Summary
उच्च संकल्प पिघल विश्लेषण (HRMA) के साथ संयुक्त पीसीआर zebrafish जीनोटाइप के लिए एक तेजी से और कुशल तरीके के रूप में प्रदर्शन किया है.
Abstract
Zebrafish, विकास का अध्ययन रोग मॉडलिंग, और दवा स्क्रीनिंग के प्रदर्शन के लिए एक शक्तिशाली हड्डीवाला मॉडल प्रणाली है. हाल ही में आनुवंशिक उपकरणों की एक किस्म म्यूटेशन उत्प्रेरण और ट्रांसजेनिक लाइनों पैदा करने के लिए कई रणनीतियों सहित, शुरू किया गया है. हालांकि, बड़े पैमाने पर प्रदर्शन समय लेने वाली और श्रम प्रधान हैं जो पारंपरिक जीनोटाइपिंग तरीकों, द्वारा सीमित है. यहाँ हम उच्च संकल्प पिघलने विश्लेषण (HRMA) के साथ संयुक्त पीसीआर द्वारा zebrafish जीनोटाइप का विश्लेषण करने के लिए एक तकनीक का वर्णन. यह दृष्टिकोण संदूषण कलाकृतियों के कम जोखिम के साथ, तेजी से, संवेदनशील, और सस्ती है. HRMA साथ पीसीआर द्वारा जीनोटाइपिंग उच्च throughput प्रदर्शन के प्रोटोकॉल में शामिल है, भ्रूण या वयस्क मछली के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
Introduction
Zebrafish (Danio rerio) व्यापक रूप से विकास और रोग मॉडलिंग के अध्ययन के लिए इस्तेमाल एक हड्डीवाला मॉडल प्रणाली है. हाल ही में, कई ट्रांसजेनिक और उत्परिवर्तन प्रौद्योगिकियों zebrafish के लिए विकसित किया गया है. आमतौर पर एक Tol2 transposon प्रणाली 1 पर आधारित रैपिड transgenesis तकनीक, कई डीएनए टुकड़ा विधानसभा 2 में सुधार के लिए क्लोनिंग विकल्प के साथ संयुक्त कर दिया गया है. जस्ता उंगली न्युक्लिअसिज़ (ZFNs) और प्रतिलेखन उत्प्रेरक की तरह प्रेरक न्युक्लिअसिज़ (TALENS) zebrafish 3,4 में दोनों दैहिक और germline कोशिकाओं में loci लक्षित करने के लिए इस्तेमाल किया गया है. इन तकनीकों में कुशलता से उच्च आवृत्ति उत्परिवर्तन निर्माण और रोगाणु लाइन प्रसारण 3,4 के साथ, आनुवंशिक रूप से संशोधित पशुओं उत्पन्न कर सकते हैं.
इन अग्रिमों के बावजूद, zebrafish में पारंपरिक जीनोटाइपिंग तकनीक mutagenesis और transgenesis उपकरणों की पूरी शक्ति की सीमा. पीसीआर कभी कभी restrictio के साथ संयुक्त, जेल वैद्युतकणसंचलन द्वारा पीछाn एंजाइम पाचन, व्यापक रूप से जीनोम संशोधन का पता लगाने के लिए किया जाता है, लेकिन समय लेने वाली और छोटे सम्मिलन या विलोपन की पहचान करने के लिए कम संवेदनशील है. TaqMan जांच assays के उच्च प्रारंभिक लागत है और सावधान अनुकूलन की आवश्यकता है. पीसीआर उत्पादों का अनुक्रमण कई दिनों लेने के लिए और बड़े पैमाने पर प्रदर्शन के लिए व्यावहारिक नहीं है सकते हैं. प्रतिबंध टुकड़ा लंबाई बहुरूपता (RFLP) विश्लेषण केवल प्रतिबंध एंजाइम मान्यता साइटों की एक सीमित रेंज को प्रभावित करने SNPs भेदभाव कर सकते हैं.
उच्च संकल्प पिघलने विश्लेषण (HRMA), एक बंद ट्यूब बाद पीसीआर विश्लेषण विधि, तेजी से, संवेदनशील, सस्ती, और नमूनों की बड़ी संख्या स्क्रीनिंग के लिए उत्तरदायी है कि हाल ही में विकसित विधि है. HRMA SNPs, परिवर्तन, और transgenes 5-7 पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. HRMA डबल असहाय DNAs की थर्मल विकृतीकरण पर आधारित है, और प्रत्येक पीसीआर amplicon विशेषता एक अनूठा हदबंदी (पिघल) 5 है. नमूने के कारण टी भेदभाव किया जा सकताहे उनके अलग न्यूक्लियोटाइड रचना, जीसी सामग्री, या लंबाई, आम तौर पर एक फ्लोरोसेंट डाई के साथ संयोजन में केवल डबल असहाय डीएनए 8 बांधता है. इस प्रकार, HRMA अलग पिघल वक्र विशेषताओं के आधार पर अलग जीनोटाइप भेद कर सकते हैं. HRMA कम लागत अभिकर्मकों का उपयोग करता है और एक भी कदम के बाद पीसीआर प्रक्रिया है, क्योंकि यह उच्च throughput रणनीतियों के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. HRMA तो विश्लेषण के बाद पीसीआर amplicons अन्य अनुप्रयोगों के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, nondestructive है. HRMA सेल लाइनों, चूहों, और मनुष्य 9-11 सहित कई जीवों और प्रणालियों, में लागू किया गया है. इसके प्रयोग हाल ही में जस्ता उंगली न्युक्लिअसिज़ (ZFNs) और TALENS 6,12,13 से प्रेरित उत्परिवर्तन का पता लगाने के zebrafish में वर्णित किया गया है.
इस पत्र में, हम (चित्रा 1) भ्रूण और वयस्क zebrafish में पीसीआर आधारित HRMA प्रदर्शन करने के लिए क्या करते हैं. इस प्रोटोकॉल सी सहित SNPs, transgenes, और परिवर्तन का पता लगाने के लिए उपयुक्त हैngle आधार जोड़ी परिवर्तन, सम्मिलन, या विलोपन.
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Protocol
1. डीएनए की तैयारी
- 50 मिमी KCl, 10 मिमी Tris-एचसीएल पीएच 8.3, 0.3% के बीच 20, 0.3% NP40: डीएनए lysis बफर तैयार करें. प्रयोग 12 के दिन 1 मिलीग्राम / एमएल के एक अंतिम एकाग्रता के लिए ताजा proteinase कश्मीर जोड़ें.
- ऊतक संग्रह:
- वयस्क मछली पंख क्लिप के लिए:
- मछली anesthetize: 0.004% एमएस-222 (tricaine) समाधान में मछली रखें. गिल आंदोलन धीमा कर देती है जब तक प्रतीक्षा करें.
- 5-10 Kimwipes के ढेर पर मछली रखो और एक बाँझ धार के साथ पूंछ पंख, के बारे में 2-3 मिमी, का एक छोटा सा टुकड़ा काट.
- जल्दी ठीक होने के लिए ताजा पानी के साथ एक लेबल टैंक में मछली जगह है, ध्यान से पंख क्लिप शामिल होंगे कि टैंक और इसी ट्यूब दोनों लेबल. पानी बदलें और हर दूसरे दिन मछलियों को खाना खिलाना.
- एक बाँझ विंदुक टिप के साथ पंख क्लिप उठाओ और 100 μl डीएनए lysis बफर से भरा एक ट्यूब में स्थानांतरण.
- पिपेट टिप त्यागें, और एक तेजधार कंटेनर में धार त्यागें.
- भ्रूण पूंछ क्लिप के लिए:
- 0.004% एमएस-222 (tricaine) समाधान में भ्रूण रखें. 2 मिनट रुको.
- एक विदारक खुर्दबीन के नीचे संदंश के साथ पूंछ का एक टुकड़ा काट.
- 30 μl डीएनए lysis बफर से भरा एक लेबल ट्यूब में पूंछ रखो.
- जल्दी से 100 μl 4% paraformaldehyde युक्त ट्यूब में भ्रूण डाल दिया.
- भ्रूण और उनके इसी पूंछ ट्यूबों के साथ लेबल ट्यूबों.
- निर्धारण के लिए 4 डिग्री सेल्सियस रातोंरात पर भ्रूण के साथ ट्यूब की दुकान.
- प्रदूषण को कम करने के लिए प्रत्येक भ्रूण के बीच मिल्ली क्यू पानी और Kimwipes का उपयोग संदंश साफ करें.
- पूरे भ्रूण के लिए:
- 0.004% एमएस-222 (tricaine) समाधान में भ्रूण रखें. 2 मिनट रुको.
- 100 μl डीएनए lysis बफर से भरा एक ट्यूब में 1-5 भ्रूण रखो. Dechorionation आवश्यक नहीं है.
- वयस्क मछली पंख क्लिप के लिए:
- डीएनए पाचन
55 डिग्री सेल्सियस पर ऊतक (पंख या पूंछ क्लिप या भ्रूण) के साथ ट्यूब सेतेरात भर में 12 से 4 घंटे के लिए. - Proteinase कश्मीर निष्क्रिय
15 मिनट में 12 के लिए 95 डिग्री सेल्सियस तक गर्मी ट्यूब. डीएनए तुरंत पीसीआर के लिए इस्तेमाल किया, या अप करने के लिए 3 महीने के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जाना चाहिए.
2. पीसीआर
- डिजाइन प्राइमरों या तो स्वयं या प्रथम डिजाइन सॉफ्टवेयर (जैसे Lightscanner प्रथम डिजाइन सॉफ्टवेयर Biofire) द्वारा. HRMA के लिए पीसीआर उत्पादों को आम तौर पर 50-200 बी पी रहे हैं, SNP का पता लगाने के लिए पीसीआर उत्पादों छोटे, आमतौर पर 50-80 बी.पी. होना चाहिए.
- पीसीआर
- एक 96 अच्छी तरह से या 384 अच्छी तरह से थाली में पीसीआर प्रतिक्रिया प्रदर्शन करना.
- 10 μl कुल मात्रा का प्रयोग: 4 μl LightScanner मास्टर मिश्रण (0.1 यू गर्म शुरू Taq अटल बिहारी पोलीमर्स, बफर, 0.2 मिमी dNTPs, 2 मिमी मैग्नीशियम क्लोराइड, और 1x फ्लोरोसेंट डबल असहाय डीएनए बाध्यकारी डाई), 5 pmol प्रत्येक प्राइमर, और वयस्क पूंछ पंख या भ्रूण पूंछ 13 से 3 μl जीनोमिक डीएनए से निकाले 1 μl जीनोमिक डीएनए टेम्पलेट.
- 30 μl खनिज तेल के साथ कवर नमूनों. एक ऑप्टिकली पारदर्शी चिपकने वाला मुहर के साथ प्लेट कवर.
- पीसीआर साइकिल चालन की स्थिति विशिष्ट स्थितियों 95 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट और 10 सेकंड के 30 चक्र के लिए 95 डिग्री सेल्सियस हैं अनुकूलन, 60 डिग्री सेल्सियस पर 25 सेकंड, 72 डिग्री सेल्सियस पर 30 सेकंड, 30 सेकंड के लिए 95 डिग्री सेल्सियस के साथ समाप्त होने और ठंडा करने के लिए 15 डिग्री सेल्सियस
- स्टोर पीसीआर 4 डिग्री सेल्सियस पर प्लेटों या HRMA को सीधे जारी है.
- पीसीआर की प्रारंभिक अनुकूलन के दौरान agarose जेल वैद्युतकणसंचलन का उपयोग कर अपने आकार के विश्लेषण से हमारे पीसीआर उत्पाद की पुष्टि करें, और पीसीआर उत्पाद का अनुक्रमण द्वारा, संकेत दिया है.
3. HRMA
- गर्मी प्लेटें
- एक पिघल विश्लेषण प्रणाली में थाली प्लेस.
- (LightScanner सॉफ्टवेयर कॉल यह 2.0) सॉफ्टवेयर खोलें.
- 60-95 डिग्री सेल्सियस से गर्मी प्लेटें
- एक नया डेटा भंडारण फ़ाइल बनाएँ.
- HRMA डेटा विश्लेषण (चित्रा 2).
विश्लेषण के कई कदम हो सकता है. हम डेटा एम का सबसे अधिक इस्तेमाल किया सेट दिखानेanipulations.- सबसेट सेटिंग
सबसेट टैब पर क्लिक करें. नमूनों के साथ कुओं का चयन करें. - सामान्यकरण
- बाएं पैनल में सामान्यकरें टैब का चयन करें. प्रतिदीप्ति विचरण को खत्म करने के लिए मैन्युअल पूर्व (प्रारंभिक) में समानांतर डबल लाइन की स्थिति और पोस्ट (अंतिम) पिघल क्षेत्रों (चित्रा -2, तीर) के रूप में सचित्र और 1 और 0 के लिए सभी नमूनों की premelt और बाद पिघल प्रतिदीप्ति संकेत मानक के अनुसार क्रमश: 14.
- पिघल क्षेत्र पूर्व और बाद पिघल लाइनों के बीच इस क्षेत्र में है, लेकिन चयनित नहीं है कि इतनी लाइनों की स्थिति को समायोजित. सामान्य में, कम न्यूनतम और लोअर मैक्स (और ऊपरी मिन और ऊपरी अधिकतम) तापमान लाइनों के अलावा लगभग 1 डिग्री सेल्सियस रखा जाना चाहिए.
- सामान्य बनाने के लिए तापमान पदों चुनें सभी नमूनों (premelt क्षेत्र और न्यूनतम या बाद पिघल क्षेत्र के लिए नहीं (0%) प्रतिदीप्ति के लिए अधिकतम या पूर्ण (100%) प्रतिदीप्ति है कि ऐसी स्थिति के रूप में सबसे अच्छा के रूप मेंsible). सामान्यीकरण पिघल बिंदु और 0 से न्यूनतम प्रतिदीप्ति पर पिघल बिंदु से तो एक के पास क्षैतिज रेखा तक फैली हुई है कि 1 की अधिकतम प्रतिदीप्ति में एक के पास क्षैतिज रेखा में परिणाम चाहिए, 1 से ऊपर या 0 नीचे प्रतिदीप्ति का स्तर नहीं होना चाहिए . उदाहरण के लिए, चित्रा -2 में, 79-80 डिग्री सेल्सियस के तापमान पर्वतमाला का उपयोग premelting घटता मानक के अनुसार
- समूहन / क्लस्टरिंग
उनके पिघलने के तापमान (चित्रा -2, हरे बॉक्स) पर आधारित जीनोटाइप भेद. समूह का चयन करें.- समूहन अनुभाग के तहत मानक चयन सूची से Autogroup का चयन करें.
- समूहन खंड के अंतर्गत संवेदनशीलता चयन सूची से क्रमश: एक संक्रमण या कई बदलाव के साथ प्रोफाइल के पिघलने के लिए सामान्य या उच्च का चयन करें.
- चयन कंप्यूटसमूहन खंड के अंतर्गत समूह.
- फ़ाइल मेनू पर जाएँ और परिणाम को बचाने के लिए सहेजें क्लिक करें.
- सबसेट सेटिंग
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Representative Results
प्रोटोकॉल (काम के प्रवाह आरेख चित्र 1 में दिखाया गया है) कई दिनों में एक ही दिन के दौरान प्रदर्शन या चरणों में विभाजित किया जा सकता है. डीएनए निष्कर्षण पीसीआर amplicons का पिघला और विश्लेषण के बाद है. amplicon की पिघल के लिए तापमान आकार और जीसी सामग्री पर निर्भर करती है, लेकिन आम तौर पर शुरू करने और 50 ˚ सी और 95 ˚ सी के अंत तापमान (आंकड़े 2A और 2 बी) उपयुक्त हैं. पिघल किया जाता है एक बार, प्रतिदीप्ति पिघल घटता का विश्लेषण आम तौर पर उपयोग करते हुए पहले और बाद पिघल क्षेत्रों मानकों (चित्रा -2) के रूप में, अलग नमूना घटता की भिन्नता को सामान्य बनाने की आवश्यकता है. इस प्रतिदीप्ति की भिन्नता मामूली प्रयोगात्मक बदलाव से संबंधित है, जिसमें विभिन्न नमूनों से परिणाम की तुलना में सुधार. सामान्य बनाने के लिए तापमान लाइनों के प्रत्येक जोड़ी (चित्रा -2, तीर) लगभग 1 ˚ सी अलग रखा जाना चाहिए.पिघल वक्र के प्रोफाइल से पता चलता है कि एक ऊपरी ग्राफ, और एक संदर्भ नमूना (चित्रा 2 डी) की तुलना में एक subtractive अंतर साजिश से पता चलता है कि एक कम ग्राफ:; डेटा परिणामों का समूहन दो अलग अलग तरीकों में प्रतिनिधित्व किया है.
HRMA विश्लेषण म्यूटेशन (आंकड़े 3 ए और 3 बी) या transgenes (चित्रा -3 सी) का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. चित्रा 3 में, eif2b5 जीन में दो विभिन्न म्यूटेशनों जंगली प्रकार के नमूने की सामान्यीकृत प्रतिदीप्ति डेटा घटाकर (चित्रा 3 में लाल और नीले रंग से घटता) दिखाए जाते हैं. यह जीनोटाइप संदर्भ के लिए चुना जाता है जो कोई फर्क नहीं पड़ता. पिघल घटता में अधिक सूक्ष्म या भ्रामक मतभेद subtractive अंतर साजिश का उपयोग करके प्रतिष्ठित किया जा सकता. चित्रा 3 बी में, भ्रूण के एक संग्रह में चार अलग जीनोटाइप का एक उदाहरण दिखाया गया है.
चित्रा 1. Zebrafish जीनोमिक डीएनए के पीसीआर आधारित HRMA के लिए प्रोटोकॉल की रूपरेखा. पूरे ऊतक (पंख क्लिप या भ्रूण) से डीएनए निष्कर्षण एक फ्लोरोसेंट डबल असहाय डीएनए बाध्यकारी डाई की उपस्थिति में पीसीआर प्रवर्धन द्वारा पीछा किया जाता है. पीसीआर amplicon विकृत है और प्रतिदीप्ति संकेत amplicon पता लगाने के लिए और / या जीनोटाइप अंतर करने के लिए, पिघल वक्र विश्लेषण के बाद, दर्ज की गई है.
चित्रा 2. HRMA प्रदर्शन और परिणामों का विश्लेषण करने के लिए सॉफ्टवेयर की स्क्रीन शॉट्स. ए. LightScanner सॉफ्टवेयर की स्क्रीन शॉट;. पीले बॉक्स 'बी' में बढ़ाया है बी. 'ए' में बॉक्सिंग क्षेत्र को देखते बढ़ाया. प्रारंभ और अंत अस्थायी स्थापना (तीर). सी दिखाई जाती हैं. Premelt और सामान्य बनाने के लिए के बाद पिघल समानांतर लाइनों (तीर) की स्थिति. पूर्व और बाद के पिघलने क्षेत्रों (लाल बॉक्स) के प्रतिदीप्ति विचरण सूचना है. लोअर ग्राफ (हरे बॉक्स) सामान्यीकरण. डी निम्नलिखित कच्चे डेटा भूखंडों से व्युत्पन्न पिघल घटता दिखाता है. अपर ग्राफ दिखाता स्वत: समूहीकरण के बाद की अवस्था के प्रोफाइल पिघल; अलग जीनोटाइप अलग अलग रंग (लाल बॉक्स) में सचित्र हैं. लोअर ग्राफ (हरे बॉक्स) प्रतिदीप्ति अंतर वक्र से पता चलता है. बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें.
चित्रा 3. मानव संसाधन का उपयोग करना. म्यूटेशन और transgenes की पहचान करने के लिए एमए प्रतिदीप्ति अंतर घटता दिखाई जाती हैं, प्रतिदीप्ति में परिवर्तन (Y-अक्ष) के तापमान के लिए (एक्स अक्ष) एक दिखाया गया है.. HRMA eif2b5 जीन में उत्परिवर्तन ले जाने मछली का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया गया था. जंगली प्रकार ग्रे (तीर) में दिखाया गया है. लाल और नीले रंग पीसीआर उत्पाद. बी का अनुक्रमण द्वारा पुष्टि की दो अलग eif2b5 म्यूटेशन का प्रतिनिधित्व करते हैं. चार अलग Foxp2 उत्परिवर्ती alleles HRMA से पहचाना जाता है. लाल: zc82 / + (8 बी.पी. विलोपन), हरी: zc83 / + (17 बीपी विलोपन), नीला: zc82/zc83 (8bp deletion/17bp विलोपन), ग्रे:. Zc83/zc83 (17bp विलोपन समयुग्मज) सी. Gal4 ट्रांसजेनिक मछली (ग्रे घटता) जंगली प्रकार (ब्राउन वक्र, तीर) से प्रतिष्ठित किया जा सकता. Transgene का पता लगाने के लिए, सामान्यीकरण नहीं किया जाना चाहिए कि सूचना. बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें.
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Discussion
HRMA साथ संयुक्त पीसीआर zebrafish जीनोटाइपिंग के लिए एक शक्तिशाली तकनीक है. इस दृष्टिकोण के लाभ इसकी गति, मजबूती, और यहां तक कि बिंदु उत्परिवर्तन का पता लगाने के लिए संवेदनशीलता हैं. पूरे प्रोटोकॉल, पंख क्लिप करने के लिए पिघल वक्र विश्लेषण से, एक ही व्यक्ति से कम से कम आठ घंटे में किया जा सकता है. इसके अलावा, तकनीक उच्च throughput प्रदर्शन के लिए उत्तरदायी है, ethidium ब्रोमाइड के उपयोग की आवश्यकता नहीं है, है और संक्रमण के मुद्दों को कम करने में मदद करता है, जो सभी पीसीआर और विश्लेषण कदम के लिए बंद है.
इस तकनीक के लिए एक महत्वपूर्ण कदम पीसीआर amplicon और प्रथम डिजाइन है. HRMA में पीसीआर उत्पादों के लिए विशिष्ट लंबाई 50-200 बी.पी. है. लघु amplicons संवेदनशीलता बढ़ाने के लिए और एकल nucleotide परिवर्तन का पता लगाने के लिए आदर्श होते हैं. जांच; निकट से संबंधित पीसीआर उत्पाद प्रजातियों में से पिघल घटता आसानी से प्रतिष्ठित नहीं किया जा सकता है, तो SNP तक पूरक और 3 'अंत में अवरुद्ध एक छोटे oligonucleotide पीसीआर प्रतिक्रिया (Lunaprobes में शामिल किया जा सकता हैs). जांच आगे के विभिन्न एकाग्रता का उपयोग असममित पीसीआर द्वारा उत्पन्न और बाद HRMA पीसीआर में जांच के विस्तार को रोकने के लिए एक 3 'सी 3 अवरोधक के साथ, प्राइमरों रिवर्स कर रहे हैं. जांच तो HRMA पीसीआर प्रतिक्रिया में शामिल है. HRMA तो असममित जांच पीसीआर उत्पाद को बांधता है और alleles भेद करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है कि विभिन्न पिघल घटता के साथ जांच के लक्ष्य duplexes उत्पन्न करता है जिसमें जांच के साथ होता है.
कई कंपनियों पिघल वक्र विश्लेषण प्रणाली प्रदान करते हैं. ये Biofire Lightscanner, रॉश LightcyclerVR 480 और Qiagen रोटर जीन प्र. कई फ्लोरोसेंट, डीएनए बाध्यकारी रंगों नियंत्रण रेखा ग्रीन प्लस और SYT09 EvaGreen सहित, उपलब्ध हैं शामिल हैं. विभिन्न फ्लोरोसेंट रंगों और पिघल वक्र मशीनों 8,15 के आधार पर उत्परिवर्तन का पता लगाने में संवेदनशीलता में कुछ भिन्नता है. रंगों Nonsaturating, उदाहरण के लिए, SYBR ग्रीन मैं सबसे HRMA अनुप्रयोगों के लिए अनुपयुक्त हैं: उच्च मात्रा में, SYBR ग्रीन मैं inhibiडीएनए पोलीमरेज़ की गतिविधि टीएस, और कम सांद्रता में, SYBR ग्रीन मैं ठीक होने के कारण वापस dsDNA 16 क्षेत्रों के लिए पिघल क्षेत्रों से अपने पुनर्वितरण को पिघलने व्यवहार उपाय नहीं कर सकते. सामान्य में सबसे मौजूदा रीयल टाइम पीसीआर प्लेटफार्मों एक सॉफ्टवेयर पैकेज पर जोड़ सकते हैं और एक दूसरी पीढ़ी फ्लोरोसेंट डीएनए बाध्यकारी डाई का उपयोग HRMA preforming में सक्षम हैं. प्रायोगिक कदमों के सॉफ्टवेयर और अनुक्रम की तकनीकी जानकारी प्लेटफार्मों के बीच थोड़ा भिन्न है, जबकि समग्र वैज्ञानिक अवधारणाओं को अनिवार्य रूप से समान हैं.
हमारी प्रयोगशाला और दूसरों HRMA transgenes पता लगाने के लिए दोनों भ्रूण और वयस्क zebrafish में इस्तेमाल किया जा सकता है कि प्रदर्शन किया है, और परिवर्तन ZFNs और TALENS 6,12,13 से प्रेरित. HRMA zebrafish 6,12 में बहुरूपताओं को खोजने के लिए इस्तेमाल किया गया है. हमारी प्रयोगशाला talen प्रेरित परिवर्तन की प्रारंभिक जांच के लिए और साथ ही स्थापित लाइनें (अप्रकाशित TSQ और JLB,) की छंटाई के लिए दोनों HRMA का उपयोग करता है. अन्य संभावित अनुप्रयोगोंऔर vivariums 18 में रोगज़नक़ का पता लगाने, zebrafish के लिए लागू किया जा सकता है कि आयनों मेथिलिकरण के प्रति संवेदनशील HRMA (MS-HRMA) 17, कॉपी संख्या की मात्रा का ठहराव 5 वेरिएंट शामिल हैं.
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Disclosures
लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.
Acknowledgments
हम सलाह और तकनीकी सहायता के लिए Blaschke, Grunwald, और Wittwer लैब्स के सदस्यों को धन्यवाद. इस काम JLB को PCMC फाउंडेशन, एनआईएच R01 MH092256 और DP2 MH100008, और ऑफ डाइम्स फाउंडेशन अनुसंधान अनुदान # 1 FY13-425 के मार्च, द्वारा समर्थित है.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100 Reaction LightScanner Master Mix | BioFire | HRLS-ASY-0002 | www.biofiredx.com |
| Hard-Shell PCR 96-well BLK/WHT Plates | Bio-Rad Laboratories | HSP9665 | www.bio-rad.com |
| Microseal 'B' Adhesive Seals | Bio-Rad Laboratories | MSB1001 | www.bio-rad.com |
| 96-well LightScanner Instrument | BioFire | LSCN-ASY-0040 | www.biofiredx.com |
| LightScanner Software with Call-IT 2.0 | BioFire | www.biofiredx.com | |
| High-resolution Melting Analysis 2.0 | BioFire | www.biofiredx.com | |
| LightScanner Primer Design Software | BioFire | www.biofiredx.com | |
| Vector NTI Software | Invitrogen | www.invitrogen.com | |
| Tricaine | |||
| Paraformaldehyde |
References
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