Summary
Hier beschrijven we een manier om correct gevouwen en functionele oppervlak influenzavirus-antigenen afgeleid van de nieuwe Chinese H7N9 virus in insectencellen uiten. De techniek kan worden aangepast aan ectodomeinen van elke virale of cellulaire oppervlakte-eiwitten tot expressie.
Abstract
Het baculovirus expressiesysteem is een krachtig hulpmiddel voor expressie van recombinante eiwitten. Hier gebruiken we het om correct gevouwen en geglycosyleerd versies van het influenza A-virus oppervlakte glycoproteïnen produceren - het hemagglutinine (HA) en neuraminidase (NA). Als voorbeeld, we kozen voor de HA en NA eiwitten door het nieuwe H7N9 virus dat onlangs naar voren gekomen in China uitgedrukt. Maar het protocol kan gemakkelijk worden aangepast voor HA en NA eiwitten op andere influenza A en B virusstammen uitgedrukt. Recombinant HA (rHA) en NA (RNA) eiwitten zijn belangrijke reagentia voor immunologische testen zoals ELISPOT en ELISA, en zijn ook veel gebruikt voor vaccin standaardisatie, antilichaam ontdekking, isolatie en karakterisering. Bovendien kunnen recombinante NA moleculen worden gebruikt om te screenen op kleine moleculen remmers en zijn nuttig voor het karakteriseren van de enzymatische functie van de NA, en de gevoeligheid voor antivirale middelen. Recombinante HA-eiwitten zijn ook being getest experimentele vaccins in diermodellen, en een vaccin op basis van recombinant HA werd onlangs erkend door de FDA voor gebruik bij mensen. Werkwijze beschrijven we hier om de moleculen is eenvoudig en kan onderzoek naar influenza-laboratoria, aangezien het voor de productie van grote hoeveelheden eiwitten snel en tegen lage kosten. Hoewel hier richten we ons op influenzavirus oppervlakte glycoproteïnen kan deze werkwijze ook worden gebruikt om andere virale en cellulaire oppervlakte-eiwitten.
Introduction
Als eerste reactie op de recente opkomst van nieuwe H7N9 influenza-virusstam in China, verwierven wij plasmiden die de genomische sequenties voor de hemagglutinine (HA) en neuraminidase (NA) genen van de eerste twee isolaten. Met deze plasmiden konden we snel bouwen baculovirus expressievectoren voor de productie van recombinant HA en NA in insectencellen. Deze uitdrukking systeem goed is ingeburgerd in ons laboratorium en is van cruciaal belang voor veel van onze lopende onderzoeksprojecten 1-8 bewezen. Insect cellen in staat zijn te kunnen vouwen en post-translationeel complexe eiwitten te wijzigen. Deze modificaties omvatten N-gebonden glycosylering, wat belangrijk is voor veel virale glycoproteïnen. Als zodanig is het niet verwonderlijk dat de baculovirussysteem vrij is opgericht voor het uiten van influenzavirus oppervlakte-antigenen. In feite zijn veel van de HA en NA kristalstructuren zijn opgelost middels insectencel tot expressie gebrachte eiwitten 9-11. Een ander voordeel van desysteem is de betrouwbare eiwitrijk opbrengsten van maximaal 30 mg HA / L cellen (gebaseerd op onze ervaring met meer dan 50 verschillende eiwitten HA) - gevolg van virus-infectie aangedreven expressie van de sterke polyhedrine promoter.
Verwijdering van het transmembraan en endodomein van het HA en NA eiwitten maakt expressie van uit te scheiden, oplosbare versies van de eiwitten en daarmee aanzienlijk vergemakkelijkt het zuiveringsproces. Bovendien zijn deze ectodomeinen hexahistidine gelabeld en derhalve worden gezuiverd middels affiniteitschromatografie met Ni2 +-hars. De transmembraandomeinen van HA en NA eiwitten dragen respectievelijk homotrimeer en homotetrameer formatie. Om deze oligomerisaties behouden, voegen we een C-terminaal domein trimerisatie de HA-en een N-terminale tetramerisatie domein aan de NA constructen (figuur 1). We hebben onomstotelijk aangetoond dat een dergelijke trimerisatie domein stabiliseert functionele, gevolgenGraco behoudt conformationele epitopen op de stengel-domein van de HA 1. De juiste tetramerisatie van de NA kan ook bijdragen aan vouwen en NA functie 10 corrigeren. Sequenties en baculo-overdracht vectoren herbergen trimerisatie of tetramerisatie domeinen kunnen worden opgevraagd bij de auteurs of van andere laboratoria in het veld, 9,10,12.
Een ander belangrijk punt voor expressie van uitgescheiden eiwitten in insectencellen is de keuze van de juiste cellijn. Terwijl Spodopterafrugiperda afgeleid Sf9 cellen ondersteunen baculovirus replicatie heel goed en worden meestal gebruikt voor virus rescue en vermeerdering, hebben zij beperkte capaciteit om grote hoeveelheden eiwit uitscheiden. Trichoplusia ni afgeleid BTI-TN-5B1-4 cellen (algemeen bekend als High Five) hebben een hogere uitscheiding capaciteit en zijn de cellijn van de keuze voor expressie in dit protocol 13,14. Voorts is het nuttig te verminderen of zelfs te verwijderen foetaal runderserum (FBS) van expressie culturen. We gebruiken ook media met verminderde (3%) FBS inhoud voor het kweken van het virus werkvoorraden en voeren we de eiwitexpressie in serumvrij medium.
Recombinant HA en NA eiwitten worden gebruikt voor vele immunologische technieken. Misschien is de meest voorkomende is in ELISA-testen voor het meten van serum conversie na vaccinatie bij mensen of dieren 4,6,7,15. Heeft en NA worden ook gebruikt in ELISPOT testen zowel stimulerende moleculen en detectie reagentia voor antilichamen uitscheidende cellen 16. Het gebruik als moleculaire lokaas kan specifiek sorteren voor plasmablasten of andere soorten B-cellen die vervolgens kunnen worden gebruikt om (therapeutische) monoklonale antilichamen (mAbs) te isoleren. Recombinant HA en NA moleculen worden verder gebruikt voor de karakterisatie van deze mAbs 8. Andere voorbeelden zijn de studie van de pH-stabiliteit of receptor specificiteit van HAS door verschillende virus isolaten vertoonden, of kwantitatief beoordelen van specifieke NA enzymatischeactiviteit of resistentie tegen remmers. Verder recombinant gezuiverd HA kan worden om HA-gehalte van geïnactiveerd influenzavirus vaccin standaardiseren.
Belangrijk, rHA (en tot op zekere hoogte NA) kandidaat-vaccins worden momenteel getest in diermodellen en klinische proeven op mensen met een kandidaat-vaccin wordt in licentie gegeven door de FDA in 2013 2,17-19. Het voordeel van deze nieuwe vaccins is dat door de recombinante aard van deze eiwitten, het arbeidsintensieve proces van produceren van hoge groei reassortante virussen kunnen worden vermeden. Misschien nog belangrijker is het feit dat de HA rendement is hoog en reproduceerbaar van stam tot stam. Ook, omdat deze vaccins worden geproduceerd in een ei-vrij systeem, ze niet eiwitverontreinigingen die problematisch zijn voor mensen met een ei-allergie bevatten.
Hier kozen we voor de HA en NA eiwitten tot expressie van twee isolaten van de nieuwe Chinese H7N9 griepvirus, A / Anhui/1/13 en A/Shanghai/1/13 20,21. Dit zijn geschikte voorbeelden, maar de beschreven protocol kan worden toegepast voor expressie van een influenza A en B HA en NA eiwitten en kunnen worden aangepast aan andere uitgescheiden virale of cellulaire eiwitten tot expressie. Trimere of tetramere transmembraan eiwitten kunnen worden gekloneerd in de expressiecassettes voor HA en NA, respectievelijk. Echter, de meeste oplosbare uitgescheiden cellulaire eiwitten, zoals interferonen bijvoorbeeld geen extra domein voor stabilisatie nodig en kan alleen worden uitgedrukt met een C-terminale hexahistidine tag.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Generatie van recombinant Baculovirus
- Klonering in baculovirus transfer-plasmiden
- Clone H7 HA en N9 NA ectodomain (of een andere HA of NA-gen) in aangepaste pFastBac overdracht plasmiden (zie inleiding). Vectoren voor HA bevattende een C-terminale domein trimerisatie en een hexahistidine tag, en voor NA die een N-terminale tetramerisatie domein en hexahistidine tag, beschreven 1,10,11,22 (figuur 1) en kan worden opgevraagd de auteurs.
Toelichting: HA ectodomeinen uitgedrukt zonder trimerisatie domein onjuist gevouwen, wat leidt tot verlies van conformationele neutraliserende epitopen, met name in de stengel domein. Ook de NA enzymatische werking te goede tetramerisatie. - Generatie bacmiden
Transformeren baculovirus transfer-plasmiden die HA en NA genen in DH10Bac bacteriën volgens met behulp van een baculovirusexpressiesysteemsysteem volgens de instructies van de fabrikant. Isoleren en zuiveren bacmiden met een Midiprep kit volgens instructies van de fabrikant (figuur 2).
- Clone H7 HA en N9 NA ectodomain (of een andere HA of NA-gen) in aangepaste pFastBac overdracht plasmiden (zie inleiding). Vectoren voor HA bevattende een C-terminale domein trimerisatie en een hexahistidine tag, en voor NA die een N-terminale tetramerisatie domein en hexahistidine tag, beschreven 1,10,11,22 (figuur 1) en kan worden opgevraagd de auteurs.
- Redding van recombinant baculovirus en verificatie van eiwitexpressie
Toelichting: De volgende stappen moeten aseptisch worden uitgevoerd in een laminaire stroming kap. Voer deze procedure zelfstandig voor HA en NA (of een ander gen van belang). Insectencellen zijn meestal gekweekt bij 28 ° C zonder CO2. Sf9 cellen voor dit protocol worden gekweekt in volledig TNM-FH insectencellen medium aangevuld met 10% FBS, 1% Pen-Strep * en 0,1% Pluronic F68 oplossing, tenzij anders vermeld, en gepasseerd 1:04 twee keer per week. High Five cellen worden gekweekt in serumvrij medium SFX en gepasseerd 1:15 twee keer per week.
* Toevoeging van antibiotica moet facultatief worden beschouwd als de gehele protocol en aangepast aan de gebruikte materialen in elk laboratorium praktijken.- Plate Sf9 insectencellen in 6-well platen bij een dichtheid van 2 x 10 5 cellen / cm 2 en laat zitten voor 20 min in een 28 ° C incubator (zonder CO2).
- Meng 2 pg (geconcentreerd 0,5-2 ug / ul) van recombinant bacmide met 100 ul van TNM-FH-medium (serum vrij, 1% Pen-Strep). Meng 6 pl transfectiemiddel met 100 ul van TNM-FH-medium (serum vrij, Pen-Strep). Combineer de twee volumes, meng voorzichtig en laat zitten voor 20 minuten bij kamertemperatuur (transfectie mengsel). Omvatten een mock-transfectie als controle (figuur 3).
- Verwijder supernatant van uitgeplaat Sf9-cellen (cellen nu handhaven op de plaat) en vervangen door 2 ml serumvrij TNM-FH-medium bevattende Pen-Strep (1%). Voeg de volledige omvang van de transfectie-mengsel (van stap 1.2.2) en rock de 6-wells plaat zorgvuldig 5 sec. Incubeer in een 28 ° C incubator zonder CO2 gedurende 6 uur (Figuur 3).
- Vervang media with vers volledig TNM-FH media (met 10% FBS, 1% Pen-Strep en 0,1% Pluronic F68). Incubeer in een 28 ° C incubator zonder CO 2 voor 6 dagen. Controleer cellen af en toe onder een microscoop. Geïnfecteerde cellen verschijnen meestal groter, ronder zijn kernen vergroot en gaan (figuur 4) los.
- Oogst van cellen en bevestiging van eiwit expressie
- Oogst cellen 6 dagen na transfectie door centrifugatie bij 2000 g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur geroerd. Het supernatant bevat het recombinant baculovirus - dit zal worden gebruikt om werkvoorraden genereren direct, of kan worden opgeslagen bij 4 ° C gedurende jaren.
- Om eiwit expressie controleren verzamelen pellets en resuspendeer in 500 ui PBS. Meng 50 ul van de ophanging met 50 ul van SDS-PAGE laadbuffer (met een reductiemiddel). Run SDS-PAGE en uitvoeren van een Western blot analyse met een anti-hexahistidine antilichaam om genexpressie te bevestigen. Omvatten cellen van de mocktransfectie als negatieve controles (figuur 3).
- Bereiding van werkvoorraden
- Plaat 5 x 10 5 Sf9 cellen / cm 2 in een T175 cm 2 kolf en laat zitten voor 20 minuten laat ze hechten aan het gerecht. Vervang volledige TNM-FH media met TNM-FH-medium dat 3% FBS (en 1% Pen-Strep, 0,1% Pluronic F68).
- Infecteren cellen met 100 pi van de redding supernatant. Incubeer in een 28 ° C incubator zonder CO 2 voor 6 dagen en check af en toe als de cellen geïnfecteerd raken (zoals beschreven in stap 1.2.5.).
- Spin bij 2000 xg bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten en verzamel supernatant. Dit is nu uw P2 voorraad. Deze voorraad kan onbeperkt worden bewaard bij 4 ° C. Herhaal de procedure infectie met 100 ui P2 voorraad cellen kan infecteren. De resulterende voorraad heet P3 of werkvoorraad, die bij 4 ° C worden opgeslagen of direct gebruikt voor eiwitexpressie. De P3 voorraad bevat meestal 10 <sup> 7 -10 9 plaque vormende eenheden / ml.
2. Protein Expression and Purification
Toelichting: Sf9 cellen de groei van baculovirus zeer goed. Hun capaciteit om grote hoeveelheden recombinant eiwit uitscheiden beperkt. Daarom gebruiken we een ander insect cellijn, High Five cellen, voor de expressie van recombinante eiwitten uitgescheiden. Deze cellen ondersteunen geen baculovirus replicatie tot zeer hoge titers 13, maar hebben een hoge secretoire capaciteit.
- Opgroeien High Five cellen
Grow High Five cellen in SFX insect celcultuurmedium in T175 cm 2 flessen. Passage om de andere dag 01:03. Voor een 200 ml uitdrukking cultuur moet je 5 confluerende kolven groeien. - Het oogsten en de besmetting van High Five cellen
- Los High Five cellen van 5 T175 cm 2 kolven door de kolven te tikken met je hand. Verzamel de cel Suspension en overbrengen naar 50 ml centrifuge buizen.
- Spin bij 1200 xg gedurende 7 minuten bij kamertemperatuur. Verwijder de bovenstaande vloeistof door decanteren en verenigen de pellets door resuspenderen in 15 ml P3 voorraad.
- Laat zitten voor 15 min in de stroomkap (Figuur 5).
- Transfer 200 ml Hyclone SFX kweekmedium in een schone, steriele 1000 ml schudkolf (zonder Buffles, afgesloten met aluminiumfolie voor het autoclaveren, had niet mogen worden gebruikt voor de bacterieculturen voor).
- Breng de P3/cell schorsing in de shaker kolf. Seal met steriele aluminiumfolie en overdracht kolf in een shaker. Schud bij 70 tpm bij 28 ° C 72-96 uur.
- Het oogsten van recombinant eiwit uit High Five cel expressie bovenstaande vloeistoffen
- 72-96 uur na infectie overdracht kweeksupernatantia in 500 ml centrifugeren emmers. Spin bij 5500 g gedurende 20 min bij 4 ° C. In de tussentijd spoel de schudflessen 3x met dubbel gedestilleerd water(DDH 2 O).
- Overdracht 3 ml Ni-hars suspensie in een 50 ml buis met 45 ml PBS (een vereist per 200 ml kweek). Goed schudden en draaien op 3000 xg bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten. Giet het PBS en bewaar de pellet. Meng het insect celsupernatant met de Ni-harspellet en overbrengen naar het al gespoeld schudflessen. Incubeer bij 4 ° C gedurende 2-4 uur onder schudden (figuur 6).
- Mount 10 ml kolom polypropyleen op een klem op een statief. Verwijder beide doppen en plaats een beker onder de kolom om de stroming te verzamelen door middel van (afval). Neem de shaker fles uit de shaker en beginnen aan het supernatant / slurrymengsel overbrengen op de kolom, het zal de Ni-hars te behouden en alleen de bovenstaande zal doorstromen. Passeer het gehele volume in de kolom (Figuur 7).
- Was de hars 4x met 15 ml wasbuffer (50 mM Na 2 HCO 3, 300 mM NaCl, 20 mM imidazool, pH 8). Laat al het wassen buffer drainuit de kolom en sluit deze met de dop (onderkant).
- Voeg 2 ml elutiebuffer (50 mM Na 2 HCO 3, 300 mM NaCl, 300 mM imidazool, pH 8) en laat zitten voor 5 minuten. Open kolom en vang het eluaat. Herhaal dit 3 keer (in totaal 8 ml elutiebuffer). Eluaat dat hoge concentraties van eiwitten bevat toont typisch schuim bij het schudden (figuur 7). Houd eluaat op nat ijs waar mogelijk.
- Bufferuitwisseling en concentratie
- Prespin 15 ml ultrafiltratie centrifugeren eenheden bij 3000 xg bij 4 ° C gedurende 20 minuten (30 kDa cut-off voor HA / NA, maar kunnen variëren afhankelijk van het gezuiverde eiwit grootte) met PBS (pH 7,4-7,6). Gooi de stroom door en de belasting eluaat op de spin kolom. Vul met 5 ml steriele, ijskoude PBS en centrifugeren gedurende 60 minuten bij 3000 xg bij 4 ° C.
- Discharge stroom door opnieuw vullen met 15 ml ijskoud PBS en centrifugeren gedurende 60 minuten bij 3000 xg bij 4 ° C. Herhaal deze procedureDure nog een keer.
- Neem de spin kolom uit de centrifuge en het verzamelen van de buffer uitgewisseld concentraat (meestal 200 pl). Dit is sterk geconcentreerd recombinant eiwit. Spoel de kolom spin met 400 ul van steriele ijskoude PBS en voeg deze toe aan het concentraat. Houd het concentraat op ijs te allen tijde.
3. Karakterisering en Quality Control
- Meten eiwitconcentratie
Neem een monster van het concentraat en meet dat met behulp van uw eiwit kwantificatie methode van keuze. Stel proteïne concentratie 1 mg / ml door toevoeging van PBS en vries kleine porties tot -80 ° C. Vries dooi cycli schaden de eiwitstructuur en kan leiden tot aggregatie. - SDS-PAGE en Coomassie kleuring
Run 500 ng van het eiwit op een SDS-PAGE en voer een Coomassie kleuring. Voor een snelle en gemakkelijke kleuring gebruiken Coomassie reagens in combinatie met een magnetron protocol. HA-eiwitten meestal verschijnen op 64kDa terwijl NA eiwitten moet draaien op een formaat van ongeveer 56 kDa (figuren 8A en B). Met behulp van de beschreven protocol moet je geen afbraakproducten zien. Als de afbraak plaatsvindt is het meestal een teken van gist / schimmel besmetting tijdens expressie. In dit geval de procedure herhalen en zorg ervoor dat alles steriel te houden. - Western Blot / ELISA
Om eiwit identiteit te verifiëren raden we doen om een Western blot of ELISA-test met een specifiek antilichaam. Idealiter worden ELISA-testen uitgevoerd met een antilichaam dat bindt aan conformationele epitopen (bijv. anti-HA antilichamen steel 1). Met een dergelijk antilichaam de correcte vouwing van het eiwit worden bevestigd (Figuur 8C). - Meten NA activiteit
Correcte vouwing van de virale NA kan worden bepaald door NA activiteit. We raden aan om deze test uit te voeren met behulp van de in de handel verkrijgbare NA * STAR assay (volg gewoon de richtsnoeren voor de gebruikers).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
HA moleculen uit A/Shanghai/1/13 en A/Anhui/1/13 goed uitgedrukt met opbrengsten van ongeveer 20 mg / L cultuur. NA moleculen van beide stammen vertoonden matige expressieniveaus van 0,2 mg / l cultuur A/Shanghai/1/13 tot 0,7 mg / L voor A/Anhui/1/13. Alle vier eiwitpreparaten had zeer weinig tot geen onzuiverheden (figuren 8A en B) met HEEFT zijnde van een hogere zuiverheid dan NA dat verklaard kan worden door de expressie niveau. A/Shanghai/1/13 HA werd verder geanalyseerd met behulp van ELISA met de breed neutraliserende steel-reactieve menselijke mAb CR9114 23. Dit mAb bindt aan een gevoelige conformationele epitoop in de stengel domein en wordt hier als een probe voor correcte vouwing van dit domein. Het antilichaam vertoont een goede binding die het vertrouwen dat de HA inderdaad correct gevouwen (Figuur 8C) geeft. Een tweede ELISA met anti-H7 muizen polyklonaal serum werd uitgevoerd om de identiteit van het verkregen eiwit bevestiging per H7 oorsprong (Figuur 8D).
Figuur 1. Schematische HA en NA expressieconstructen. Het expressieconstruct voor HA (A) bevat een N-eindstandig signaalpeptide, gevolgd door HA ectodomein, een trombine splitsingsplaats, een T4 trimerisatie domein en een hexahistidine tag. De NA expressieconstruct (B) bevat een N-eindstandig signaalpeptide gevolgd door een hexahistidine-label, een vasodilator stimulerende fosfoproteïne (VASP) tetramerisatie domein en NA ectodomein. Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken .
Figuur 2. Schema van bacmide generatorion (zoals beschreven in stap 1.1.2). Een baculovirus transfer vector met HA of NA-genen wordt omgezet in DH10Bac bacteriën. Recombinatie in de baculovirusgenoom dat deze bacteriën dragen produceert een witte kolonie fenotype op selectieplaten. Een witte kolonie wordt geplukt en gestreken. Een enkele kolonie van de opnieuw uitgestreken plaat wordt gebruikt om een Midiprep inoculeren.
Figuur 3. Schema van baculovirus redding en werkvoorraad generatie (zoals beschreven in stappen 1.2.1-6). Recombinant bacmide en transfectiereagens worden verdund in serum-vrij TNM-FH-medium. De twee oplossingen worden gecombineerd, het mengsel wordt gedurende 20 minuten en vervolgens overgebracht op Sf9-cellen. Zes uur na transfectie de transfectiemedium wordt vervangen door een volledige TNM-FH media. Zes dagen na transfectie werd het supernatant geoogst en de celpellet wordt analeyzed voor de expressie van recombinante eiwitten.
Figuur 4. Gezonde en geïnfecteerde Sf9 cellen. Sf9 cellen in (A) zijn gezond en niet-geïnfecteerde. Zij worden aan de cultuur schotel bevestigd, kijk gedeeltelijk polymorfe en relatief klein. Cellen in (B) zijn besmet met baculovirus, los van de cultuur schotel, zijn groot en rond en hebben kernen vergroot. De kern toont een granulaire structuur.
Figuur 5. Infectie van High Five cellen met recombinant baculovirus (werkvoorraad, zoals beschreven in stap 2.2). Vijf samenvloeiing T175 kolven met High Five cellen worden geoogst door lage snelheid centrifugeren en gecombineerd met 15 ml P3 baculovirus voorraad. Na 15 min incubation de cel / virus-mengsel wordt overgebracht in 1000 ml schudkolven met 200 ml SFX media.
Figuur 6. Oogst van celsupernatant 72-96 uur na infectie en incubatie met Ni-NTA hars (zoals beschreven in stap 2.3). Besmet celsuspensies geoogst door lage snelheid centrifugeren. Kweeksupernatanten worden gemengd met PBS geëquilibreerd Ni-hars en gedurende 2-4 uur onder schudden.
Figuur 7. Zuiveringsprocedure (zoals beschreven in 2.3 en 2.4) en kwaliteitscontrole (zoals beschreven in stap 3.1.1-4). Nadat de incubatie alle supernatant / harsmengsel is geplaatst op polypropyleen kolommen. De hars wordt vastgehouden door de kolom en wordt vervolgens vier keer gewassen met was buffer en het recombinante eiwit wordt geëlueerd met 8 ml van elutiebuffer toegepast 2 ml stappen. Het eluaat wordt vervolgens geconcentreerd en buffer uitgewisseld met een ultrafiltratie Spin Column, in porties verdeeld en ingevroren. Kwaliteitscontrole testen omvatten SDS-PAGE, Western blot, ELISA en meting van de activiteit van recombinant NA NA.
Figuur 8. Representatieve resultaten. HA (A) en NA (B) eiwitten van A/Anhui/1/13 en A/Shanghai/1/13 werden geanalyseerd met SDS-PAGE en Coomassie kleuring. Structurele integriteit van de HA A/Shanghai/1/13 werd gemeten met de breed neutraliserende humane steel-reactieve antilichaam CR9114 dat bindt aan een gevoelige conformatie-epitoop (C). De identiteit van dezelfde HA werd bevestigd door een polyklonaal anti-H7 muizenserum (D).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hoewel expressie van influenzavirus HA en NA eiwitten in insectencellen met het baculovirus expressiesysteem het algemeen ongecompliceerd, er een aantal belangrijke punten om te overwegen. Het is belangrijk, zoals in de inleiding, dat de ectodomeinen van HA en NA worden uitgedrukt in fusie met trimerisatie of tetramerisatie domeinen, respectievelijk. Deze domeinen correcte vouwing van de moleculen begeleid vanuit het transmembraandomein, die niet voorkomen als alleen het ectodomein uitgedrukt. Bijvoorbeeld, de expressie van de HA ectodomein zonder trimerisatie domein leidt tot oligomerisatie en destabilisatie belangrijke neutraliserende epitopen in de stengel domein 1. Verder is de stabiliteit van de eiwitten verminderd en degradatie door baculovirus insectencel en proteasen optreedt. De keuze van de trimerisatie of tetramerisatie domein minder belangrijk, een aantal van hen vinden leucineritssluitingdomeinen 22T4 faag foldons 11 zijn tot nu toe getest en alle vertoonden bevredigende resultaten. Het is belangrijk om in gedachten te houden dat multibasic klievingsplaatsen zoals die in de hoogpathogene H5N1 24 of H7N7 25 isolaten (maar niet in H7N9) hebben voordat expressie die moet worden verwijderd omdat ze worden gesplitst door furin achtige proteases die aanwezig zijn te allen tijde in zijn het baculovirus expressiesysteem 1,12.
Een andere mogelijke reden voor degradational producten is besmetting met gist of schimmel. Dit kan al tijdens het werken stock generatie gebeuren en kan onopgemerkt blijven tijdens de opslag van de voorraden bij 4 ° C. Veel gisten en schimmels voorkeur temperaturen tussen 20-30 ° C voor een optimale groei en daadwerkelijk geremd bij 37 ° C, die gemeenschappelijk kweektemperatuur voor zoogdiercellen. Aangezien de meeste antibiotica die worden gebruikt in celcultuur zijn niet werkzaam tegen eukaryote organismen zoals gist en schimmels en insecten celkweek performe d op optimale groeicondities van deze kiemen extra zorg moet worden genomen met betrekking tot het aseptisch de gewassen. Naast begroeiing insectencellen en verzurende media, schimmels en gisten drukken vele oplosbare proteasen en derhalve volledig recombinante eiwitten afbreken.
Een probleem dat soms wordt neerslaan in de elutiebuffer. Dit komt zelden meer of minder stamspecifieke (bijv. A/Vietnam/1203/04 H5 HA neiging neer te slaan), maar kan worden voorkomen door een snelle en volledige buffer uitwisseling PBS. Opslag van eiwitten in-imidazool bevattende elutiebuffer wordt afgeraden. De zuiveringsprocedure van oogst tot het bevriezen van monsters tot -80 ° C worden uitgevoerd binnen een werkdag en opslag van gezuiverd eiwit op temperatuur dan -80 ° C moeten worden vermeden. Ook zijn herhaalde vries-dooi cycli is bewezen dat een negatieve invloed op de stabiliteit van bepaalde epitopen 1.
_content "> Opbrengsten worden verwacht in het traject van 0,2-30 mg / l cultuur. Vele HEEFT drukken in het bovenste bereik terwijl NA neiging op lagere niveaus tot expressie. Ook expressieniveaus voor HAS lijken omgekeerd correleren met het aantal van glycosyleringsplaatsen. heeft uit menselijke seizoensgebonden H3N2 en seizoensgebonden prepandemisch H1N1 isoleert tonen meestal lage expressie niveaus, terwijl de meeste heeft van het aviaire influenzavirus oorsprong hebben hoge expressie niveaus. Om uitdrukking te verbeteren is het raadzaam om de celdichtheid in de kolf verhogen of om te proberen minder gebruiken of meer werkvoorraad per expressie. 10-voudige toename of afname van de werkvoorraad kan een positieve invloed hebben op de expressie niveaus. Een andere factor die van invloed kan zijn op de expressie niveaus is de tijd tussen de besmetting en de oogst. 96 uur zijn ideaal voor de meeste heeft en NA maar kortere incubatietijd zou eigenlijk verhogen van de opbrengsten van een aantal eiwitten.Insectencellen kunnen posttranslationele modificaties presteren in een bijna mammalian-achtige wijze en kunnen zeer complexe eiwitstructuren voudig met gelijke efficiëntie als zoogdiercellen (maar produceert hogere opbrengsten). Qua glycosylatie vertonen zij een patroon dat enigszins verschilt van zoogdiercellen en bevat voornamelijk paucimannosidic N-glycanen die siaalzuur wijzigingen 19 ontbreekt. Echter, insecten cellijnen die zijn aangepast voor zoogdiercellen produceren glycosylering (inclusief terminale siaalzuur) verkrijgbaar 14.
Het baculovirus expressiesysteem is een zeer nuttig hulpmiddel voor expressie van het recombinante influenza oppervlak glycoproteïnen - HA en NA. Deze recombinante eiwitten worden gebruikt voor vele immunologische en biochemische assays, en voor normalisatie van antigeengehalte vaccins en als antigeen voor vaccinatie-experimenten in diermodellen. Baculovirus-expressie HA en NA vertonen volledige biologische functie en juist opvouwen indien uitgedrukt in frame met trimerizatiop en tetramerisatie domein respectievelijk. Dit onderscheidt hen van bacteriële geuit heeft die niet-geglycosyleerd en het gebrek aan functionele epitopen in de stengel domein. Bovendien is het baculovirus expressiesysteem vertoont significant hogere opbrengsten eiwitten dan zoogdiercelsystemen 26 verwerking en opschaling gemakkelijker. Samengevat beschrijven we een eenvoudig en efficiënt protocol voor het uitdrukken van grote hoeveelheden recombinant influenzavirus HA-en NA-moleculen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Wij willen Patrick C. Wilson bedanken voor monoklonaal antilichaam CR9114. We danken ook Jennifer Debeauchamp en Richard Webby voor de originele A/Anhui/1/13 plasmiden. Gedeeltelijke ondersteuning voor dit werk werd geleverd door het Nationaal Instituut voor Allergie en Besmettelijke Ziekten gefinancierd programma Project Grant AI097092-01A1 en CEIRS (Centers of Excellence voor Influenza Onderzoek en Surveillance, HHSN26620070010C). FK werd ondersteund door een Erwin Schrödinger fellowship (J 3232) van de Oostenrijkse Science Fonds (FWF).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Bac-to-Bac Baculovirus expression system | Invitrogen | 10359-016 | Follow manufacturer's instructions |
| TNM-FH insect medium | Gemini Bioproducts | 600-311 | |
| HyClone SFX-Insect | Thermo Fisher | SH30278.02 | |
| Cellfectin II Reagent | Invitrogen | P/N58760 | |
| Pluronic F68 | Sigma | 1000702664 | |
| SimplyBlue SafeStain | Invitrogen | LC6060 | |
| Ni-NTA Agarose | Qiagen | 1018240 | |
| Amicon Ultra Centrigual filters Ultracel 30K | Millipore | UFC902024 | |
| Pen Strep | Gibco | 15140-122 | |
| Polypropylene Columns (5 ml) | Qiagen | 34964 | |
| Max efficiency DH10Bac bacteria | Invitrogen | 10361-012 | |
| PureLink HiPure Plasmid Filter Midiprep Kit | Invitrogen | K210015 | |
| Imidazole | Sigma-Aldrich | I2399-100G | for elution and wash buffers |
| Sf9 cells | ATCC | CRL-1711 | |
| High Five cells | Invitrogen | B85502 |
References
- Krammer, F., et al. A carboxy-terminal trimerization domain stabilizes conformational epitopes on the stalk domain of soluble recombinant hemagglutinin substrates. PLoS One. 7, e43603 (2012).
- Krammer, F., Pica, N., Hai, R., Margine, I., Palese, P. Chimeric hemagglutinin influenza virus vaccine constructs elicit broadly-protective stalk-specific antibodies. J. Virol. , (2013).
- Leyva-Grado, V. H., Mubareka, S., Krammer, F., Cárdenas, W. B. Influenza virus infection in Guinea pigs raised as livestock, ecuador. Emerg. Infect. Dis. 18, 1135-1138 (2012).
- Margine, I., et al. H3N2 influenza virus infection induces broadly reactive hemagglutinin stalk antibodies in humans and mice. J. Virol. , (2013).
- Miller, M. S., et al. 1976 and 2009 H1N1 Influenza Virus Vaccines Boost Anti-Hemagglutinin Stalk Antibodies in Humans. J. Infect. Dis. 652, (1976).
- Pica, N., et al. Hemagglutinin stalk antibodies elicited by the 2009 pandemic influenza virus as a mechanism for the extinction of seasonal H1N1 viruses. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, 2573-2578 (2012).
- Sangster, M. Y., et al. The B cell response and hemagglutinin stalk-reactive antibody production in different age cohorts following 2009 H1N1 influenza vaccination. Clin. Vaccine Immunol. , (2013).
- Tan, G. S., et al. A pan-h1 anti-hemagglutinin monoclonal antibody with potent broad-spectrum efficacy in vivo. J. Virol. 86, 6179-6188 (2012).
- Ekiert, D. C., et al. Antibody recognition of a highly conserved influenza virus epitope. Science. 324, 246-251 (2009).
- Xu, X., Zhu, X., Dwek, R. A., Stevens, J., Wilson, I. A. Structural characterization of the 1918 influenza virus H1N1 neuraminidase. J. Virol. 82, 10493-10501 (2008).
- Stevens, J., et al. Structure of the uncleaved human H1 hemagglutinin from the extinct 1918 influenza virus. Science. 303, 1866-1870 (2004).
- Wei, C. J., et al. Comparative efficacy of neutralizing antibodies elicited by recombinant hemagglutinin proteins from avian H5N1 influenza virus. J. Virol. 82, 6200-6208 (2008).
- Krammer, F., et al. Trichoplusia ni cells (High Five) are highly efficient for the production of influenza A virus-like particles: a comparison of two insect cell lines as production platforms for influenza vaccines. Mol. Biotechnol. 45, 226-234 (2010).
- Palmberger, D., et al. Insect cells for antibody production: evaluation of an efficient alternative. J. Biotechnol. 153, 160-166 (2011).
- Santiago, F. W., Lambert Emo, K., Fitzgerald, T., Treanor, J. J., Topham, D. J. Antigenic and immunogenic properties of recombinant hemagglutinin proteins from H1N1 A/Brisbane/59/07 and B/Florida/04/06 when produced in various protein expression systems. Vaccine. 30, 4606-4616 (2012).
- Wrammert, J., et al. Broadly cross-reactive antibodies dominate the human B cell response against 2009 pandemic H1N1 influenza virus infection. J. Exp. Med. 208, 181-193 (2011).
- Treanor, J. J., et al. Protective efficacy of a trivalent recombinant hemagglutinin protein vaccine (FluBlok) against influenza in healthy adults: a randomized, placebo-controlled trial. Vaccine. 29, 7733-7739 (2011).
- Dalakouras, T., Smith, B., Platis, D., Cox, M., Labrou, N. Development of recombinant protein-based influenza vaccine. Expression and affinity purification of H1N1 influenza virus neuraminidase. J. Chromatogr. A. 1136, 48-56 (2006).
- Krammer, F., Grabherr, R. Alternative influenza vaccines made by insect cells. Trends Mol. Med. 16, 313-320 (2010).
- Gao, R., et al. Human Infection with a Novel Avian-Origin Influenza A (H7N9) Virus. N. Engl. J. Med. , (2013).
- Goff, P. H., et al. Induction of cross-reactive antibodies to novel H7N9 influenza virus by recombinant Newcastle disease virus expressing a North American lineage H7 subtype hemagglutinin. J. Virol. , (2013).
- Weldon, W. C., et al. Enhanced immunogenicity of stabilized trimeric soluble influenza hemagglutinin. PLoS One. 5, (2010).
- Dreyfus, C., et al. Highly conserved protective epitopes on influenza B viruses. Science. 337, 1343-1348 (2012).
- Steel, J., et al. Live attenuated influenza viruses containing NS1 truncations as vaccine candidates against H5N1 highly pathogenic avian influenza. J. Virol. 83, 1742-1753 (2009).
- Fouchier, R. A., et al. Avian influenza A virus (H7N7) associated with human conjunctivitis and a fatal case of acute respiratory distress syndrome. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 1356-1361 (2004).
- Kost, T., Condreay, J., Jarvis, D. Baculovirus as versatile vectors for protein expression in insect and mammalian cells. Nat. Biotechnol. 23, 567-575 (2005).
