HA daha geniş biçimde nötralize sap reaktif insan mAb CR9114 23 ile ELISA kullanılarak analiz edilmiştir. Bu mAb sap alanında hassas bir konformasyonel epitopa bağlanan ve bu etki doğru katlanması için bir prob olarak kullanılmıştır. Antikor gerçekten HA (Şekil 8C) doğru katlanır güven veren iyi bağlanma sergiler. Anti-H7 fare poliklonal serum ile ikinci bir ELISA (H7 kaynaklı olarak elde proteininin kimliğini teyit etmek için gerçekleştirildiŞekil 8D).
Şekil 1. HA ve NA sentezleme konstruktlarının şematik. Bu ifade, HA (A) HA dış bölgenin, bir trombin parçalanma sitesi, T4 trimerleştirme etki alanı ve bir heksahistidin etiketi ve ardından bir N-terminali sinyal peptidi içerir için yapılırlar. NA ifadesi yapısı (B) bir heksahistidin etiketi, bir vazodilatör uyarıcı fosfoprotein (VASP'ını) tetramerizasyon etki ve NA dış bölgenin ardından bir N-terminal sinyal peptit içeriyor. büyük rakam görmek için buraya tıklayın .
Şekil 2,. Bacmid generat şemasıiyon (adım 1.1.2 'de tarif edildiği gibi). HA veya NA genlerini içeren bir bakulovirüs transfer vektörü DH10Bac bakterilerin içine transforme edilir. Bu bakteriler bakulovirüs genomuna rekombinasyon seçme plakaları üzerinde beyaz fenotipi koloni üretir. Bir beyaz koloni aldı ve yeniden çıkartılmış edilir. Yeniden çıkartılmış plakadan tek bir koloni, bir midiprep kültürü aşılamak için kullanılır.
Şekil 3,. Bakulovirüs kurtarma ve çalışma stok nesil Şema (adımlarda açıklandığı gibi 1.2.1-6). Rekombinan bacmid ve transfeksiyon reaktifi serumsuz TNM-FH ortamı içinde seyreltilir. Bu iki solüsyon bir araya getirilmiş, karışım 20 dakika boyunca inkübe edilir ve daha sonra Sf9 hücrelerinin üzerine transfer edilmiştir. Altı saat sonrası transfeksiyon transfeksiyon medya tam TNM-FH medya tarafından değiştirilir. Altı gün süpernatan hasat transfeksiyondan ve hücre topağı analRekombinant proteinlerin ekspresyonu için yzed.
Şekil 4. (A) 'de sağlıklı ve enfekte edilmiş Sf9 hücreleri. Sf9 hücreleri sağlıklı olan ve olmayan bulunmaktadır. Bunlar kısmen polimorfik ve nispeten küçük bir görünüm, kültür kaplarına eklenir. (B) Hücreler, bakulovirus ile enfekte kültürü çanak müstakil, büyük ve yuvarlak olup çekirdekleri büyüttük edilir. Çekirdek aynı zamanda, bir zerre şekilli bir görünüm gösterir.
Şekil 5,. (Adım 2.2 'de tarif edildiği gibi, çalışma stok). High Five hücreleri ile beş birbirine bağlı T175 şişeler düşük hızlı santrifüjleme ile hasat edilmiş ve P3 bakulovirüs stoklar 15 ml ile birleştirilir yeniden birleştirici bakülovirüs High Five hücre enfeksiyonu. Içinde 15 dakika sonrahücre / virüs karışımı SFX ortam 200 ml ile 1000 ml çalkalama şişelerine aktarılır cubation.
Şekil 6,. Ni-NTA reçinesi (aşama 2.3 'de tarif edildiği gibi) ile hücre yüzer 72-96 saat sonrası enfeksiyon ve inkübasyon Hasat. Enfekte hücre süspansiyonları, düşük hızlı santrifüjleme ile hasat edilir. Kültür süpernatanları PBS-dengelenmiş Ni-reçinesi ile karıştırılır ve çalkalanarak 2-4 saat süre ile inkübe edilir.
Şekil 7. Saflaştırma prosedürü (2.3 ve 2.4 'de tarif edildiği gibi) ve kalite kontrol (3.1.1-4 adımda tarif edildiği gibi). Kuluçkadan sonra süpernatan / reçine kanşımının her polipropilen sütun üzerine yüklenir. Reçine sütun tarafından tutulur ve daha sonra yıkama tampon tamponundan ile dört kez yıkandıfer ve rekombinant protein 2 mi adımda uygulanan elüsyon tamponu 8 ml ile yıkanır. Eluat sonra tampon değiştirilir ve bir ultrafiltrasyon spin kolon ile konsantre edildi, parçalara ayrılmış ve dondurulmaktadır. Kalite kontrol deneyleri, SDS-PAGE, Western Blot, ELISA ve rekombinant NA NA aktivitesinin ölçümü içerir.
Şekil 8,. A/Anhui/1/13 ve A/Shanghai/1/13 temsil edici sonuçları. HA (A) ve NA (B) proteinler SDS-PAGE ve Coomassie boyama ile analiz edilmiştir. A/Shanghai/1/13 en HA yapısal bütünlüğü hassas bir konformasyon epitopunun (C) bağlanan genel olarak nötralize edici insan sap reaktif antikor CR9114 kullanılarak değerlendirildi. Aynı HA kimliği, poliklonal anti-H7 fare serumu (D) ile teyit edilmiştir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bakulovirüs ekspresyon sistemi kullanılarak böcek hücrelerinde influenza virüsü HA ve NA proteinlerin ekspresyonu yalındır genel olarak da, dikkate birkaç önemli nokta vardır. Girişte işaret gibi HA ve NA ektodomenleridir sırasıyla trimerleştirme veya tetramerizasyon etki ile füzyon ifade edilir ki, önemlidir. Bu etki genellikle sadece ekto ifade edilir ise mevcut değildir transmembran alanı tarafından desteklenir moleküllerin doğru katlanmasını sağlar. Örneğin, bir trimerleştirme etki olmadan HA dış bölgenin ifade oligomerizasyonu ve sap alanı 1 'de önemli bir nötrleştirici epitoplarının kararsız hale gelmelerine neden olmaktadır. Ayrıca, proteinlerin stabilitesi azalma ve böcek hücreleri ve bakulovirüs proteazlar tarafından bozulma gerçekleşir. Trimerleştirme veya tetramerizasyon etki seçimi daha az önemlidir, değişen bunların sayısı lösin zipper domenlerinin 22T4 faj foldons 11 kadar test edilmiştir ve tüm tatmin edici sonuçlar ortaya koydu. Bu multibasic bölünme siteleri de yüksek patojenik H5N1 24 veya H7N7 25 izolatın (ama H7N9 olarak) meydana gibi onlar her zaman mevcut proteazlar gibi furin tarafından parçalanan beri ifade önce kaldırılması gerektiğini akılda tutmak önemlidir bakulovirüs sentezleme sistemi 1,12.
Degradasyonal ürünler için olası bir diğer nedeni maya veya küf kirliliğidir. Bu kadar erken döneminde çalışma stok nesil olarak ortaya çıkabilir ve 4 ° C'de stoklarının depolanması sırasında fark gidebilirsiniz Pek çok maya ve küf optimum büyüme 20-30 ° C arasında sıcaklıklar tercih aslında Memeli hücreleri için ortak kültür sıcaklığı olan 37 ° C de bloke edilmiştir. Hücre kültüründe kullanılan çoğu antibiyotik maya ve küf, ve böcek hücre kültürü gibi ökaryotik organizmalara karşı etkili olmadığı için, performe olduğu ekstra bakım kültürlerin aseptik olarak kullanım açısından alınması gereken, bu mikropların optimal gelişim koşulları d. Böcek hücreleri overgrowing ve asitleyici yanı sıra medya, küfler ve mayalar çok çözünür proteazlar ifade ve bu nedenle tamamen rekombinant proteinleri düşürebilir.
Bazen ortaya çıkan bir sorun, yıkama tampon maddesi içinde çökelmesidir. Bu nadir ve daha fazla veya daha az spesifik soyu (örneğin, A/Vietnam/1203/04 H5 HA çökelme eğilimi) görülür, ancak PBS hızlı ve tam tampon değişimi ile önlenebilir. Imidazol-ihtiva-eden yıkama tamponu içinde proteinlerin depolama tavsiye edilmez. -80 ° C'ye alikotların donma hasattan saflaştırma işlemi, -80 ° C'de başka bir sıcaklıkta saflaştırılmış proteinin bir çalışma günü ve depolama kaçınılmalıdır içinde yapılmalıdır. Ayrıca, tekrarlanan donma-çözülme döngüleri belli epitoplara 1 istikrarı üzerinde olumsuz etkisi kanıtlanmıştır.
_content "> Verim 0,2-30 mg / L kültür aralığında olması beklenmelidir. UA'lar düşük düzeylerde ifade etme eğilimindedir Birçok üst bölgesindeki ifade yer alır. Ayrıca için ekspresyon düzeyleri sayısı ile ters orantılı görülmemiştir HAs glikozilleme siteleri. HAS insan mevsimsel H3N2 ve mevsimsel H1N1 pandemik en yüksek ekspresyon seviyelerine sahip kuş gribi virüsü kökenli sahipken genellikle, düşük ekspresyon düzeylerini göstermek ayırır. ifadesini artırmak için bu şişede hücre yoğunluğunu artırmak için ya da denemek için tavsiye edilir daha az kullanmak veya ifade başına daha fazla çalışma stok. 10. kat artış veya çalışma stokunun azalması ekspresyon seviyeleri üzerinde olumlu etkileyebilir. ekspresyon düzeyleri üzerinde etkili olabilecek bir başka faktör enfeksiyonu ve hasat arasındaki zaman. 96 saat çoğu vardır ve için idealdir UA'lar ama kısa inkübasyon süreleri aslında bazı proteinlerin verimi artırmak olabilir.Böcek hücreleri neredeyse memelilerinde öteleme sonrası modifikasyonları gerçekleştirmek mümkünn-benzeri bir şekilde ve memeli hücreleri (ama daha yüksek verim üreten) gibi benzer verimlilik ile çok karmaşık protein yapıları kat edebiliyoruz. Glikosilasyon açısından, memeli hücrelerinden biraz farklıdır ve sialik asit modifikasyonları 19 eksikliği çok paucimannosidic N-glikanları özellikleri bir desen sergiler. Bununla birlikte, (terminal siyalik asit de dahil olmak üzere), memeli-benzeri glikosilasyon üretmek üzere modifiye edilmiş böcek hücre çizgileri 14, ticari olarak mevcuttur.
HA ve NA - bakulovirüs sentezleme sistemi, rekombinant influenza yüzey glikoproteinler sentezlenmesi için son derece faydalı bir araçtır. Bu bir araya getiren proteinler, bir çok imünolojik ve biyokimyasal deneyler için, hem de antijen aşılar içeriği standartlaştırılması için ve hayvan modellerinde aşılama deneyleri için antijen olarak kullanılır. Trimerizati ile çerçeve içinde eksprese edilmesi halinde HA ve NA tam bir biyolojik işlev ve doğru katlanmasını gösteren baculovirüs tanımlısırasıyla ve tetramerizasyon etki. Bu onları ayıran bakteriyel glikosillenmemiş ve sap etki fonksiyonel epitopları eksikliği HAS dile getirdi. Ayrıca, bakulovirüs ekspresyon sistemi sergiler memeli hücre sistemleri 26 ve taşıma ve yükseltme önemli ölçüde daha yüksek protein verimleri daha kolaydır. Özet olarak, rekombinant influenza virüsü HA ve NA moleküllerin büyük miktarlarda ifade etmek için kolay ve etkin bir protokol açıklar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.
Acknowledgments
Biz monoklonal antikor CR9114 Patrick C. Wilson teşekkür etmek istiyorum. Biz de orijinal A/Anhui/1/13 plazmidlerinin Jennifer Debeauchamp ve Richard Webby teşekkür ederim. Bu iş için kısmi destek Alerji Ulusal Enstitüsü tarafından sağlanan ve Bulaşıcı Programı Proje Hibe AI097092-01A1 ve CEIRS (Grip Araştırma ve Gözetim için Mükemmeliyet Merkezleri, HHSN26620070010C) Hastalıkları-finanse edildi. FK Avusturya Bilim Fonu'nun (FWF) bir Erwin Schrödinger'in bursu (J 3232) tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Bac-to-Bac Baculovirus expression system | Invitrogen | 10359-016 | Follow manufacturer's instructions |
| TNM-FH insect medium | Gemini Bioproducts | 600-311 | |
| HyClone SFX-Insect | Thermo Fisher | SH30278.02 | |
| Cellfectin II Reagent | Invitrogen | P/N58760 | |
| Pluronic F68 | Sigma | 1000702664 | |
| SimplyBlue SafeStain | Invitrogen | LC6060 | |
| Ni-NTA Agarose | Qiagen | 1018240 | |
| Amicon Ultra Centrigual filters Ultracel 30K | Millipore | UFC902024 | |
| Pen Strep | Gibco | 15140-122 | |
| Polypropylene Columns (5 ml) | Qiagen | 34964 | |
| Max efficiency DH10Bac bacteria | Invitrogen | 10361-012 | |
| PureLink HiPure Plasmid Filter Midiprep Kit | Invitrogen | K210015 | |
| Imidazole | Sigma-Aldrich | I2399-100G | for elution and wash buffers |
| Sf9 cells | ATCC | CRL-1711 | |
| High Five cells | Invitrogen | B85502 |
References
- Krammer, F., et al. A carboxy-terminal trimerization domain stabilizes conformational epitopes on the stalk domain of soluble recombinant hemagglutinin substrates. PLoS One. 7, e43603 (2012).
- Krammer, F., Pica, N., Hai, R., Margine, I., Palese, P. Chimeric hemagglutinin influenza virus vaccine constructs elicit broadly-protective stalk-specific antibodies. J. Virol. , (2013).
- Leyva-Grado, V. H., Mubareka, S., Krammer, F., Cárdenas, W. B. Influenza virus infection in Guinea pigs raised as livestock, ecuador. Emerg. Infect. Dis. 18, 1135-1138 (2012).
- Margine, I., et al. H3N2 influenza virus infection induces broadly reactive hemagglutinin stalk antibodies in humans and mice. J. Virol. , (2013).
- Miller, M. S., et al. 1976 and 2009 H1N1 Influenza Virus Vaccines Boost Anti-Hemagglutinin Stalk Antibodies in Humans. J. Infect. Dis. 652, (1976).
- Pica, N., et al. Hemagglutinin stalk antibodies elicited by the 2009 pandemic influenza virus as a mechanism for the extinction of seasonal H1N1 viruses. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, 2573-2578 (2012).
- Sangster, M. Y., et al. The B cell response and hemagglutinin stalk-reactive antibody production in different age cohorts following 2009 H1N1 influenza vaccination. Clin. Vaccine Immunol. , (2013).
- Tan, G. S., et al. A pan-h1 anti-hemagglutinin monoclonal antibody with potent broad-spectrum efficacy in vivo. J. Virol. 86, 6179-6188 (2012).
- Ekiert, D. C., et al. Antibody recognition of a highly conserved influenza virus epitope. Science. 324, 246-251 (2009).
- Xu, X., Zhu, X., Dwek, R. A., Stevens, J., Wilson, I. A. Structural characterization of the 1918 influenza virus H1N1 neuraminidase. J. Virol. 82, 10493-10501 (2008).
- Stevens, J., et al. Structure of the uncleaved human H1 hemagglutinin from the extinct 1918 influenza virus. Science. 303, 1866-1870 (2004).
- Wei, C. J., et al. Comparative efficacy of neutralizing antibodies elicited by recombinant hemagglutinin proteins from avian H5N1 influenza virus. J. Virol. 82, 6200-6208 (2008).
- Krammer, F., et al. Trichoplusia ni cells (High Five) are highly efficient for the production of influenza A virus-like particles: a comparison of two insect cell lines as production platforms for influenza vaccines. Mol. Biotechnol. 45, 226-234 (2010).
- Palmberger, D., et al. Insect cells for antibody production: evaluation of an efficient alternative. J. Biotechnol. 153, 160-166 (2011).
- Santiago, F. W., Lambert Emo, K., Fitzgerald, T., Treanor, J. J., Topham, D. J. Antigenic and immunogenic properties of recombinant hemagglutinin proteins from H1N1 A/Brisbane/59/07 and B/Florida/04/06 when produced in various protein expression systems. Vaccine. 30, 4606-4616 (2012).
- Wrammert, J., et al. Broadly cross-reactive antibodies dominate the human B cell response against 2009 pandemic H1N1 influenza virus infection. J. Exp. Med. 208, 181-193 (2011).
- Treanor, J. J., et al. Protective efficacy of a trivalent recombinant hemagglutinin protein vaccine (FluBlok) against influenza in healthy adults: a randomized, placebo-controlled trial. Vaccine. 29, 7733-7739 (2011).
- Dalakouras, T., Smith, B., Platis, D., Cox, M., Labrou, N. Development of recombinant protein-based influenza vaccine. Expression and affinity purification of H1N1 influenza virus neuraminidase. J. Chromatogr. A. 1136, 48-56 (2006).
- Krammer, F., Grabherr, R. Alternative influenza vaccines made by insect cells. Trends Mol. Med. 16, 313-320 (2010).
- Gao, R., et al. Human Infection with a Novel Avian-Origin Influenza A (H7N9) Virus. N. Engl. J. Med. , (2013).
- Goff, P. H., et al. Induction of cross-reactive antibodies to novel H7N9 influenza virus by recombinant Newcastle disease virus expressing a North American lineage H7 subtype hemagglutinin. J. Virol. , (2013).
- Weldon, W. C., et al. Enhanced immunogenicity of stabilized trimeric soluble influenza hemagglutinin. PLoS One. 5, (2010).
- Dreyfus, C., et al. Highly conserved protective epitopes on influenza B viruses. Science. 337, 1343-1348 (2012).
- Steel, J., et al. Live attenuated influenza viruses containing NS1 truncations as vaccine candidates against H5N1 highly pathogenic avian influenza. J. Virol. 83, 1742-1753 (2009).
- Fouchier, R. A., et al. Avian influenza A virus (H7N7) associated with human conjunctivitis and a fatal case of acute respiratory distress syndrome. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 1356-1361 (2004).
- Kost, T., Condreay, J., Jarvis, D. Baculovirus as versatile vectors for protein expression in insect and mammalian cells. Nat. Biotechnol. 23, 567-575 (2005).
