Summary
Här beskriver vi ett sätt att uttrycka korrekt veckade och funktionella influensa Ytantigener härrör från romanen kinesiska H7N9-virus i insektsceller. Tekniken kan anpassas för att uttrycka ektodomäner av eventuella virus eller cellulära ytproteiner.
Abstract
The baculovirus-expressionssystemet är ett kraftfullt verktyg för expression av rekombinanta proteiner. Här använder vi den för att producera korrekt vikta och glykosylerade versioner av influensa A-virus ytglykoproteiner - hemagglutinin (HA) och neuraminidas (NA). Som ett exempel har vi valt de HA och NA-proteiner som uttrycks av den nya H7N9 virus som nyligen dykt upp i Kina. Men det protokoll enkelt kan anpassas för HA-och NA-proteiner som uttrycks av en annan influensa A och stammar B virus. Rekombinant HA (rHA) och NA (RNA) proteiner är viktiga reagenser för immunologiska analyser såsom ELISPOT och ELISA, och är också allmänt använd för vaccin standardisering, antikropps upptäckt, isolering och karakterisering. Vidare kan rekombinanta NA-molekyler användas för att screena för småmolekylära inhibitorer och är användbara för karakterisering av den enzymatiska funktionen av NA liksom dess känslighet för antivirala medel. Rekombinanta HA-proteiner är också being testas som experimentella vaccin i djurmodeller, och ett vaccin baserat på rekombinant HA nyligen licensierad av FDA för användning på människa. Den metod som vi beskriver här att producera dessa molekyler är rakt fram och kan underlätta forskning i laboratorier influensa, eftersom den möjliggör produktion av stora mängder proteiner snabbt och till en låg kostnad. Även här fokuserar vi på influensavirus ytglykoproteiner, kan metoden också användas för att producera andra virala och cellulära ytproteiner.
Introduction
Som ett första svar på den senaste tidens utveckling av romanen H7N9 influensavirus stam i Kina förvärvade vi plasmider som bär de genomsekvenser för hemagglutinin (HA) och neuraminidas (NA) gener i de två första isolaten. Med hjälp av dessa plasmider vi kunde snabbt konstruera baculovirala expressionsvektorer för framställning av rekombinant HA och NA i insektsceller. Detta expressionssystem är väl etablerat i vårt laboratorium och har visat sig avgörande för många av våra pågående forskningsprojekt 1-8. Insektsceller har möjlighet att korrekt vika och post-translationellt modifiera komplexa proteiner. Dessa modifieringar innefattar N-länkad glykosylering, vilket är viktigt för många virala glykoproteiner. Som sådant är det inte förvånande att baculovirussystemet är ganska etablerad för att uttrycka influensavirus ytantigener. I själva verket är många av de HA-och NA-kristallstrukturer har lösts med användning av insektscell uttryckta proteiner 9-11. En annan fördel medSystemet ligger i dess pålitliga hög protein avkastning på upp till 30 mg HA / L cellodling (baserat på vår erfarenhet med mer än 50 olika HA-proteiner) - en följd av virus-infektion drivna uttryck från den starka polyhedrinpromotorn.
Borttagning av trans och endodomain av HA-och NA-proteiner möjliggör uttryck av utsöndringsbar, lösliga versioner av proteiner och på så sätt underlättar i hög grad reningsprocessen. Dessutom är dessa ektodomäner hexahistidin taggade och kan därför renas med användning av affinitetskromatografi med användning av Ni2 +-harts. De transmembrandomäner av HA-och NA-proteiner bidrar till homotrimer och homotetramer bildning, respektive. För att bevara dessa oligomerizations lägger vi en C-terminal trimeriseringsdomänen av HA-och en N-terminal tetrameriseringsdomänen till NA-konstruktionerna (Figur 1). Vi har visat entydigt att sådan trimerise domän stabiliserar funktionell, konserved konformationsepitoper på strå-domänen av HA 1. Den korrekta tetramerisation av NA kan också bidra till rätta vikning och NA-funktion 10. Sekvenser och Baculo-överföringsvektorer hyser trimerise eller tetramerisation domäner kan beställas från författarna eller från andra laboratorier i området, 9,10,12.
En annan viktig fråga för expression av utsöndrade proteiner i insektsceller är valet av den rätta cellinjen. Medan Spodoptera frugiperda härrör Sf9 celler stöder baculovirus replikering mycket bra och är i allmänhet används för virus räddning och förökning, de har begränsad kapacitet att utsöndra stora mängder protein. Trichoplusia ni härstammar BTI-TN-5B1-4-celler (allmänt känd som High Five) har en högre utsöndring kapacitet och är cellinjen valt för expression i detta protokoll 13,14. Dessutom är det bra att minska eller till och med ta bort fetalbovinserum (FBS) från expressionskulturer. Vi använder därför media med reducerad (3%) FBS innehåll för växande virusarbets lager, och vi utför proteinuttryck i serum fria medier.
Rekombinanta HA och NA-proteiner används för många immunologiska tekniker. Den kanske vanligaste är i ELISA-analyser för att mäta serumomvandling vid vaccination hos människor eller djur 4,6,7,15. Har och programkontoren används också i ELISPOT-analyser som både stimulerande molekyler och detektionsreagens för antikropps utsöndrar celler 16. Deras användning som molekylära beten tillåter att specifikt sortera för plasmablasts eller andra typer av B-celler som sedan kan användas för att isolera (terapeutiska) monoklonala antikroppar (mAb). Rekombinanta HA-och NA-molekyler vidare användas i karaktäriseringen av dessa mAbs 8. Andra exempel studera pH-stabilitet eller receptor specificitet har uttryckt av olika virusisolat, eller kvantitativt bedöma specifika NA enzymatiskaaktivitet eller resistens mot hämmare. Vidare rekombinant, renad HA kan användas för att standardisera HA innehåll av inaktiverade influensavirusvacciner.
Viktigt rHA (och till en viss grad NA) vaccinkandidater för närvarande testas i djurmodeller och kliniska försök med en vaccinkandidat licensieras av FDA under 2013 2,17-19. Fördelen med dessa nya vacciner är det, på grund av den rekombinanta karaktären av dessa proteiner, arbetsintensiv process för generering av hög tillväxt reassortant virus skulle kunna undvikas. Kanske ännu mer relevant är det faktum att deras HA avkastningen är hög och reproducerbar från stam till stam. Dessutom, eftersom dessa vacciner tillverkas i ett ägg-fria systemet, innehåller de inte proteinkontaminanter som är problematiska för individer med äggallergies.
Här valde vi att uttrycka HA-och NA-proteiner från två isolat av den nya kinesiska H7N9 influensavirus, A / Anhui/1/13 och A/Shanghai/1/13 20,21. Dessa är lägliga exempel, men den beskrivna protokollet kan användas för expression av någon influensa A och B HA eller NA-proteiner och kan anpassas för att uttrycka några andra utsöndrade virala eller cellulära proteiner. Trimera eller tetramera transmembranproteiner kan klonas in i expressionskassetterna som används för HA-och NA, respektive. Men mest lösliga utsöndrade cellulära proteiner, som interferoner till exempel, behöver inte ytterligare en domän för stabilisering och kan uttryckas enbart med en C-terminal hexahistidinmarkör.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Generering av rekombinant baculovirus
- Kloning i baculovirus överförings-plasmider
- Clone H7 HA och N9 NA ektodomän (eller någon annan HA eller NA-genen) i modifierad pFastBac överförings plasmider (se inledningen). Vektorer för HA som innehåller en C-terminal trimerise domän och en hexahistidinmarkör, liksom för NA som innehåller en N-terminal tetra domän och hexahistidinmarkör, har beskrivits 1,10,11,22 (figur 1) och kan beställas från författarna.
Förklaring: HA ektodomäner uttrycks utan en trimeriseringsdomän kommer att vikas på fel sätt, vilket leder till förlust av konforma neutraliserande epitoper, särskilt i stjälken domänen. På samma sätt bygger den enzymatiska funktionen NA på riktig tetramerisation. - Generation av bacmids
Trans baculovirus överförings-plasmider innehållande HA-och NA-gener i DH10Bac bakterier efter att använda en baculovirus uttrycksystemet enligt tillverkarens instruktioner. Isolera och rena bacmids använder ett Midiprep-kit i enlighet med tillverkarens instruktioner (Figur 2).
- Clone H7 HA och N9 NA ektodomän (eller någon annan HA eller NA-genen) i modifierad pFastBac överförings plasmider (se inledningen). Vektorer för HA som innehåller en C-terminal trimerise domän och en hexahistidinmarkör, liksom för NA som innehåller en N-terminal tetra domän och hexahistidinmarkör, har beskrivits 1,10,11,22 (figur 1) och kan beställas från författarna.
- Räddning av rekombinant baculovirus och verifiering av proteinexpression
Förklaring: Följande steg måste utföras aseptiskt i ett laminärt flöde huva. Utför denna procedur självständigt för HA och NA (eller någon annan gen av intresse). Insektsceller är vanligtvis odlas vid 28 ° C utan CO2. Sf9-celler för detta protokoll odlas i fullt TNM-FH insektscellmedia kompletterat med 10% FBS, 1% Pen-Strep * och 0,1% Pluronic F68-lösning, om inte annat anges, och passe 01:04 två gånger i veckan. High Five-celler odlas i SFX serumfritt medium och passe 1:15 två gånger i veckan.
* Tillägg av antibiotika bör övervägas frivilligt hela protokollet och justeras i enlighet med de metoder som används i varje laboratorium.- Plåt Sf9-insektsceller i 6-brunnsplattor vid en densitet av 2 x 10 5 celler / cm 2 och låt stå under 20 min i en 28 ° C inkubator (utan CO2).
- Blanda 2 | ig (konc. 0,5 till 2 | j, g / ul) av rekombinant bacmid med 100 | il av TNM-FH-medium (serumfritt, 1% Pen-Strep). Blanda 6 ul av transfektion medlet med 100 | il av TNM-FH-medium (serumfritt, Pen-Strep). Kombinera de två volymer, blanda försiktigt och låt stå under 20 minuter vid rumstemperatur (transfektion blandning). Inkludera en mock-transfektion som kontroll (Figur 3).
- Avlägsna supernatanten från pläterade Sf9 celler (celler kommer nu hålla sig till plattan) och ersätt med 2 ml av serumfritt TNM-FH-medium innehållande Pen-Strep (1%). Lägg hela volymen transfektionsblandningen (från steg 1.2.2) och rock 6-brunnar försiktigt i 5 sek. Inkubera i 28 ° C inkubator utan CO2 under 6 h (fig 3).
- Byt medium with färska fullständiga TNM-FH-medium (innehållande 10% FBS, 1% Pen-Strep och 0,1% Pluronic F68). Inkubera i 28 ° C inkubator utan CO2 i 6 dagar. Kontrollera celler ibland under ett mikroskop. Infekterade celler visas oftast större, rundare, har förstorade kärnor, och börja att ta bort (Figur 4).
- Skörd av celler och bekräftelse av proteinuttryck
- Skörda celler 6 dagar efter transfektion genom centrifugering vid 2000 x g under 5 min vid rumstemperatur. Supernatanten innehåller det rekombinanta baculoviruset - detta kommer att användas för att alstra driftlager direkt, eller kan lagras vid 4 ° C i flera år.
- För att kontrollera proteinuttryck samla pellets och suspendera i 500 l av PBS. Blanda 50 | il av suspensionen med 50 | il av SDS-PAGE-laddningsbuffert (innehållande ett reduceringsmedel). Kör SDS-PAGE och utföra en Western blot-analys med en anti-hexahistidin antikropp för att bekräfta genexpression. Inkludera celler från mocktransfektion som negativa kontroller (Figur 3).
- Beredning av arbets lager
- Plansch 5 x 10 5 Sf9 celler / cm 2 i en T175 cm 2 kolv och låt stå under 20 min tillåta dem att fästa till skålen. Byt hela TNM-FH media med TNM-FH-medium innehållande 3% FBS (och 1% Pen-Strep, 0,1% Pluronic F68).
- Infektera celler med 100 | il av räddnings supernatanten. Inkubera i 28 ° C inkubator utan CO2 i 6 dagar och kolla då och då om cellerna blir infekterade (enligt beskrivningen i steg 1.2.5.).
- Centrifugera vid 2000 x g vid rumstemperatur i 5 min och samla in supernatanten. Detta är nu din P2 lager. Detta lager kan förvaras under obegränsad tid vid 4 ° C. Upprepa infektionen proceduren med 100 pl av P2 lager för att infektera celler. Den resulterande lager kallas P3 eller arbetar lager, som kan lagras vid 4 ° C eller användas direkt för proteinuttryck. P3 lager innehåller vanligtvis 10 <sup> 7 -10 9 plackbildande enheter / ml.
2. Protein Expression and Purification
Förklaring: Sf9 celler stödja tillväxten av baculovirus mycket väl. Är dock begränsad deras förmåga att utsöndra stora mängder av rekombinant protein. Därför använder vi en annan insekts cellinje, High Five celler, för uttryck av utsöndrade rekombinanta proteiner. Dessa celler stöder inte baculovirus replikering till mycket höga titrar 13 men har hög sekretoriska kapacitet.
- Att växa upp High Five celler
Väx High Five-celler i SFX insektscellodlingsmedium i T175 cm 2 kolvar. Passage varannan dag 01:03. För en 200 ml uttryckskultur behöver växa 5 sammanflytande kolvar. - Skörd och infektera High Five celler
- Lossa High Five celler från 5 T175 cm 2 kolvar genom att knacka kolvarna med handen. Samla cellen Drivlina & hjulupphnsion och överför till 50 ml centrifugrör.
- Centrifugera vid 1200 x g under 7 min vid rumstemperatur. Avlägsna supernatanten genom dekantering och förena nämnda pellets genom att återsuspendera dem i 15 ml av P3 lager.
- Låt sitta i 15 minuter i flödeshuven (fig 5).
- Överför 200 ml Hyclone SFX odlingsmedium i en ren, steril 1000 ml shaker kolv (utan buffles, förseglad med aluminiumfolie före autoklavering, inte borde ha använts för bakteriekulturer innan).
- Överför P3/cell suspensionen i skakkolv. Täta med sterilt aluminiumfolie och överföringskolv i en shaker. Skaka vid 70 rpm vid 28 ° C i 72-96 timmar.
- Skörd rekombinant protein från High Five celluttrycks supernatanter
- 72-96 tim efter infektion överförings odlingssupernatanter i 500 ml centrifuge hinkar. Centrifugera vid 5500 x g under 20 min vid 4 ° C. Under tiden skölj skakkolvar 3x med dubbeldestillerat vatten(DDH 2 O).
- Överför 3 ml Ni-harts uppslamningen i ett 50 ml rör med 45 ml PBS (en behövs per 200 ml kultur). Skaka väl och snurra vid 3000 xg vid rumstemperatur i 10 minuter. Häll av PBS och hålla pelleten. Blanda insektscellvätskan med Ni-harts pellets och överför till de redan sköljda skakkolvar. Inkubera vid 4 ° C under 2-4 h under omskakning (Figur 6).
- Montera 10 ml polypropylen kolonn på en klämma på ett stödstativ. Ta bort båda locken och placera en bägare under kolumnen för att samla flödet genom (avfall). Ta shaker kolven ur shaker och börja överföra blandningen supernatanten / slam på kolonnen, det kommer att behålla Ni-harts och endast supernatanten kommer att flöda igenom. Passera hela volymen över kolonnen (figur 7).
- Tvätta harts 4x med 15 ml tvättbuffert (50 mM Na 2 HCO 3, 300 mM NaCl, 20 mM imidazol, pH 8). Låt all tvättbuffert avloppetfrån kolonnen och stänga den med locket (nedre sidan).
- Tillsätt 2 ml elueringsbuffert (50 mM Na 2 HCO 3, 300 mM NaCl, 300 mM imidazol, pH 8) och låt stå under 5 min. Öppna kolonnen och samla upp eluatet. Upprepa detta tre gånger (med totalt 8 ml av elueringsbuffert). Eluat som innehåller höga halter av protein visar typiskt skum när skakas (Figur 7). Håll eluat på våt is när det är möjligt.
- Buffert utbyte och koncentration
- Prespin 15 ml ultrafiltreringscentrifugeringsenheter (30 kDa cut-off för HA / NA, men kan variera beroende på det renade proteinet storlek) med PBS (pH 7,4 till 7,6) vid 3000 xg vid 4 ° C under 20 min. Ignorera flöda igenom och last eluatet på spinnkolonn. Fyll upp med 5 ml steril, iskall PBS och snurra i 60 min vid 3000 xg vid 4 ° C.
- Discharge flöde genom igen, fyll på med 15 ml iskall PBS och centrifugering under 60 min vid 3000 xg vid 4 ° C. Upprepa detta förfaranderande en gång till.
- Ta spinnkolonn av centrifugen och samla bufferten utbyttes koncentrat (typiskt 200 ^ il). Detta är mycket koncentrerad rekombinant protein. Skölj spinnkolonn med 400 l av steril iskall PBS och tillsätt detta till koncentratet. Håll koncentratet på is hela tiden.
3. Karakterisering och kvalitetskontroll
- Mätning proteinkoncentration
Tag en alikvot av koncentratet och mäta det med hjälp av ditt protein kvantifiering metod för val. Ställ proteinkoncentration till 1 mg / ml genom tillsats av PBS och frysa små alikvoter till -80 ° C. Freeze tiningscykler skada proteinstruktur och kan leda till aggregation. - SDS-PAGE och Coomassie-färgning
Kör 500 ng av din protein på en SDS-PAGE och utföra en Coomassie-färgning. För snabb och bekväm färgning använda Coomassie reagens i kombination med en mikro-protokoll. HA-proteiner visas normalt vid 64kDa medan NA proteiner ska köras vid en storlek på cirka 56 kDa (figur 8A och B). Med hjälp av den beskrivna protokollet ska du inte se några nedbrytningsprodukter. Om nedbrytningen sker det oftast ett tecken på jäst / svampkontamination under uttryck. I detta fall upprepa proceduren och se till att hålla allt sterilt. - Western blöt / ELISA
För att kontrollera proteinidentitet rekommenderar vi att en Western blot eller ELISA-test med en specifik antikropp. Helst är ELISA-analyser utfördes med en antikropp som binder till konformationella epitoper (t ex anti-HA-stalk antikroppar 1). Med användning av en sådan antikropp korrekt veckning av proteinet kan bekräftas (Figur 8C). - Mätning NA aktivitet
Korrekt veckning av viralt NA kan även bestämmas genom mätning av NA-aktivitet. Vi rekommenderar att utföra detta test med hjälp av kommersiellt tillgängliga NA * STAR-analys (bara att följa de riktlinjer användar).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
HA-molekyler från A/Shanghai/1/13 och A/Anhui/1/13 uttryckte väl med utbyten av ca 20 mg / L kultur. NA-molekyler av båda stammarna uppvisade måttliga expressionsnivåer på mellan 0,2 mg / L kultur för A/Shanghai/1/13 till 0,7 mg / L för A/Anhui/1/13. Alla fyra proteinberedningar hade mycket lite att inga orenheter (fig. 8A och B) med HAR är av högre renhet än NAs som kan förklaras av expressionsnivån. A/Shanghai/1/13 HA analyserades ytterligare med hjälp av ELISA med brett neutraliserande stjälk-reaktiv human mAb CR9114 23. Denna mAb binder till en känslig konformationsepitop i stjälken domän och används här som en sond för korrekt veckning av denna domän. Antikroppen visar god bindning som ger förtroende för att HA verkligen är vikt på rätt sätt (figur 8C). En andra ELISA med anti-H7 mus polyklonalt serum utfördes för att bekräfta identiteten hos den erhållna protein som av H7 ursprung (Figur 8D).
Figur 1. Schematisk av HA-och NA-expressionskonstruktioner. Den expressionskonstruktion för HA (A) innehåller en N-terminal signalpeptid följt av HA ektodomänen, ett trombin-klyvningsställe, ett T4-trimeriseringsdomän och en hexahistidinmarkör. NA expressionskonstruktet (B) innehåller en N-terminal signalpeptid följt av en hexahistidinmarkör, vasodilaterare stimulerande fosfoprotein (VASP) tetra domän och NA ektodomänen. Klicka här för att visa en större bild .
Figur 2. Ordning med bacmid Generatjon (såsom beskrivs i steg 1.1.2). En baculovirus-överföringsvektor innehållande HA-eller NA-gener transformeras in DH10Bac bakterier. Rekombination in bakulovirusgenomet att dessa bakterier bär ger en vit koloni fenotyp på selektionsplattor. En vit koloni plockas och ströks. En enda koloni från ströks platta används för att inokulera en Midiprep kultur.
Figur 3. Scheme av baculovirus räddnings-och arbetsaktie generationen (enligt steg 1.2.1-6). Rekombinant bacmid och transfektionsreagens späds i serumfritt TNM-FH-medium. De två lösningarna kombineras, blandningen inkuberas under 20 minuter och därefter överfördes på Sf9-celler. Sex timmar efter transfektion transfektion media ersätts med fulla TNM-FH media. Sex dagar efter transfektion supernatanten skördades och cellpelleten är analyzed för expression av rekombinanta proteiner.
Figur 4. Friska och infekterade Sf9 celler. Sf9 celler i (A) är friska och icke-infekterade. De är knutna till odlingsskålen, ser delvis polymorfa och relativt små. Celler i (B) är infekterade med baculovirus, fristående från odlingsskålen, är stora och runda och har förstorade kärnor. Kärnan uppvisar också en granulärt utseende.
Figur 5. Infektion av High Five celler med rekombinant baculovirus (arbets lager, som beskrivs i steg 2,2). Fem sammanflytande T175 kolvar med High Five celler skördas genom låghastighetscentrifugering och kombineras med 15 ml P3 bakulovirusförrådet. Efter 15 min av icubation cell / virus blandningen överföres till 1000 ml skakkolvar med 200 ml av SFX medier.
Figur 6. Skörd av cellsupernatant 72-96 h efter infektion och inkubation med Ni-NTA-harts (såsom beskrivs i steg 2.3). Infekterade cellsuspensioner skördas genom låghastighetscentrifugering. Kultursupernatanter blandades med PBS-ekvilibrerad Ni-harts och inkuberades under 2-4 h under skakning.
Figur 7. Rening förfarande (såsom beskrives i 2,3 och 2,4) samt kvalitetskontroll (såsom beskrivits i steg 3.1.1-4). Efter inkubering all supernatant / hartsblandning är laddad på polypropen-kolonner. Hartset kvarhålles av kolonnerna och tvättas sedan fyra gånger med tvätt buffer och det rekombinanta proteinet elueras med 8 ml av elueringsbuffert som tillämpas i 2 ml steg. Eluatet då uppdateras buffert utbyttes och koncentrerades med ett ultrafiltreringsspinnkolonn, alikvoterades och frystes. Kvalitetskontroll analyser inkluderar SDS-PAGE, Western blöt, ELISA och mätning av NA-aktiviteten hos rekombinant NA.
Figur 8. Representativa resultat. HA (A) och NA (B) proteiner av A/Anhui/1/13 och A/Shanghai/1/13 analyserades med användning av SDS-PAGE och Coomassie-färgning. Strukturell integritet HA i A/Shanghai/1/13 bedömdes med hjälp av brett neutraliserande stjälk-reaktiva antikroppar CR9114 människa som binder till en känslig konformationsepitop (C). Identiteten av samma HA bekräftades av en polyklonal anti-H7 musserum (D).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Även om uttryck av influensavirus HA och NA-proteiner i insektsceller med användning av baculovirus-expressionssystem är i allmänhet rakt fram, finns det flera viktiga punkter att tänka på. Det är viktigt, som påpekats i inledningen, att ektodomäner av HA och NA uttrycks i fusion med trimerise eller tetramerisation domäner, respektive. Dessa domäner säkerställa korrekt veckning av de molekyler som vanligtvis bistås av den transmembrana domänen, som inte är närvarande om bara ektodomänen uttrycks. Till exempel är uttryck av HA ektodomänen utan en trimeriseringsdomän leder till oligomerisering och destabilisering av viktiga neutraliserande epitoper i stjälken domän 1. Vidare är stabiliteten av proteinerna minskat och nedbrytning av insektscell och baculovirus proteaser inträffar. Valet av trimeriseringen eller tetrameriseringsdomänen är mindre viktig, ett antal av dem som sträcker sig från leucinblixtlåsdomäner 22till T4 fag foldons 11 har testats hittills och alla visade tillfredsställande resultat. Det är viktigt att komma ihåg att flerbasiska klyvningsställen som förekommer i högpatogena H5N1 24 eller H7N7 25 isolat (men inte i H7N9) måste tas bort innan uttrycket eftersom de klyvs av furin som proteaser som är närvarande hela tiden i det baculovirusexpressionssystem 1,12.
En annan möjlig orsak till degradational produkter är kontaminering med jäst eller mögel. Detta kan ske så tidigt som under arbetstid aktie generation och kan gå obemärkt under lagring av lagren vid 4 ° C. Många jäst och mögel föredrar temperaturer mellan 20-30 ° C för optimal tillväxt och faktiskt hämmade vid 37 ° C, vilket är vanligt odlingstemperatur för däggdjursceller. Eftersom de flesta antibiotika som används i cellkultur är inte effektiva mot eukaryota organismer som jäst och mögel, och insektscellodling är performe d vid optimala tillväxtförhållanden för dessa bakterier extra försiktighet måste vidtas när det gäller aseptisk hantering av kulturer. Förutom att igenväxning insektsceller och försurande media, mögel och jäst uttrycker många lösliga proteaser och kan därför helt försämra rekombinanta proteiner.
Ett problem som ibland uppträder är nederbörd i elueringsbufferten. Detta är sällan sett och mer eller mindre belastning specifika (t.ex. A/Vietnam/1203/04 H5 HA tenderar att fälla), men kan förhindras genom snabb och fullständig buffertutbyte till PBS. Rekommenderas inte lagring av proteiner i imidazol-innehållande elutionsbuffert. Proceduren rening från skörd till den frysning av alikvoter till -80 ° C bör utföras inom en arbetsdag och lagring av renat protein till annat än -80 ° C temperaturer bör undvikas. Dessutom har upprepade frys-tö-cykler visat sig inverka negativt på stabiliteten i vissa epitoper 1.
_content "> Avkastningen bör förväntas vara i intervallet 0,2 till 30 mg / L kultur. Många HAR uttrycka i det övre intervallet medan programkontoren har en tendens att uttrycka på lägre nivåer. Även uttrycksnivåer för HAR tycks korrelera omvänt med antalet av glykosyleringsplatser. har från mänsklig säsongs H3N2 och säsongs Prepandemic H1N1 isolerar vanligtvis visar låga nivåer, medan de flesta har av fågelinfluensaviruset ursprung har höga uttrycksnivåer. För att förbättra uttryck rekommenderas att öka celltätheten i kolven eller att försöka att använda mindre eller mer arbets lager per uttryck. 10-faldig ökning eller minskning av arbets lager kan ha en positiv inverkan på uttrycksnivåer. En annan faktor som kan påverka uttrycksnivåer är tiden mellan smitta och skörd. 96 timmar är idealiska för de flesta har och NAs men kortare inkubationstider kan faktiskt öka avkastningen av vissa proteiner.Insektsceller kan utföra posttranslationella modifieringar i en nästan däggdjurn-liknande sätt och har möjlighet att vika mycket komplexa proteinstrukturer med liknande effektivitet som däggdjursceller (men producerar högre utbyten). I termer av glykosylering, uppvisar de ett mönster som skiljer sig något från däggdjursceller och har mestadels paucimannosidic N-glykaner som saknar sialinsyra ändringar 19. Emellertid insektscellinjer som har modifierats för att producera däggdjursliknande glykosylering (inkluderande terminal sialinsyra) är kommersiellt tillgängliga 14.
The baculovirus-expressionssystem är ett extremt användbart verktyg för expression av de rekombinanta influensavirus ytglykoproteiner - HA och NA. Dessa rekombinanta proteiner används för många immunologiska och biokemiska analyser, såväl som för standardisering av antigeninnehåll av vacciner och som antigen för vaccineringsexperiment i djurmodeller. Baculovirus-uttryckte HA och NA uppvisar fullständig biologisk funktion och korrekt veckning om det uttrycks i ram med trimerizatipå och tetramerisation domäner respektive. Detta skiljer dem från bakterier uttryckt har som är icke-glykosylerat och saknar funktionella epitoper i stjälken domänen. Dessutom utställningar baculovirusexpressionssystem betydligt högre protein avkastning än däggdjurscellsystem 26 och hantering och uppskalning är lättare. Sammanfattningsvis beskriver vi ett enkelt och effektivt protokoll för att uttrycka stora mängder av rekombinant influensavirus HA och NA-molekyler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har ingenting att lämna ut.
Acknowledgments
Vi vill tacka Patrick C. Wilson för monoklonal antikropp CR9114. Vi tackar även Jennifer Debeauchamp och Richard Webby för de ursprungliga A/Anhui/1/13 plasmider. Delvis stöd för detta arbete lämnades av det nationella institutet för allergi och infektionssjukdomar-finansierade programmet Project Grant AI097092-01A1 och CEIRS (Centers of Excellence för influensa forskning och övervakning, HHSN26620070010C). FK fick stöd av ett Erwin Schrödinger gemenskap (J 3232) från den österrikiska Science Fund (FWF).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Bac-to-Bac Baculovirus expression system | Invitrogen | 10359-016 | Follow manufacturer's instructions |
| TNM-FH insect medium | Gemini Bioproducts | 600-311 | |
| HyClone SFX-Insect | Thermo Fisher | SH30278.02 | |
| Cellfectin II Reagent | Invitrogen | P/N58760 | |
| Pluronic F68 | Sigma | 1000702664 | |
| SimplyBlue SafeStain | Invitrogen | LC6060 | |
| Ni-NTA Agarose | Qiagen | 1018240 | |
| Amicon Ultra Centrigual filters Ultracel 30K | Millipore | UFC902024 | |
| Pen Strep | Gibco | 15140-122 | |
| Polypropylene Columns (5 ml) | Qiagen | 34964 | |
| Max efficiency DH10Bac bacteria | Invitrogen | 10361-012 | |
| PureLink HiPure Plasmid Filter Midiprep Kit | Invitrogen | K210015 | |
| Imidazole | Sigma-Aldrich | I2399-100G | for elution and wash buffers |
| Sf9 cells | ATCC | CRL-1711 | |
| High Five cells | Invitrogen | B85502 |
References
- Krammer, F., et al. A carboxy-terminal trimerization domain stabilizes conformational epitopes on the stalk domain of soluble recombinant hemagglutinin substrates. PLoS One. 7, e43603 (2012).
- Krammer, F., Pica, N., Hai, R., Margine, I., Palese, P. Chimeric hemagglutinin influenza virus vaccine constructs elicit broadly-protective stalk-specific antibodies. J. Virol. , (2013).
- Leyva-Grado, V. H., Mubareka, S., Krammer, F., Cárdenas, W. B. Influenza virus infection in Guinea pigs raised as livestock, ecuador. Emerg. Infect. Dis. 18, 1135-1138 (2012).
- Margine, I., et al. H3N2 influenza virus infection induces broadly reactive hemagglutinin stalk antibodies in humans and mice. J. Virol. , (2013).
- Miller, M. S., et al. 1976 and 2009 H1N1 Influenza Virus Vaccines Boost Anti-Hemagglutinin Stalk Antibodies in Humans. J. Infect. Dis. 652, (1976).
- Pica, N., et al. Hemagglutinin stalk antibodies elicited by the 2009 pandemic influenza virus as a mechanism for the extinction of seasonal H1N1 viruses. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, 2573-2578 (2012).
- Sangster, M. Y., et al. The B cell response and hemagglutinin stalk-reactive antibody production in different age cohorts following 2009 H1N1 influenza vaccination. Clin. Vaccine Immunol. , (2013).
- Tan, G. S., et al. A pan-h1 anti-hemagglutinin monoclonal antibody with potent broad-spectrum efficacy in vivo. J. Virol. 86, 6179-6188 (2012).
- Ekiert, D. C., et al. Antibody recognition of a highly conserved influenza virus epitope. Science. 324, 246-251 (2009).
- Xu, X., Zhu, X., Dwek, R. A., Stevens, J., Wilson, I. A. Structural characterization of the 1918 influenza virus H1N1 neuraminidase. J. Virol. 82, 10493-10501 (2008).
- Stevens, J., et al. Structure of the uncleaved human H1 hemagglutinin from the extinct 1918 influenza virus. Science. 303, 1866-1870 (2004).
- Wei, C. J., et al. Comparative efficacy of neutralizing antibodies elicited by recombinant hemagglutinin proteins from avian H5N1 influenza virus. J. Virol. 82, 6200-6208 (2008).
- Krammer, F., et al. Trichoplusia ni cells (High Five) are highly efficient for the production of influenza A virus-like particles: a comparison of two insect cell lines as production platforms for influenza vaccines. Mol. Biotechnol. 45, 226-234 (2010).
- Palmberger, D., et al. Insect cells for antibody production: evaluation of an efficient alternative. J. Biotechnol. 153, 160-166 (2011).
- Santiago, F. W., Lambert Emo, K., Fitzgerald, T., Treanor, J. J., Topham, D. J. Antigenic and immunogenic properties of recombinant hemagglutinin proteins from H1N1 A/Brisbane/59/07 and B/Florida/04/06 when produced in various protein expression systems. Vaccine. 30, 4606-4616 (2012).
- Wrammert, J., et al. Broadly cross-reactive antibodies dominate the human B cell response against 2009 pandemic H1N1 influenza virus infection. J. Exp. Med. 208, 181-193 (2011).
- Treanor, J. J., et al. Protective efficacy of a trivalent recombinant hemagglutinin protein vaccine (FluBlok) against influenza in healthy adults: a randomized, placebo-controlled trial. Vaccine. 29, 7733-7739 (2011).
- Dalakouras, T., Smith, B., Platis, D., Cox, M., Labrou, N. Development of recombinant protein-based influenza vaccine. Expression and affinity purification of H1N1 influenza virus neuraminidase. J. Chromatogr. A. 1136, 48-56 (2006).
- Krammer, F., Grabherr, R. Alternative influenza vaccines made by insect cells. Trends Mol. Med. 16, 313-320 (2010).
- Gao, R., et al. Human Infection with a Novel Avian-Origin Influenza A (H7N9) Virus. N. Engl. J. Med. , (2013).
- Goff, P. H., et al. Induction of cross-reactive antibodies to novel H7N9 influenza virus by recombinant Newcastle disease virus expressing a North American lineage H7 subtype hemagglutinin. J. Virol. , (2013).
- Weldon, W. C., et al. Enhanced immunogenicity of stabilized trimeric soluble influenza hemagglutinin. PLoS One. 5, (2010).
- Dreyfus, C., et al. Highly conserved protective epitopes on influenza B viruses. Science. 337, 1343-1348 (2012).
- Steel, J., et al. Live attenuated influenza viruses containing NS1 truncations as vaccine candidates against H5N1 highly pathogenic avian influenza. J. Virol. 83, 1742-1753 (2009).
- Fouchier, R. A., et al. Avian influenza A virus (H7N7) associated with human conjunctivitis and a fatal case of acute respiratory distress syndrome. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 1356-1361 (2004).
- Kost, T., Condreay, J., Jarvis, D. Baculovirus as versatile vectors for protein expression in insect and mammalian cells. Nat. Biotechnol. 23, 567-575 (2005).
