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Biology

고해상도 용융 분석과 PCR을 이용하여 신속하고 효율적인 Zebrafish의 유전자형

doi: 10.3791/51138 Published: February 5, 2014

Summary

고해상도 용융 분석 (르마)와 함께 PCR은 제브라 피쉬의 유전자형에 신속하고 효율적인 방법으로 보여줍니다.

Abstract

제브라 피쉬는, 개발을 공부하는 질병을 모델링하고, 약물 검사를 수행하기위한 강력한 척추 동물 모델 시스템입니다. 최근 유전 도구의 다양한 돌연변이를 유도하고 유전자 변형 라인을 생성하기위한 여러 전략을 포함하여, 도입되었습니다. 그러나, 대규모 스크리닝은 시간 소모적이고 노동 집약적이다 전통적인 유전자형 방법에 의해 제한된다. 여기에서 우리는 고해상도 융점 분석 (르마)와 결합 PCR 기준 지브라 피쉬 유전자형을 분석하는 기술을 설명한다. 이 방법은 오염 유물의 낮은 위험과 함께, 빠른 민감하고 저렴합니다. 르마와 PCR에 의한 유전자형 높은 처리량 검사 프로토콜에 포함, 배아 또는 성인 물고기에 사용할 수 있습니다.

Introduction

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제브라 피쉬 (다니오 rerio)는 널리 개발 및 질병 모델링 연구에 사용되는 척추 동물 모델 시스템입니다. 최근 다수의 형질 전환 및 돌연변이 기술은 제브라 피쉬 위해 개발되었습니다. 일반적 Tol2 트랜스포존 시스템 (1)에 기초하여 피드 형질 전환 기술은, 다 DNA 단편 조립체이 향상된 복제 옵션과 결합되었다. 아연 핑거 뉴 클레아 제 (ZFNs) 및 전사 활성제와 같은 이펙터 클레아 제 (TALENs)는 제브라 피쉬 3,4 모두 체세포와 생식 세포의 유전자 좌를 대상으로 사용되어왔다. 이 기술은 효율적으로 고주파 돌연변이 생성 및 세균 선 전송 3,4로, 유전자 변형 동물을 생성 할 수 있습니다.

이러한 발전에도 불구하고, 제브라 피쉬의 전통 유전자형 기술은 돌연변이 유발 및 형질 전환 도구의 모든 기능을 제한합니다. PCR은 때때로 restrictio 결합, 전기 영동 한 다음N 효소 소화가 널리 유전체 변형을 검출하기 위해 사용되지만, 시간 소모 및 작은 삽입 또는 삭제를 식별에 덜 민감하다. 의 TaqMan 프로브 분석은 높은 초기 비용을 가지고주의 최적화를 필요로합니다. PCR 제품의 시퀀싱은 며칠이 걸릴 대규모 검열을위한 실용적되지 않습니다 수 있습니다. 제한 단편 길이 다형성 (RFLP) 분석에만 제한 효소 인식 부위의 제한된 범위에 영향을주지의 SNP를 구별 할 수있다.

고해상도 녹는 분석 (르마), 폐 튜브 후 PCR 분석 방법은, 빠른 민감한, 저렴하고, 다수의 샘플을 심사하는 의무가 최근에 개발 된 방법이다. 르마는 SNP를, 돌연변이, 및 5-7 전이 유전자를 검출하는데 사용될 수있다. 르마는 이중 가닥의 DNA의 열 변성을 기준으로, 각각의 PCR 증폭 물이 특징 독특한 해리 (용융) 5을 가지고 있습니다. 샘플로 인해 T를 구별 할 수 있습니다O 서로 다른 염기 조성, GC 함량, 또는 길이는 일반적으로 형광 염료와 함께 만 이중 가닥 DNA (8)를 결합하는. 따라서, 르마는 다른 용융 곡선의 특성에 따라 서로 다른 유전자형을 구별 할 수 있습니다. 르마 저가의 시약을 사용하여 단일 단계 후 PCR 과정이므로, 높은 처리 전략을 위해 사용될 수있다. 르마 그래서 분석 다음 PCR 증폭 산물이 다른 애플리케이션에 사용될 수 있고, 비파괴이다. 르마 세포주, 마우스 및 인간 9-11 포함하여 많은 유기체 및 시스템에 적용되어왔다. 그것의 사용은 최근 징크 핑거 클레아 (ZFNs) 및 TALENs 6,12,13 의해 유도 돌연변이를 검출하기 위해 제브라 피쉬 설명되었다.

이 논문에서, 우리는 (그림 1) 배아와 성인 제브라 피쉬의 PCR 기반 르마을 수행하는 방법에 대해 설명합니다. 이 프로토콜은시를 포함하여, SNP를, 도입 유전자, 돌연변이를 검출하기에 적합하다ngle 기본 쌍 변경, 삽입, 또는 삭제.

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Protocol

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1. DNA 준비

  1. 50 mM의 KCl을 10 mM 트리스 - 염산 pH를 8.3, 0.3 % 트윈 20, 0.3 % NP40 : DNA의 용해 버퍼를 준비한다. 사용 12 일에 1 ㎎ / ㎖의 최종 농도로 신선한 테 K 추가.
  2. 조직 컬렉션 :
    1. 성인 물고기 지느러미 클립 :
      1. 물고기를 마취 : 0.004 % MS-222 (tricaine) 솔루션의 물고기를 놓습니다. 아가미의 움직임이 둔화 될 때까지 기다립니다.
      2. 5-10 킴 와이프의 스택에 물고기를 넣고 멸균 면도날와 꼬리 지느러미, 2 ~ 3 mm의 작은 조각을 잘라.
      3. 신속하게 복구를 위해 신선한 물을 표시 탱크에 물고기를 배치, 조심스럽게 핀 클립을 포함 할 탱크와 해당 관을 모두 레이블을 붙입니다. 물을 변경하고 매일 물고기를 먹이.
      4. 멸균 피펫 팁과 핀 클립을 선택하고 100 ㎕의 DNA 용해 버퍼로 채워진 튜브로 전송할 수 있습니다.
      5. 피펫 팁을 폐기하고, 날카로운 물건 용기에 면도날을 버린다.
    2. 배아의 꼬리 클립 :
      1. 0.004 % MS-222 (tricaine) 솔루션으로 배아를 놓습니다. 2 분을 기다립니다.
      2. 해부 현미경 집게로 꼬리의 조각을 잘라.
      3. 30 μL의 DNA 용해 버퍼 가득 레이블 튜브에 꼬리를 넣습니다.
      4. 신속하게 100 ㎕의 4 % 파라 포름 알데히드를 포함하는 튜브에 배아를 넣어.
      5. 배아 및 해당 꼬리 튜브 라벨 튜브.
      6. 고정 용 4 ° C에서 하룻밤에 배아와 튜브를 저장합니다.
      7. 오염을 최소화하기 위해 각 배아 사이에 밀리 Q 물과 킴 와이프를 사용하여 집게를 청소합니다.
    3. 전체 배아의 경우 :
      1. 0.004 % MS-222 (tricaine) 솔루션으로 배아를 놓습니다. 2 분을 기다립니다.
      2. 100 ㎕의 DNA 용해 버퍼로 채워진 튜브에 1-5 배아를 넣어. Dechorionation 필요가 없습니다.
  3. DNA 소화
    55 ° C에서 조직 (지느러미 또는 꼬리 클립 또는 태아)와 튜브를 품어밤새 12 4 시간 최대를위한.
  4. 테 K에게 비활성화
    15 분 12 ~ 95 ° C의 열 관. DNA는 바로 PCR에 사용, 또는 최대 3 개월 동안 -20 ° C에서 보관해야합니다.

2. PCR

  1. 디자인 프라이머 수동 또는 프라이머 설계 소프트웨어 (예 : Lightscanner 뇌관 디자인 소프트웨어 Biofire)에 의해. 르마위한 PCR 제품은 일반적으로 50-200 염기쌍이며 SNP 검출을위한 PCR 제품은 작고, 50-80 염기쌍이어야한다.
  2. PCR
    1. 96도 또는 384 - 웰 플레이트에서 PCR 반응을 수행합니다.
    2. 10 ㎕의 전체 볼륨을 사용하여 4 μL의 LightScanner 마스터 믹스 (0.1 U 핫 시작의 Taq-AB 중합 효소, 버퍼, 0.2 밀리미터의 dNTPs, 2 mM의 염화 마그네슘 및 1X 형광 이중 가닥 DNA 결합 염료), 5 pmol의 각 프라이머, 성인 꼬리 지느러미 또는 배아의 꼬리 (13)로부터 3 ㎕의 게놈 DNA 추출 1 ㎕의 게놈 DNA 템플릿.
    3. 30 ㎕의 미네랄 오일을 커버 샘플. 광학적으로 투명 접착 씰 플레이트를 커버.
    4. PCR 순환 상태 전형적인 조건은 95 ° C에서 5 분 10 초 30주기를 95 ° C이다 최적화, 60 ° C에서 25 초, 72 ° C에서 30 초, 30 초 동안 95 ° C로 끝나는로 냉각 15 ° C.
    5. 스토어 PCR의 4 ° C에서 접시 또는 르마로 직접 진행합니다.
    6. PCR의 초기 최적화 동안 아가 로스 겔 전기 영동을 사용하여 크기를 분석하여 우리의 PCR 생성물을 확인하고, 상기 PCR 생성물의 서열 분석에 의해, 표시하는 경우.

3. 르마

  1. 열 플레이트
    1. 용융 분석 시스템에서 접시를 놓습니다.
    2. (LightScanner 소프트웨어는 전화-IT 2.0) 소프트웨어를 엽니 다.
    3. 60 ~ 95 ° C.의 열 플레이트
    4. 새 데이터 저장소 파일을 만듭니다.
  2. 르마 데이터를 분석 (그림 2).
    분석의 여러 단계가 가능합니다. 우리는 데이터 m의 가장 일반적으로 사용되는 세트를 보여anipulations.
    1. 부분적인 설정
      부분의 탭을 클릭합니다. 샘플 우물을 선택합니다.
    2. 표준화
      1. 왼쪽 패널의 표준화 탭을 선택합니다. 형광 분산을 제거하려면 수동으로 사전 (초기)의 병렬 더블 라인을 배치하고 후 (최종) - 용융 영역 (그림 2C, 화살촉) 그림과 같이 1과 0으로 모든 샘플의 premelt 및 사후 용융 형광 신호를 정상화 각각 14.
      2. 용융 영역 전후 멜트 라인 사이의 영역에 있지만, 선택되지 않도록 라인의 위치를​​ 조정한다. 일반적으로, 낮은 최소 및 낮은 최대 (어퍼 최소 어퍼 최대) 온도 선이 떨어져 약 1 ° C를 배치해야합니다.
      3. 정상화 온도 위치를 선택 모든 샘플 (premelt 지역 및 최소 또는 후 용융 지역 없음 (0 %) 형광의 최대 또는 전체 (100 %)의 형광을 갖도록 POS 최선으로sible). 정규화는 융점과 0의 최소 형광의 융점부터 다음 수평에 가까운 라인까지 연장되어 하나의 형광 극대에서 거의 수평 라인 초래한다 상기 1 또는 0 아래 형광 수준이 없어야 . 예를 들어,도 2c에, 79-80 ° C.의 온도 범위를 사용 premelting 곡선을 정상화
    3. 그룹화 / 클러스터링
      녹는 온도 (그림 2C, 녹색 상자)을 기반으로 유전자형을 구분합니다. 그룹화를 선택합니다.
      1. 그룹화 섹션의 표준 선택 목록에서 Autogroup을 선택합니다.
      2. 그룹화 섹션에서 감도 선택 목록에서 각각 하나의 전환 또는 다수의 전환과 프로필을 용융 보통 또는 높음을 선택합니다.
      3. 선택 계산그룹화 섹션에서 그룹.
      4. 파일 메뉴로 이동하고 결과를 저장하려면 저장을 클릭합니다.

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Representative Results

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프로토콜 (작업의 흐름도는도 1에 도시 됨) 며칠 동안 하루 동안 수행 또는 단계로 분리 될 수있다. DNA 추출은 PCR 증폭 산물의 용해 및 분석을 따른다. 앰플 리콘의 용융의 온도는 크기와 GC-내용에 따라 다르지만 일반적으로 시작하고 50 ˚ C ~ 95 ˚ C의 최종 온도 (그림 2A와 2B)에 적합합니다. 용융물이 수행되면, 형광 용융 곡선의 분석은 일반적으로 사용 전후의 용융 영역을 기준 (도 2C)로, 다양한 샘플 커브의 변화의 정상화를 필요로한다. 이 형광의 변화가 작은 실험의 변화와 관련이있는 다른 샘플 결과의 비교를 향상시킵니다. 정상화 온도 라인의 각 쌍 (그림 2C, 화살촉) 약 1 ˚ C 떨어져 배치해야합니다.용융 곡선의 프로파일을 도시 상부 그래프와 기준 샘플 (도 2D)에 비해 트랙 티브 차이를 보여주는 도면 하부의 그래프 :; 데이터 결과의 그룹핑은 두 가지 방법으로 표현된다.

르마 분석은 돌연변이 (도 3a 및도 3b) 또는 트랜스 진 (도 3c)를 검출하는데 사용될 수있다. 도 3a에서, eif2b5 유전자의 두 가지 다른 돌연변이는 야생형 샘플의 정규화 된 형광 데이터를 감산하여 (도 3a에서 적색 및 청색 곡선)을 나타낸다. 그것은 유전자형는 참조 용으로 선택되는 문제가되지 않습니다. 용융 곡선의 미묘한 또는 혼란 차이는 감산 차이 플롯을 사용하여 구별 할 수 있습니다. 도 3b에서, 배아의 단일 컬렉션에서 네 가지 유전자형의 일례가 도시된다.

그림 1 그림 1. 제브라 피쉬의 게놈 DNA의 PCR 기반 르마을위한 프로토콜의 개요가. 전체 조직 (핀 클립 또는 배아)에서 DNA 추출은 형광 이중 가닥 DNA 결합 염료의 존재 PCR 증폭옵니다. PCR 증폭 물이 변성하고 형광 신호는 증폭 물을 검출 및 / 또는 유전자형을 구별하기 위해, 용융 곡선 분석 한 후, 기록된다.

그림 2
그림 2. 르마을 수행하고 결과를 분석하는 소프트웨어의 스크린 샷.. LightScanner 소프트웨어의 스크린 샷;. 노란색 상자가 "B"로 확대됩니다 B. "A"에 박스 영역의보기를 확대. 시작 및 종료 온도를 설정하면 (화살표). C 표시됩니다. premelt 및 정상화 후 용융 평행선 (화살촉)를 배치합니다. 사전 및 사후 용융 영역 (빨간색 상자)에서 형광의 변화를 알 수 있습니다. 아래 그래프 (녹색 상자) 정상화. D 다음과 같은 원시 데이터 그림에서 파생 된 용융 곡선을 보여줍니다. 위 그래프 쇼는 자동으로 그룹화 한 후 곡선 프로파일을 녹여, 다른 유전자형은 다른 색 (빨간색 상자)에 도시되어있다. 아래 그래프 (녹색 상자)는 형광 차이 곡선을 보여줍니다. 더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3
그림 3. HR을 사용하여. 돌연변이 형질 전환 유전자를 식별하는 MA는 형광 차이 곡선이 표시되며, 형광의 변화 (y 축) 온도 (x 축) 표시됩니다.. 르마는 eif2b5 유전자에 돌연변이를 운반 물고기를 검출하기 위해 사용 하였다. 야생 유형은 회색 (화살표)에 표시됩니다. 빨간색과 파란색 색상은 PCR 제품입니다. B의 순서에 의해 확인 두 개의 서로 다른 eif2b5 돌연변이를 나타냅니다. 네 가지 FOXP2의 돌연변이 대립 유전자는 르마로 식별됩니다. 레드 : zc82 / + (8 BP 삭제), 녹색 : zc83 / + (17 bp의 삭제), 파랑 : zc82/zc83 (대비 8bp deletion/17bp 삭제), 회색 :. zc83/zc83 (17bp 삭제 동형 접합자) C. GAL4 형질 전환 어류 (회색 곡선) 야생형 (갈색 곡선, 화살표)를 구별 할 수 있습니다. 유전자 검출을 위해, 정규화가 수행 할 수 없습니다 것을 알 수 있습니다. 더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오.

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Discussion

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르마와 함께 PCR은 제브라 피쉬의 유전자형을위한 강력한 기술입니다. 이 방법의 장점은 그것의 속도, 신뢰성, 및 심지어 점 돌연변이를 검출 감도이다. 전체 프로토콜은, 지느러미 클립에 용융 곡선 분석에서, 한 개인에 의해 8 시간 이내에서 수행 할 수 있습니다. 또한, 기술은 높은 처리량 스크리닝 의무이다 티듐 브로마이드의 사용을 필요로하지 않으며, 오염 문제를 최소화 할 수있는 모든 PCR 및 분석 단계는 밀봉된다.

이 기술에 대한 중요한 단계 PCR 증폭 물과 프라이머 디자인입니다. 르마의 PCR 제품의 일반적인 길이는 50 ~ 200 BP입니다. 짧은 증폭 산물은 감도를 증가 및 단일 염기 변화를 감지에 이상적입니다. 프로브; 밀접한 관련 PCR 생성물 종의 용융 곡선이 쉽게 구별 될 수없는 경우에, SNP 상보 및 3 '말단에서 차단 작은 올리고 뉴클레오티드는 PCR 반응 (Lunaprobes에 포함될 수있다들). 프로브는 전방의 상이한 농도를 사용하여 비대칭 PCR에 의해 생성하고 후속 르마 PCR에서 프로브 확장을 방지하기 위해 3 'C3의 차단제와 역방향 프라이머된다. 프로브는 다음 르마 PCR 반응에 포함되어 있습니다. 르마는 비대칭 프로브는 PCR 생성물에 결합하고 대립 유전자를 구별하는 데 사용할 수있는 다른 용융 곡선과 프로브 - 표적 이합체를 생성하는 프로브와 함께 발생한다.

몇몇 회사는 용융 곡선 분석 시스템을 제공합니다. 이들은 Biofire Lightscanner, 로슈 LightcyclerVR 480 키아 회 - 유전자 Q. 여러 형광 DNA 결합 염료 LC 그린 플러스와 SYTO9의 EvaGreen 포함, 사용할 수 있습니다. 다른 형광 염료 및 용융 곡선 기계 8,15에 따라 돌연변이 검출 감도에 약간의 차이가 있습니다. 염료를 Nonsaturating, 예를 들어, SYBR 녹색 나는 가장 르마 애플리케이션에 적합하지 않다 : 높은 농도에서, SYBR 녹색 나는 inhibiDNA 중합 효소의 활동 TS하고, 낮은 농도에서 SYBR 녹색 정확하게 인해 다시 dsDNA (16)의 영역에 녹아 지역에서의 재분배에 용융 거동을 측정 할 수 없습니다. 일반적으로 대부분의 기존 리얼 타임 PCR 플랫폼은 소프트웨어 패키지에 추가하고 제 2 세대의 형광 DNA 결합 염료를 사용하여 르마을 미리 형성 할 수있다. 실험 단계의 소프트웨어 및 시퀀스의 기술적 인 세부 사항은 플랫폼간에 약간 다를 수 있지만, 전반적인 과학적 개념은 본질적으로 동일하다.

본 연구실 및 기타 르마가 도입 유전자를 검출하기 위해 두 배아 및 성체 제브라 피쉬에서 사용할 수 있음을 입증하고, 돌연변이 ZFNs 및 TALENs 6,12,13 의해 유도. 르마는 제브라 피쉬 6,12에서 다형성을 발견하는 데 사용되었습니다. 우리 연구실은 TALEN 유발 돌연변이의 초기 검사뿐만 아니라 설립 라인 (게시되지 않은 TSQ 및 JLB)의 정렬에 두 르마를 사용합니다. 다른 잠재적 인 입학 원서및 vivariums 18 병원체 검출, 제브라 피쉬에 적용 할 수있는 이온은 메틸화에 민감한 르마 (MS-르마) 17 복사 수를 정량화 5 변종이 (가) 있습니다.

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Disclosures

저자가 공개하는 게 없다.

Acknowledgments

우리는 조언과 기술 지원에 대한 Blaschke, Grunwald가, 그리고 비트 버 실험실의 구성원을 감사드립니다. 이 작품은 JLB에 PCMC 재단, NIH R01 MH092256와 DP2 MH100008, 그리고 천 재단 연구 보조금 # 1 - 2013 년 - 425 년 3 월에 의해 지원된다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
100 Reaction LightScanner Master Mix BioFire HRLS-ASY-0002 www.biofiredx.com
Hard-Shell PCR 96-well BLK/WHT Plates Bio-Rad Laboratories HSP9665 www.bio-rad.com
Microseal 'B' Adhesive Seals Bio-Rad Laboratories MSB1001 www.bio-rad.com
96-well LightScanner Instrument BioFire LSCN-ASY-0040 www.biofiredx.com
LightScanner Software with Call-IT 2.0 BioFire www.biofiredx.com
High-resolution Melting Analysis 2.0 BioFire www.biofiredx.com
LightScanner Primer Design Software BioFire www.biofiredx.com
Vector NTI Software Invitrogen www.invitrogen.com
Tricaine
Paraformaldehyde

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References

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Xing, L., Quist, T. S., Stevenson, T. J., Dahlem, T. J., Bonkowsky, J. L. Rapid and Efficient Zebrafish Genotyping Using PCR with High-resolution Melt Analysis. J. Vis. Exp. (84), e51138, doi:10.3791/51138 (2014).More

Xing, L., Quist, T. S., Stevenson, T. J., Dahlem, T. J., Bonkowsky, J. L. Rapid and Efficient Zebrafish Genotyping Using PCR with High-resolution Melt Analysis. J. Vis. Exp. (84), e51138, doi:10.3791/51138 (2014).

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