Summary
En brystkræft hjernemetastaser musemodel etableres med ultralydsscanning-vejledt intrakardiel injektion af MDA-MB231/Br-GFP celler. Udvikling af multifokale intrakranielle metastaser er blevet overvåget i længderetningen ved hjælp af høj opløsning 9,4 T MR-scanning.
Abstract
Brystkræft hjernemetastaser, der forekommer hos 30% af brystkræftpatienter på trin IV, er forbundet med høj dødelighed. Den mediane overlevelse er kun 6 måneder. Det er vigtigt at have egnede dyremodeller til at efterligne hæmodynamisk spredning af metastatiske celler i den kliniske scenario. Her bliver vi indføre brugen af små dyr ultralydsscanning til at guide en nøjagtig indsprøjtning af hjerne tropisk brystkræftceller ind i venstre hjertekammer af athymiske nøgne mus. Longitudinal MRI bruges til at vurdere intrakraniel initiering og vækst af metastaser i hjernen. Ultralyd-vejledt intrakardial injektion sikrer ikke kun en nøjagtig injektion og herved en højere vellykket sats, men også signifikant reduceret dødelighed sammenlignet med vores tidligere manuel procedure. In vivo høj opløsning MRI tillader visualisering af hyperintense multifokale læsioner, så små som 310 um i diameter på T2-vægtede billeder på 3 uger efter injektion. Follow-up MRI afslører intrakraniel tumor vækst og øget antal af metastaser, der distribuerer hele hjernen.
Introduction
Hjernemetastaser er den mest almindelige intrakraniel malignitet hos voksne. Prognosen er yderst ringe, med en median overlevelse på 4-6 måneder, selv med aggressiv behandling. Brystkræft er en af de tre store primære kræftformer med en høj sygelighed af hjernemetastaser 1-3. Adskillige brystkræft hjerne-tropisk linjer er i stand til at udvikle hjernemetastaser efter intrakardial eller intracarotid injektion 4. Direkte injektion af tumorceller i den venstre ventrikel kan omgå lunge kapillarleje og dermed øge forekomsten af dannelse af hjernemetastaser samtidig minimere viscerale metastaser. MDA-MB231Br linje er et af de mest anvendte humane brystkræft linjer til at udvikle hjernemetastaser i gnavermodeller 5,6.
Ligesom mange andre undersøgelser 4,7, har vi foretaget en manuel procedure intrakardial indsprøjtning i vores tidligere undersøgelser. Imidlertid blev kun 50% succes, der opnås med den manuelleindsprøjtning og en brøkdel af mus døde af de gentagne invasive procedurer, hvis tidligere forsøg mislykkedes. Her indfører vi anvendelse af en imaging-styret procedure for at sikre injektion af hjerne-søger brystcancerceller i den venstre ventrikel af athymiske mus. Longitudinal høj opløsning MRI anvendes til at følge intrakraniel udvikling af hjernemetastaser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle animalske procedurer blev godkendt af Institutional Animal Care og brug Udvalg University of Texas Southwestern Medical Center.
1.. Forberedelse af MDA-MB231/Br-GFP Cells
- Hente og dyrke MDA-MB231/Br-GFP celler (venligst leveret af Drs. Palmieri og Steeg, NCI) i DMEM medium indeholdende 10% FBS, 1% glutamin og 1% penicillin / streptomycin.
- Overhold tilstanden af celler og farve af medium og erstatte medium hver 2-3 dage.
- Trypsinisér og indsamle celler, når 80% konfluens er nået som beskrevet i trin 1.3.1-1.3.5:
- Fjern det gamle medie helt og tilsæt 5 ml PBS (1x) til at vaske cellerne forsigtigt. Fjern PBS fra fadet.
- Tilføj 1,5 ml trypsin i skålen, vippe skålen forsigtigt for at sikre, at alle cellerne er dækket af trypsin. Sæt fadet tilbage til cellen kuvøse og holde det ved 37 ° C i 1 min.
- Tag fadet ud af inkubatoren og observerecellerne under optisk mikroskop for at sikre cellerne løsnes fra fadet.
- Tilsæt 3 ml medium til at stoppe effekten af trypsin. Saml celleblandingen i et centrifugeglas. Centrifuger blandingen ved 2000 rpm i 5 min.
- Fjern mediet omhyggeligt og cellerne resuspenderes i 5 ml serumfrit medium indtil homogenitet.
- Tæl passende antal celler og resuspender dem i serumfrit DMEM-medium med en endelig koncentration på 1,75 x 10 5 celler i 100 pi volumen.
- Tag 50 celleblanding pi og tilsættes 50 ul Trypan Blå. Efter blanding, tage 10 pi blandingen og forsigtigt tilføje til celletælling dias. Brug flere prøver for at sikre præcis celle nummer skøn.
- Stick i celletælling dias, en ende ad gangen, og den celle tæller begynder at tælle automatisk. Tag gennemsnit af alle optaellingsresultater og beregne den samlede celle nummer.
- Centrifuger cellerne igen og resuspendere dem idet passende volumen af serumfrit medium til at resultere i en slutkoncentration på 1,75 x 10 5 celler/100 pi volumen.
- Place-celler på is før intrakardial injektion.
2. Ultrasound Imaging-vejledt intrakardiel Injection
- Brug kvindelige nøgne mus (BALB / c nu / nu) mellem 6-8 uger gamle.
- Log på billeddannende system. Initialiser transduceren 704 (40 MHz).
- Start en ny undersøgelse og udfyld oplysningerne.
- Bedøver (3% isoflurane/100% O 2 i en induktion kammer) og opretholde dyrene med isofluran (2%) i 100% O 2 (1 dm 3 / min) under hele proceduren via en næse kegle. Anæstesi er bekræftet, når ingen tilbagetrækning refleks er observeret med tå knibe.
- Indstil temperaturen af billedtromlen tabellen til 37 ° C. Tape den bedøvede mus til den opvarmede imaging tabellen i liggende stilling.
- Hold ultralyd gel ved 37 ° C før imaldring. Påfør gel på brystet af musen.
- Monter transduceren i holderen. Sænk transduceren indtil den ønskede billeddannelse dybde er nået. Flyt etape indtil den venstre ventrikel er identificeret med opstigende aorta som den skelsættende (Figur 1A). Lås den fase, hvor et klart billede af venstre ventrikel visualiseres.
- Tegn 100 pi celle blandingen i en 1 ml sprøjte med en 22 G nål. Placer og fastgør sprøjten på sprøjten mount.
- Flyt sprøjten frem mod mus brystet og forsigtigt flytte den fra side til side, indtil nålespidsen er på billeddannelse synsfelt (før ind i mus).
- Juster nålen højde og vinkel til at sigte ned af venstre ventrikel.
- Trænge ind i kanylen ind i Intercoastal rum straks gennem hud og muskel lag ind i venstre hjertekammer under vejledning af ultralydsscanning.
En indikation af vellykkede indsættelse af nålen ind i venstre ventrikel er tilbagesvaling af frisk arterieblod (lyserød farve i modsætning til mørkerød veneblod) i sprøjten - Sprøjt celleblandingen langsomt (figur 1B).
- Ved afslutning, trækkes kanylen, løft op transduceren, rengøre ultralyd gel med en afdæmpet gaze og fjerne tape.
- Forbered en ren bur med en forvarmet pad.
- Placer dyret på puden og observere dyret indtil fuld helbredelse.
- Overvåg opførsel af dyret hver 24 timer i to dage.
- Generelle betingelser og neurologiske tegn på komplikationer i eksperimentel mus bliver rutinemæssigt overvåget.
3. MRI Overvågning af Intrakranielt tumor udvikling
- Brug en 9,4 Tesla magnet til at overvåge intrakranial udvikling af hjernemetastaser.
- Indled MRI to uger efter, tumorimplantation og gentage en gang om ugen i op til tre uger.
- Bedøve dyrene med 3% isofluran og vedligeholde dem under genral anæstesi (1,5% isofluran).
- Overvåge og vedligeholde dyrets kropstemperatur og respiration konstant gennem hele forsøget.
- Høj opløsning multislice (14 skiver med 1 mm tyk, ingen mellemrum) T 1 - og T 2-vægtede koronale billeder, der dækker området fra frontallappen til fossa posterior, er erhvervet med følgende parametre: T 1-vægtede billeder: spin-ekko multiple skive (SEMs), TR / TE = 400 msec/20 msek matrix: 256 x 256, FOV 20 x 20 mm, i flyet opløsning: 78 x 78 mM 2. T 2-vægtede billeder: hurtig spin-ekko flere skive (FSEMS) sekvenser, TR / TE = 2500 msec/48 msek, 8 ekko tog, matrix: 256 x 256, FOV 20 x 20 mm, i flyet opløsning: 78 x 78 um 28,9.
Tumor læsioner vises lysere end normale hjernevæv på T 2-vægtede billeder. - Tumor størrelse bestemmes på T 2-vægtede billeder ved manuelt skitserer enhansiering del af massen på hvert billede ved at bruge MATLAB programmer skrevet af os 8.
Da det meste af tumoren diametre er mindre end skivetykkelsen (1 mm), er tumorstørrelsen præsenteret som i planet område snarere end den mængde.
4.. H & E farvning Bekræftelse metastaserne
- Sacrifice musene umiddelbart efter den sidste MR-scanning, dissekere tumor-bærende hjerner og integrere det i OCT medium og frosset i -80 ° C.
- § en serie på 10 um tyk koronale hjerne prøver med cryostat.
- Udfør H & E farvning på hjernen sektioner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Med den høje rumlige opløsning MRI (78 um i plan opløsning), kan hyperintense læsioner identificeres så lille som 310 um i diameter (figur 2). Da metastaser i denne undersøgelse er meget lille og udviklingen af nekrose og ødem er minimal, det hyperintens læsion på T 2-vægtede billeder virkelig repræsenteret tumormassen.
Langsgående MRI undersøgelser tillader in vivo noninvasive evaluering af tumorvækst. Som vist i figur 3, høj opløsning scanning var i stand til at detektere flere små læsioner 3 uger efter intrakardial injektion (figur 3A). På uge 4, de læsioner, der blev set i den tidligere scanning alle blev større, flere nye læsioner kan ses på T 2-vægtede billeder (figur 3B).
H & E farvning afslørede enten diffus eller klynge typen metastatiske læsioner (figur 4).Forstørret fartøjer blev ofte set omkring tumor, hvilket indikerer nonsprouting angiogenese (figur 4D).
Figur 1. Ultralyd-vejledt intrakardiel indsprøjtning. (A) Identifikation af opstigende aorta (pil) som vartegn venstre hjertekammer af musen hjerte. (B) En nål (pil) indsættelse i venstre hjertekammer at injicere tumorcellerne. Klik her for at se større billede .
Figur 2. Høj opløsning T2-vægtede billeder af brystkræft hjernemetastaser. Fjorten træk MRI skiver af en repræsentativ mus hjerne, erhvervet fire uger, efter intrakardial injektion, viste klart multifokale metastaser distribuerer gennem hele musen hjernen, fra lugtekolben til Pontine og medulla. Klik her for at se større billede .
Figur 3. Longitudinal MRI af udviklingen af metastaser i hjernen. A. Seks på hinanden følgende koronale MRI sektioner på uge 3 identificeret flere læsioner med hyper-intensitet på T 2-vægtede billeder. B. Et øget antal lesions optrådt på billederne i uge 4, og disse læsioner set på uge 3 blev større. Klik her for at se større billede .
Figur 4.. Mikroskopiske læsioner blev observeret på H & E farvning. A. En hel mount coronal sektion afbildet flere læsioner. Bd. Højere forstørrelse billeder viste enten diffus eller klynge-type læsioner (B og C). Forstørret skibe blev set omkring tumor. Klik her for at se større billede .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I nærværende undersøgelse har vi vist, at ultralydsscanning-vejledt venstre ventrikel injektion sikrer nøjagtighed, således at alle dyr i denne undersøgelse udviklet hjernemetastaser og ingen dyr død blev observeret. Skønheden i image-vejledt injektion er, kan overvåges og justeres under billedet, som er forskellig fra den manuelle procedure, der kræver strenge anatomiske landmærker at følge stien for nål penetration af huden og til sidst ind i den venstre ventrikel.
Aktuelle forståelser af intrakraniel udvikling af hjernemetastaser er i vid udstrækning baseret på histologiske undersøgelser af dyremodeller 4,10. Men histologiske undersøgelser normalt kræve et stort antal mus, som bliver dræbt på forskellige tidspunkter efter tumor-implantation. Endnu vigtigere, information om tidsmæssige udvikling i de enkelte læsioner der mangler fra histologiske undersøgelser.
In vivo billeddannelse lover større efficiency da hvert dyr fungerer som sin egen kontrol og forskellige tidspunkter kan undersøges sekventielt 7,11. Høj opløsning T 2-vægtede billeder muliggøre påvisning af multifokal tumorinitiering ved meget tidligt stadium (læsioner med en diameter så lille som 310 um er synlige). Longitudinal MRI giver de enkelte hjernemetastaser, der skal undersøges over tid. Desuden vil in vivo noninvasive MRI være særlig værdifuldt i forløbsundersøgelse af terapeutisk respons, fx hele hjernen stråling.
Dannelse af multifokale hjernemetastaser er egenskaberne ved MDA-MB231Br model. Udover MDA-MB231/Br-GFP cellelinje vi viste i den foreliggende undersøgelse, forældrenes klon MDA-MB231/Br og MDA-MB231/Br-luc også udviser lignende metastatiske læsioner. Derimod har flere andre hjerne-søger linjer såsom MCF-7BR og 4T1 vist sig at udvikle en ensom metastase efter intrakardial injektion 12. Beggemodeller, spejling kliniske kolleger er nyttige dyremodeller af hjernemetastaser. Men i tillæg til hjernemetastaser, viscerale metastaser, såsom lunge-og knoglemetastaser ofte observeret i denne model. Etablering af dyremodeller, der udvikler hjernemetastaser udelukkende vil være afgørende, især til vurdering af behandlingsrespons.
Sammenfattende har vi vist nytten af imaging-styret intrakardial injektion for at etablere en hjernemetastaser musemodel og den høje opløsning MRI til at vurdere intrakraniel udvikling af multifokale metastaser i en musemodel.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen interessekonflikter erklæret.
Acknowledgments
Vi er taknemmelige for Drs. Diane Palmieri og Patricia Steeg af NCI for at give os MDA-MB231Br celler. Vi takker Dr. Ralph Mason, Mr. Jason Reneau og Ms Ramona Lopes til teknisk og kollegial støtte. Dette arbejde blev støttet delvist af DOD IDEA Awards W81XWH-08-1 til 0583 og W81XWH-12-1 til 0317. MRI eksperimenter blev udført i Advanced Imaging Research Center, en NIH BTRP # P41-RR02584 rum og ultralyd-vejledt intrakardiel injektion blev udført med VisualSonics Vevo 770 under 1S10RR02564801.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | HyClone | SH30022.01 | |
| Trypsin | Mediatech | 25-051-C1 | |
| Automatic cell counter | BioRad | TC10 | |
| Isoflurane | Baxter International Inc. | 1001936060 | |
| VisualSonics Vevo 770 High-Resolution Imaging System | Visual Sonics Inc. | ||
| 9.4 T horizontal bore magnet with a Varian INOVA Unity system | Agilent | ||
| O.C.T Compound | Sakura Finetek USA | 4583 |
References
- Schouten, L. J., et al. Incidence of brain metastases in a cohort of patients with carcinoma of the breast, colon, kidney, and lung and melanoma. Cancer. 94, 2698-2705 (2002).
- Lin, N. U., et al.
- Eichler, A. F., et al. The biology of brain metastases-translation to new therapies. Nat. Rev. Clin. Oncol. , (2011).
- Lockman, P. R., et al. Heterogeneous blood-tumor barrier permeability determines drug efficacy in experimental brain metastases of breast cancer. Clin. Cancer Res. 16, 5664-5678 (2010).
- Yoneda, T., et al. A bone-seeking clone exhibits different biological properties from the MDA-MB-231 parental human breast cancer cells and a brain-seeking clone in vivo and in. 16, 1486-1495 (2001).
- Palmieri, D., et al. Her-2 overexpression increases the metastatic outgrowth of breast cancer cells in the brain. Cancer Res. 67, 4190-4198 (2007).
- Percy, D. B., et al. In vivo characterization of changing blood-tumor barrier permeability in a mouse model of breast cancer metastasis: a complementary magnetic resonance imaging approach. Invest. Radiol. 46, 718-725 (2011).
- Zhou, H., et al. Longitudinal MRI evaluation of intracranial development and vascular characteristics of breast cancer brain metastases in a mouse model. PLoS One. 8, (2013).
- Zhou, H., et al. Dynamic near-infrared optical imaging of 2-deoxyglucose uptake by intracranial glioma of athymic mice. PLoS One. 4, (2009).
- Zhang, R. D., et al. Differential permeability of the blood-brain barrier in experimental brain metastases produced by human neoplasms implanted into nude mice. Am. J. Pathol. 141, 1115-1124 (1992).
- Mason, R. P., et al. Tumor oximetry: comparison of 19F MR EPI and electrodes. Adv. Exp. Med. Biol. 530, 19-27 (2003).
- Gril, B., et al. Pazopanib reveals a role for tumor cell B-Raf in the prevention of HER2+ breast cancer brain metastasis. Clin. Cancer Res. 17, 142-153 (2010).
