Summary
Een borstkanker hersenmetastasen muismodel wordt vastgesteld met echografie-imaging geleide intracardiale injectie van MDA-MB231/Br-GFP cellen. Ontwikkeling van multifocale intracraniële metastasen is longitudinaal gevolgd met behulp van hoge-resolutie 9.4 T MRI.
Abstract
Borstkanker hersenmetastasen, die zich in 30% van de patiënten met borstkanker in stadium IV, is geassocieerd met een hoge mortaliteit. De mediane overleving is slechts 6 maanden. Het is cruciaal om geschikte diermodellen moet de hemodynamische verspreiding van de metastatische cellen in het klinische scenario nabootsen. Hier introduceren we het gebruik van kleine dieren echografie om een nauwkeurige injectie van hersenen tropische borstkankercellen te begeleiden in de linker ventrikel van athymische naakt muizen. Longitudinale MRI wordt gebruikt voor het beoordelen intracraniële initiatie en groei van hersenmetastasen. Ultrageluid geleide intracardiale injectie zorgt niet alleen een accurate injectie en wordt een hoger percentage succesvolle maar ook aanzienlijk verminderde sterfte in vergelijking met onze vorige handmatige procedure. In vivo hoge resolutie MRI maakt de visualisatie van hyperintense multifocale laesies, zo klein als 310 urn in diameter op T 2-gewogen beelden na 3 weken na de injectie. Follow-up MRI openbaart intracraniële tumorgroei en toegenomen aantal metastasen die de gehele hersenen verdelen.
Introduction
Hersenmetastasen is de meest voorkomende maligniteit bij volwassenen intracraniale. De prognose is zeer slecht, met een mediane overleving van 4-6 maanden zelfs met agressieve behandeling. Borstkanker is een van de drie belangrijkste primaire kanker met een hoge morbiditeit van hersenmetastasen 1-3. Verschillende hersenen-trope borstkanker lijnen zijn in staat om de ontwikkeling van de hersenen uitzaaiingen na intracardiale of intracarotide injectie 4. Directe injectie van tumorcellen in het linker ventrikel kan de long capillaire bed omzeilen en daarmee de frequentie van het vormen hersenmetastasen met minimale viscerale metastasen. De MDA-MB231Br lijn is een van de meest gebruikte menselijke borstkanker lijnen hersenenmetastase ontwikkelen in diermodellen 5,6.
Net als veel andere studies 4,7, hebben we handmatige procedure van intracardiale injectie uitgevoerd in onze eerdere studies. Echter, slechts 50% succes rate werd verkregen met de handmatigeinjectie en een fractie van muizen overleden aan de herhaalde invasieve procedures als voorafgaande proeven mislukt. Hier introduceren we het gebruik van een beeldvormende geleide procedure om de injectie van hersenen die borstkankercellen veilig in de linker ventrikel van athymische muizen. Longitudinale hoge resolutie MRI wordt toegepast op intracraniële ontwikkeling van hersenmetastasen volgen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dierlijke procedures werden goedgekeurd door de Institutional Animal Care en gebruik Comite van de Universiteit van Texas Southwestern Medical Center.
1. Voorbereiding van de MDA-MB231/Br-GFP Cellen
- Ophalen en cultuur de MDA-MB231/Br-GFP cellen (vriendelijk verschaft door Drs. Palmieri en Steeg, NCI) in DMEM medium met 10% FBS, 1% glutamine en 1% penicilline / streptomycine.
- Let op de toestand van de cellen en kleur drager en vervang medium elke 2-3 dagen.
- Trypsinize en het verzamelen van de cellen bij 80% confluentie bereikt zoals beschreven in stappen 1.3.1-1.3.5:
- Verwijder het oude medium volledig en voeg 5 ml PBS (1x) om de cellen voorzichtig te wassen. Verwijder de PBS uit de schotel.
- Voeg 1,5 ml trypsine in de schaal; kantelt de schotel voorzichtig aan tot alle cellen worden gedekt door trypsine. Zet de schaal terug naar de cel incubator en houdt deze 37 ° C gedurende 1 min.
- Neem de schotel uit incubator en observerende cellen onder optische microscoop om de cellen los te waarborgen van de schotel.
- Voeg 3 ml medium om de werking van trypsine te stoppen. Verzamel de cel mengsel in een centrifugebuis. Centrifugeer het mengsel bij 2000 rpm gedurende 5 minuten.
- Verwijder het medium voorzichtig en resuspendeer de cellen in 5 ml serumvrij medium tot homogeen.
- Telling geschikte aantal cellen en resuspendeer ze in serumvrij DMEM medium met een uiteindelijke concentratie van 1,75 x 10 5 cellen in 100 pl volume.
- Neem 50 pi cel mengsel en voeg 50 ul trypaanblauwoplossing. Na mengen 10 ui mengsel en zorgvuldig toe te voegen aan de cel tellen glijbaan. Gebruik meerdere monsters om nauwkeurige schatting van het aantal cellen te waarborgen.
- Plak in de cel tellen glijbaan, een uiteinde in een tijd en de cel teller begint automatisch te tellen. Neem gemiddelde van alle telresultaten en bereken het totale aantal cellen.
- Centrifugeer de cellen opnieuw en resuspendeer henhet juiste volume van serumvrij medium te resulteren in de uiteindelijke concentratie van 1,75 x 10 5 cellen/100 pl volume.
- Plaats cellen op ijs voorafgaand aan intracardiale injectie.
2. Ultrasound Imaging-begeleide Intracardiale Injectie
- Gebruik vrouwelijk naakt muizen (BALB / c nu / nu) tussen 6-8 weken oud.
- Log in het imaging systeem. Initialiseer de transducer 704 (40 MHz).
- Start een nieuwe studie en vul de gegevens in.
- Verdoven (3% isoflurane/100% O2 per inductie kamer) en de dieren met isofluraan (2%) 100% O 2 (1 dm3 / min) te handhaven gedurende de gehele procedure via een neuskegel. Anesthesie wordt bevestigd wanneer er geen terugtrekking reflex is waargenomen met teen knijpen.
- Stel de temperatuur van de afbeeldingtafel tot 37 ° C. Tape de verdoofde muis om de verwarmde beeldvorming tafel in rugligging.
- Houd de ultrasone gel bij 37 ° C voorafgaand aan imaging. Breng de gel aan de borst van de muis.
- Monteer de transducer in de houder. Laat de transducer tot de gewenste beeldvorming diepte is bereikt. Beweeg de fase tot de linker ventrikel wordt geïdentificeerd met de aorta ascendens als oriëntatiepunt (figuur 1A). Vergrendelen de fase waarin een duidelijk beeld van de linker hartkamer wordt gevisualiseerd.
- Teken 100 ul van cel mengsel in een 1 ml spuit met een 22 G naald. Plaats en bevestig de spuit op de spuit monteren.
- Beweeg de spuit in de richting van de muis borst en beweeg het voorzichtig van links naar rechts totdat de naald zich in de beeldvorming gezichtsveld (alvorens de muis).
- Stel de naald hoogte en de hoek te streven langs de linker hartkamer.
- Doordringen in de naald in intercoastal ruimte onmiddellijk door de huid en spieren lagen in de linker ventrikel onder begeleiding van echografie.
Een indicatie van succesvolle insertie van de naald in de linker ventrikel is het terugvloeien van verse arterieel bloed (roze kleur in tegenstelling tot donkerrood veneuze bloed) in de spuit - Injecteer de cel mengsel langzaam (Figuur 1B).
- Na voltooiing, trekken de naald, til de transducer, het reinigen van de ultrasound gel met vochtig gaas en verwijderen tape.
- Bereid een schone kooi met een voorverwarmde pad.
- Leg het dier op het pad en observeer de dieren tot volledig herstel.
- Controleer het gedrag van het dier iedere 24 uur gedurende twee dagen.
- Algemene voorwaarden en neurologische tekenen van complicaties in de experimentele muizen worden routinematig gecontroleerd.
3. MRI Monitoring van intracraniële tumorontwikkeling
- Gebruik een 9,4 Tesla magneet om intracraniële ontwikkeling van de hersenen uitzaaiingen controleren.
- Initieer MRI twee weken na tumor implantatie en herhaal eenmaal per week gedurende drie weken.
- Verdoven de dieren met 3% isofluraan en te onderhouden onder genral anesthesie (1,5% isofluraan).
- Monitor en het dier lichaamstemperatuur en ademhaling constant gedurende het experiment te handhaven.
- Hoge resolutie multislice (14 segmenten met 1 mm dik, geen opening) T 1 - en T 2-gewogen coronale beelden, die het gebied van de frontale kwab van de fossa posterior, worden verkregen met de volgende parameters: T 1-gewogen beelden: spinecho meerdere slice (SEMS), TR / TE = 400 msec/20 msec, matrix: 256 x 256, FOV 20 x 20 mm, in het vlak resolutie: 78 x 78 micrometer 2. T 2-gewogen beelden: snelzwierend echo meerdere slice (FSEMS) sequenties, TR / TE = 2500 msec/48 msec, 8 echo treinen, matrix: 256 x 256, FOV 20 x 20 mm, in het vlak resolutie: 78 x 78 micrometer 28,9.
Tumorlaesies lijken helderder dan normaal hersenweefsel op T 2-gewogen beelden. - Tumor grootte wordt bepaald op T 2-gewogen beelden door handmatig een overzicht van de verhogendecing deel van de massa van elk beeld met behulp van MATLAB programma geschreven door ons 8.
Aangezien de meeste van de tumor diameters kleiner dan de snijdikte (1 mm), wordt de tumorgrootte gepresenteerd in vlak terrein eerder dan het volume.
4. H & E kleuring Bevestiging van de Metastasen
- Offer de muizen direct na de laatste MR scant, ontleedt de tumor-dragende hersenen en insluiten in oktober medium en -80 ° C bevroren
- Gedeelte van een reeks van 10 urn dikke coronale hersenen exemplaren met cryostaat.
- Voer H & E kleuring van de hersenen secties.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Met de hoge ruimtelijke resolutie van MRI (78 urn CCD-resolutie) kan hyperintenseletsels geïdentificeerd zo klein als 310 urn diameter (figuur 2). Aangezien de metastasen in deze studie zijn zeer klein en ontwikkeling van necrose en oedeem is minimaal, de hyperintense laesie op T 2-gewogen beelden echt vertegenwoordigde de tumormassa.
Longitudinale studies MRI mogelijk in vivo niet-invasieve evaluatie van tumorgroei. Zoals getoond in figuur 3, de hoge resolutie MRI kon meerdere kleine laesies 3 dagen na intracardiale injectie (Figuur 3A). Op week 4, de laesies die werden waargenomen in de vorige scan werden allemaal groter, meer nieuwe laesies verschenen T 2-gewogen beelden (Figuur 3B).
H & E kleuring onthulde zowel diffuse Soort cluster metastatische laesies (figuur 4).Vergrote schepen werden vaak gezien rond de tumor, met vermelding nonsprouting angiogenese (Figuur 4D).
Figuur 1. Echogeleide intracardiale injectie. (A) Identificatie van de aorta ascendens (pijl) als het boegbeeld van linker ventrikel van de muis hart. (B) Een naald (pijl) inbrengen in het linker ventrikel naar de tumorcellen te injecteren. Klik hier voor grotere afbeelding .
Figuur 2. Hoge resolutie T 2-gewogen beelden van borstkanker hersenmetastasen. Veertien opeenvolgende MRI plakjes van een vertegenwoordiger van de hersenen van muizen, verworven vier weken na intracardiale injectie, is duidelijk geworden dat multifocale metastasen verspreiden door de hele hersenen van muizen, van reukbol naar pontine en merg. Klik hier voor grotere afbeelding .
Figuur 3. Longitudinale MRI ontwikkeling hersenmetastasen. Een. Zes opeenvolgende coronale MRI secties in week 3 geïdentificeerd meerdere letsels met hyper-intensiteit op T 2-gewogen beelden. B. Een verhoogd aantal lesions verscheen op de beelden in week 4, en die laesies gezien op week 3 werd groter. Klik hier voor grotere afbeelding .
Figuur 4. Microscopische laesies werden waargenomen op H & E kleuring. A. Een hele mount coronale gedeelte afgebeeld meerdere laesies. BD. Hogere beelden vergroting vertoonden diffuse of typ cluster laesies (B en C). Vergrote schepen werden gezien rond de tumor. Klik hier voor grotere afbeelding .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
In deze studie hebben we aangetoond dat ultrageluid-beeldvorming geleide linker ventrikel injectie zorgt voor nauwkeurige zodat elk dier in deze studie ontwikkeld hersenmetastasen en geen dier dood waargenomen. De schoonheid van beeld-geleide injectie is dat het pad van de naald penetratie van de huid en tot slot in de linker ventrikel kan worden gecontroleerd en aangepast onder de afbeelding, die zich onderscheidt van de handmatige procedure vereist strikte anatomische oriëntatiepunten te volgen is.
Huidige inzichten van intracraniële ontwikkeling van hersenmetastasen zijn grotendeels gebaseerd op histologische studies op diermodellen 4,10. Echter, histologisch onderzoek normaal een groot aantal muizen die zijn gedood op verschillende tijdstippen na tumor implantatie. Wat nog belangrijker is, informatie over temporele ontwikkeling in individuele laesies ontbreekt van histologisch onderzoek.
In vivo beeldvorming belooft groter eiciëntie aangezien elk dier fungeert als zijn eigen controle en verschillende tijdstippen kunnen achtereenvolgens 7,11 worden onderzocht. T 2-gewogen beelden van hoge resolutie kan de detectie van multifocale tumorinitiatie in zeer vroeg stadium (letsels met een diameter van slechts 310 micrometer zichtbaar zijn). Longitudinale MRI stelt individuele hersenmetastasen na verloop van tijd te worden onderzocht. Bovendien zal in vivo invasieve MRI bijzonder waardevol longitudinale studie van therapeutische respons, zoals hele hersenen straling.
Vorming van multifocale hersenmetastasen is de kenmerken van de MDA-MB231Br model. Naast de MDA-MB231/Br-GFP cellijn toonden we in de huidige studie, de ouderlijke kloon MDA-MB231/Br en MDA-MB231/Br-luc ook vertonen soortgelijke metastatische laesies. In tegenstelling, hebben verscheidene andere hersenhelft die lijnen zoals MCF-7BR en 4T1 is aangetoond dat een solitaire metastase ontwikkelen na intracardiale injectie 12. Beidemodellen, spiegelen klinische tegenhangers, zijn nuttig diermodellen van hersenmetastasen. Echter, naast hersenmetastasen, viscerale metastasen, zoals long en botmetastasen worden vaak waargenomen in dit model. Oprichting van dierlijke modellen die hersenmetastasen uitsluitend ontwikkelen zal van cruciaal belang zijn, met name voor de evaluatie van de respons op de behandeling.
Tot slot hebben we het nut van imaging geleide intracardiale injectie om een hersenenmetastase muismodel en de hoge resolutie MRI om intracraniële ontwikkeling van multifocale metastasen te beoordelen in een muismodel vestigen aangetoond.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
We zijn dankbaar voor Drs. Diane Palmieri en Patricia Steeg van NCI voor het verstrekken van ons MDA-MB231Br cellen. Wij danken dr. Ralph Mason, heer Jason Reneau en mevrouw Ramona Lopes voor technische en collegiale ondersteuning. Dit werk werd mede ondersteund door de DOD IDEA Awards W81XWH-08-1-0583 en W81XWH-12-1-0317. MRI-experimenten werden uitgevoerd in de Advanced Imaging Research Center, een NIH BTRP # P41-RR02584 faciliteit, en echogeleide intracardiale injectie werd uitgevoerd met VisualSonics Vevo 770 onder 1S10RR02564801.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | HyClone | SH30022.01 | |
| Trypsin | Mediatech | 25-051-C1 | |
| Automatic cell counter | BioRad | TC10 | |
| Isoflurane | Baxter International Inc. | 1001936060 | |
| VisualSonics Vevo 770 High-Resolution Imaging System | Visual Sonics Inc. | ||
| 9.4 T horizontal bore magnet with a Varian INOVA Unity system | Agilent | ||
| O.C.T Compound | Sakura Finetek USA | 4583 |
References
- Schouten, L. J., et al. Incidence of brain metastases in a cohort of patients with carcinoma of the breast, colon, kidney, and lung and melanoma. Cancer. 94, 2698-2705 (2002).
- Lin, N. U., et al.
- Eichler, A. F., et al. The biology of brain metastases-translation to new therapies. Nat. Rev. Clin. Oncol. , (2011).
- Lockman, P. R., et al. Heterogeneous blood-tumor barrier permeability determines drug efficacy in experimental brain metastases of breast cancer. Clin. Cancer Res. 16, 5664-5678 (2010).
- Yoneda, T., et al. A bone-seeking clone exhibits different biological properties from the MDA-MB-231 parental human breast cancer cells and a brain-seeking clone in vivo and in. 16, 1486-1495 (2001).
- Palmieri, D., et al. Her-2 overexpression increases the metastatic outgrowth of breast cancer cells in the brain. Cancer Res. 67, 4190-4198 (2007).
- Percy, D. B., et al. In vivo characterization of changing blood-tumor barrier permeability in a mouse model of breast cancer metastasis: a complementary magnetic resonance imaging approach. Invest. Radiol. 46, 718-725 (2011).
- Zhou, H., et al. Longitudinal MRI evaluation of intracranial development and vascular characteristics of breast cancer brain metastases in a mouse model. PLoS One. 8, (2013).
- Zhou, H., et al. Dynamic near-infrared optical imaging of 2-deoxyglucose uptake by intracranial glioma of athymic mice. PLoS One. 4, (2009).
- Zhang, R. D., et al. Differential permeability of the blood-brain barrier in experimental brain metastases produced by human neoplasms implanted into nude mice. Am. J. Pathol. 141, 1115-1124 (1992).
- Mason, R. P., et al. Tumor oximetry: comparison of 19F MR EPI and electrodes. Adv. Exp. Med. Biol. 530, 19-27 (2003).
- Gril, B., et al. Pazopanib reveals a role for tumor cell B-Raf in the prevention of HER2+ breast cancer brain metastasis. Clin. Cancer Res. 17, 142-153 (2010).
