Rotulagem diferencial de superfície celular e internalizado Proteínas após Anticorpo Alimentação da Vivo Cultivadas neurônios
Summary
Descreve-se um método para marcar a proteína na superfície de neurónios vivos utilizando um anticorpo policlonal específico para epitopos extracelulares. A proteína ligada pelo anticorpo na superfície da célula e subsequentemente internalizados através de endocitose podem ser distinguidas a partir de proteína restante na, ou vendidas para, a superfície durante a incubação.
Abstract
A fim de demonstrar a localização da superfície da célula de um receptor transmembranar putativo em neurónios em cultura, que marcado a proteína na superfície dos neurónios vivos com um anticorpo primário específico criado contra uma porção extracelular da proteína. Dado que os receptores são de tráfico de e para a superfície, se as células são permeabilizadas após a fixação, em seguida, tanto na superfície celular e da proteína interna irá ser detectada pelo mesmo anticorpo secundário marcado. Aqui, nós adaptamos um método utilizado para estudar o tráfico de proteína ("alimentação anticorpo") para a proteína diferencialmente etiqueta que tinham sido internalizados por endocitose, durante o passo de incubação de anticorpo e proteína que permaneceu sobre a superfície da célula ou se tráfico à superfície durante este período . A capacidade de distinguir estas duas piscinas de proteína tornou-se possível através da incorporação de um passo de bloqueio durante a noite com anticorpo secundário sem rótulo altamente concentrada após um incubatio inicialn de neurónios unpermeabilized com um anticorpo secundário marcado por fluorescência-. Após o bloqueio de fase, a permeabilização dos neurónios permitiram a detecção da piscina internalizado com um anticorpo secundário fluorescente marcada com um fluoróforo diferente. Usando esta técnica nós fomos capazes de obter informações importantes sobre a localização subcelular deste receptor putativo, revelando que ele era, de fato, traficadas para a superfície celular em neurônios a. Esta técnica é amplamente aplicável a uma variedade de tipos de células e proteínas da superfície celular, proporcionando um anticorpo adequado para um epitopo extracelular está disponível.
Introduction
Ao estabelecer a função das proteínas recém-identificadas, a investigação da localização subcelular e do tráfico da proteína em questão pode fornecer pistas importantes sobre o provável papel / s de 1,2 proteína. Análise bioinformática do transcriptoma do neocórtex desenvolver 3 nos forneceu uma lista de genes que apresentam expressão alterada durante rato corticogenesis cérebro. Em seguida, adoptou uma abordagem gene knockout para determinar que a proteína codificada por um destes genes, sez6, tem um papel chave no desenvolvimento neuronal. Observou-se que o gene relacionado com Apreensão 6, ou Sez6, proteína está localizado em dendritos em desenvolvimento e também está presente nas espinhas dendriticas, as estruturas especializadas em dendritos que recebem e integram sinais excitatórios. Além disso, quando esta proteína está ausente, os dendritos e sinapses excitatórias falhar para formar correctamente 4. A isoforma dominante provável da proteína tem características de um transmembrane do receptor embora, quando a distribuição sub-celular da proteína immunolabeled foi examinada por microscopia confocal ou por microscopia imunoelectrónica a maioria, se não a totalidade, do sinal apareceram associadas a pequenas vesículas no compartimento somatodendrítico com pouco, ou nenhum, proteína marcada na membrana plasmática na superfície da célula.
A fim de demonstrar definitivamente que este receptor putativo com um grande domínio extracelular predito é de tráfico para a membrana plasmática, que adoptou uma abordagem em células vivas, utilizando o anti-soro que havia gerado a uma porção extracelular da proteína para identificar a proteína na superfície da célula. Ao combinar esta abordagem "alimentação anticorpo", com duas aplicações de anticorpo secundário marcado diferencialmente separados por um passo de bloqueio grande e um passo de permeabilização, fomos capazes de identificar dois conjuntos diferentes de proteínas que se distinguem por ligação a anticorpos secundários marcados fluorescentemente rolamento fluores diferenteetiquetas rentes. Assim, nós fomos capazes de distinguir a proteína que tinha sido internalizados por endocitose, durante o passo de incubação de anticorpos a partir de proteína que permaneceu sobre a superfície da célula ou se tráfico à superfície durante este período. Usando este método, foi estabelecido que a proteína de interesse é de tráfico de e para a superfície da célula em neurónios. Portanto, essa técnica relativamente rápido e simples mostrou-se mais informativo do que os métodos tradicionais ou imunocitoquímica microscopia eletrônica de imuno pré-incorporação, apesar do fato de que usamos o mesmo anti-soro policlonal de coelho para todas estas técnicas. Esta técnica é geralmente aplicável a qualquer proteína transmembranar prevista uma boa anticorpo que reconhece os epítopos de domínio extracelular é acessível. A técnica tem sido utilizada anteriormente para estudar o tráfico do receptor do receptor de glutamato GluR1 subunidade 5.
Protocol
Representative Results
Discussion
A técnica aqui descrita é complementar à da biotinilação da superfície celular (revisto por Arancibia-CARCAMO et al.) 12 e é o método de escolha para preservar a informação sobre a localização subcelular da proteína internalizado, proporcionado um anticorpo primário adequado para uma epitopo extracelular está disponível. Em adição, a quantificação de proteína tráfico / internalização ao longo do tempo pode ser realizada (por lamelas, que fixa em diferentes momentos ao longo da…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Os autores agradecem Teele Palumaa para a assistência com os números. Financiado pelo Projeto Grant 1008046 do National Health and Medical Research Council, na Austrália.
Materials
| PBS with Ca and Mg | Invitrogen | 14040182 | |
| Neurobasal medium | Invitrogen | 21103-049 | |
| B27 supplement | Invitrogen | 17504-044 | |
| L-glutamine | Invitrogen | 25030-081 | |
| Papain Dissociation System | Worthington Biochemical Corporation | PDS | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma Aldrich Australia | A9418 | |
| Hank's balanced salt solution without calcium, magnesium, phenol red | Invitrogen (Gibco) | 14175-079 | |
| Poly-D-Lysine | Sigma Aldrich Australia | P0899 | |
| Natural mouse laminin | Invitrogen | 23017-015 | Thaw on ice prior to making aliquots |
| Fetal bovine serum HyClone | Thermo Fisher | ||
| fluorodeoxyuridine | Sigma Aldrich Australia | F0503 | |
| uridine | Sigma Aldrich Australia | U3003 | |
| 18 mm round glass coverslips | Menzel Gläser | CB00180RA1 | |
| VECTASHIELD aqueous mounting medium | Vector Laboratories | H1400 | |
| Donkey anti-rabbit Dylight 649 | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 711-495-152 | |
| AffiniPure Fab fragment Goat anti-Rabbit 1gG (H+L) | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 111-007-003 | |
| Paraformaldehyde | Sigma Aldrich Australia | P6148 | TOXIC – handle in fume hood |
| Triton-X-100 | Sigma Aldrich Australia | T8787 | |
| Alexafluor 488-conjugated donkey anti-rabbit 2° antibody | Invitrogen – Molecular Probes | A21206 |
References
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