وصفها الفرق من سطح الخلية والمنضوية البروتينات الأجسام المضادة بعد تغذية الخلايا العصبية مثقف لايف
Summary
نحن تصف طريقة لتسمية البروتين على سطح الخلايا العصبية الحية باستخدام الأجسام المضادة بولكلونل محددة لالحواتم خارج الخلية. البروتين ملزمة الأجسام المضادة على سطح الخلية وبالتالي المنضوية عبر الإلتقام يمكن تمييزها عن البروتين المتبقية على، أو الاتجار بهن ل، والسطح أثناء الحضانة.
Abstract
من أجل إظهار توطين سطح الخلية من مستقبلات عبر الغشاء المفترضة في الخلايا العصبية مثقف، ونحن المسمى البروتين على سطح الخلايا العصبية الحية مع الأجسام المضادة الأولية المحددة التي أثيرت ضد جزء من البروتين خارج الخلية. بالنظر إلى أن المستقبلات يتم الاتجار من وإلى السطح، إذا تم permeabilized الخلايا بعد التثبيت ثم سوف يتم الكشف عن كل من سطح الخلية والبروتينات الداخلية من قبل نفس الأجسام المضادة الثانوية المسمى. هنا، ونحن تكييفها طريقة تستخدم لدراسة الاتجار البروتين ("تغذية الأجسام المضادة") لتفاضلي البروتين التسمية التي كان قد كتبها المنضوية الإلتقام خلال خطوة الضد الحضانة والبروتين الذي إما بقيت على سطح الخلية أو تم الاتجار بهم إلى السطح خلال هذه الفترة . وقدم القدرة على التمييز بين هذه حمامات اثنين من البروتين ممكن من خلال إدماج خطوة الحجب بين عشية وضحاها مع تتركز درجة عالية من الأجسام المضادة الثانوية أونلبلد بعد incubatio الأوليةن من الخلايا العصبية unpermeabilized مع الأجسام المضادة الثانوية fluorescently المسمى. بعد عرقلة الخطوة، permeabilization من الخلايا العصبية يسمح الكشف عن تجمع المنضوية مع الأجسام المضادة الثانوية فلوري المسمى مع fluorophore مختلفة. باستخدام هذه التقنية تمكنا من الحصول على معلومات مهمة عن مكان التحت خلوية من هذا المستقبل المفترضة، وكشف عن أنه كان، في الواقع، يتم الاتجار بهم إلى سطح الخلية في الخلايا العصبية. هذه التقنية قابلة للتطبيق على نطاق واسع لمجموعة من أنواع الخلايا والبروتينات على سطح الخلية، وتوفير الأجسام المضادة مناسبة لحاتمة خارج الخلية هو متاح.
Introduction
في إنشاء وظيفة من البروتينات التي تم تشخيصها حديثا، ويمكن التحقيق في توطين التحت خلوية والاتجار من البروتين في مسألة توفر أدلة مهمة حول دور المحتمل / ثانية من 1،2 البروتين. قدم تحليل المعلوماتية الحيوية من Transcriptome على من القشرة المخية الحديثة النامية 3 لنا مع قائمة من الجينات واظهار التعبير تغيير خلال الماوس corticogenesis الدماغ. نحن ثم اعتمدت نهجا خروج المغلوب الجينات للتأكد من أن البروتين المشفرة بواسطة واحد من هذه الجينات، sez6، دورا رئيسيا في تطوير الخلايا العصبية. لاحظنا أن الجينات المتعلقة الاستيلاء 6، أو Sez6 والبروتين الموجود في التشعبات النامية وهذا هو ايضا في العمود الفقري شجيري، هياكل متخصصة في التشعبات التي تتلقى إشارات ودمج مثير. وعلاوة على ذلك، عندما يفتقر هذا البروتين، تفشل التشعبات ونقاط الاشتباك العصبي مثير لتشكيل بشكل صحيح 4. شكل الإسوي المهيمنة المحتمل من البروتين لديه ملامح transmembranه على الرغم من مستقبلات، وعندما تم فحص توزيع التحت خلوية من البروتين immunolabeled بواسطة المجهر متحد البؤر المجهري أو عن طريق immunoelectron معظم، إن لم يكن كلها، للإشارة ظهرت المرتبطة حويصلات صغيرة في حجرة somatodendritic في القليل، أو لا، البروتين المسمى على غشاء البلازما على سطح الخلية.
من أجل إظهار قاطع أن هذا المستقبل المفترضة مع مجال واسع خارج الخلية توقع والاتجار بهم لغشاء البلازما، واعتمدنا نهجا الخلية الحية باستخدام مصل كنا قد ولدت خارج الخلية إلى جزء من البروتين لتسمية البروتين على سطح الخلية. من خلال الجمع بين هذا النهج "تغذية الأجسام المضادة" مع اثنين من تطبيقات المسمى تفاضلي الضد الثانوية مفصولة خطوة الحجب واسعة وخطوة permeabilization، تمكنا من تحديد اثنين من تجمعات مختلفة من البروتين تتميز ملزمة لالأجسام المضادة الثانوية fluorescently المسمى الحاملة fluoresc مختلفةبه والأنف والحنجرة. وهكذا، كنا قادرين على التمييز بين البروتين الذي قد المنضوية بواسطة الإلتقام خلال خطوة الضد الحضانة من البروتين الذي إما بقيت على سطح الخلية أو تم الاتجار بهم إلى السطح خلال هذه الفترة. باستخدام هذا الأسلوب، أنشأنا أن البروتين من الفائدة والاتجار بهم من وإلى سطح الخلية في الخلايا العصبية. لذلك، أثبتت هذه التقنية بسرعة نسبيا وبسيطة أكثر إفصاحا من الطرق التقليدية أو مناعية قبل التضمين immunogold المجهر الإلكتروني، على الرغم من حقيقة أننا تستخدم نفس الأرنب بولكلونل مصل لجميع هذه التقنيات. هذه التقنية تنطبق بصورة عامة على أي بروتين الغشاء قدم جيدة الأضداد الاعتراف الحواتم المجال خارج الخلية هو متاح. وقد استخدمت هذه التقنية سابقا لدراسة الاتجار مستقبلات لمستقبلات الغلوتامات GluR1 الوحيدات 5.
Protocol
Representative Results
Discussion
تقنية الموضحة هنا هي مكملة لتلك التي biotinylation سطح الخلية (التي استعرضها Arancibia-Càrcamo وآخرون) 12 وهذا هو الأسلوب المفضل للحفاظ على المعلومات حول توطين التحت خلوية من البروتين المنضوية، قدم الأجسام المضادة الأولية المناسبة ل حاتمة خارج الخلية هو متاح. بالإضافة إ…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
المؤلفين أشكر Teele Palumaa للحصول على المساعدة مع الأرقام. بتمويل من منح المشروع 1008046 من مجلس البحوث الطبية، أستراليا الوطنية للصحة و.
Materials
| PBS with Ca and Mg | Invitrogen | 14040182 | |
| Neurobasal medium | Invitrogen | 21103-049 | |
| B27 supplement | Invitrogen | 17504-044 | |
| L-glutamine | Invitrogen | 25030-081 | |
| Papain Dissociation System | Worthington Biochemical Corporation | PDS | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma Aldrich Australia | A9418 | |
| Hank's balanced salt solution without calcium, magnesium, phenol red | Invitrogen (Gibco) | 14175-079 | |
| Poly-D-Lysine | Sigma Aldrich Australia | P0899 | |
| Natural mouse laminin | Invitrogen | 23017-015 | Thaw on ice prior to making aliquots |
| Fetal bovine serum HyClone | Thermo Fisher | ||
| fluorodeoxyuridine | Sigma Aldrich Australia | F0503 | |
| uridine | Sigma Aldrich Australia | U3003 | |
| 18 mm round glass coverslips | Menzel Gläser | CB00180RA1 | |
| VECTASHIELD aqueous mounting medium | Vector Laboratories | H1400 | |
| Donkey anti-rabbit Dylight 649 | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 711-495-152 | |
| AffiniPure Fab fragment Goat anti-Rabbit 1gG (H+L) | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 111-007-003 | |
| Paraformaldehyde | Sigma Aldrich Australia | P6148 | TOXIC – handle in fume hood |
| Triton-X-100 | Sigma Aldrich Australia | T8787 | |
| Alexafluor 488-conjugated donkey anti-rabbit 2° antibody | Invitrogen – Molecular Probes | A21206 |
References
- Lewis, T. L., Mao, T., Arnold, D. B. A role for myosin VI in the localization of axonal proteins. PLoS Biol. 9, (2010).
- von Zastrow, M., Williams, J. T. Modulating neuromodulation by receptor membrane traffic in the endocytic pathway. Neuron. 76, 22-32 (2012).
- Gunnersen, J. M., Augustine, C., Spirkoska, V., Kim, M., Brown, M., Tan, S. -. S. Global analysis of gene expression patterns in developing mouse neocortex using serial analysis of gene expression. Mol. Cell. Neurosci. 19, 560-573 (2002).
- Gunnersen, J. M., Kim, M. H., et al. Sez-6 proteins affect dendritic arborization patterns and excitability of cortical pyramidal neurons. Neuron. 56, 621-639 (2007).
- Kennedy, M. J., Davison, I. G., Robinson, C. G., Ehlers, M. D. Syntaxin-4 Defines a Domain for Activity-Dependent Exocytosis in Dendritic Spines. Cell. 141, 524-535 (2010).
- Cullen, D. K., Gilroy, M. E., Irons, H. R., Laplaca, M. C. Synapse-to-neuron ratio is inversely related to neuronal density in mature neuronal cultures. Brain Res. 1359, 44-55 (2010).
- Grabrucker, A., Vaida, B., Bockmann, J., Boeckers, T. M. Synaptogenesis of hippocampal neurons in primary cell culture. Cell Tissue Res. , 338-341 (2009).
- Vaillant, A. R., Zanassi, P., Walsh, G. S., Aumont, A., Alonso, A., Miller, F. D. Signaling mechanisms underlying reversible, activity-dependent dendrite formation. Neuron. 34, 985-998 (2002).
- Park, M., Penick, E. C., Edwards, J. G., Kauer, J. A., Ehlers, M. D. Recycling endosomes supply AMPA receptors for LTP. Science. 305, 1972-1975 (2004).
- Kennedy, M. J. &. a. m. p. ;., Ehlers, M. D. Organelles and trafficking machinery for postsynaptic plasticity. Annu. Rev. Neurosci. 29, 325-362 (2006).
- Lasiecka, Z. M., Yap, C. C., Caplan, S., Winckler, B. Neuronal early endosomes require EHD1 for L1/NgCAM trafficking. J. Neurosci. 30, 16485-16497 (2010).
- Arancibia-Cárcamo, I. L., Fairfax, B. P., Moss, S. J., Kittler, J. T., Kittler, J. T., Moss, S. J. Studying the localization, surface stability and endocytosis of neurotransmitter receptors by antibody labeling and biotinylation approaches. The Dynamic Synapse: Molecular Methods in Ionotropic Receptor Biology. , (2006).
- Petrini, E. M., Lu, J., Cognet, L., Lounis, B., Ehlers, M. D., Choquet, D. Endocytic trafficking and recycling maintain a pool of mobile surface AMPA receptors required for synaptic potentiation). Neuron. 63, 92-105 (2009).
- Reider, A., Wendland, B. Endocytic adaptors – social networking at the plasma membrane. J. Cell Sci. 124, 1613-1622 (2011).
