Summary
מודל שד סרטן מוח גרורות עכבר הוא הקים עם הזרקת intracardiac אולטרסאונד מונחה הדמיה של תאי MDA-MB231/Br-GFP. התפתחות של גרורות תוך גולגולתי multifocal כבר במעקב אורכים באמצעות רזולוציה גבוהה 9.4 T-MRI.
Abstract
גרורות במוח סרטן השד, המתרחשות ב30% מחולות בסרטן השד בשלב IV, קשורה בתמותה גבוהה. חציון ההישרדות היא רק 6 חודשים. זה קריטי כדי להיות מודלים של בעלי חיים מתאימים לחקות את ההתפשטות המודינמית של התאים גרורתי בתרחיש הקליני. כאן, אנו מציגים את השימוש בהדמית אולטרסאונד החיה קטנה כדי להדריך את ההזרקה מדויקת של תאי סרטן שד טרופי מוח לתוך החדר השמאלי של עכברים בעירום athymic. MRI אורך משמש להערכת חניכה וצמיחה של גרורות במוח תוך גולגולתי. הזרקת intracardiac מונחה אולטרסאונד מבטיחה לא רק בהזרקה מדויקת וזאת בשיעור מוצלח גבוהה יותר, אלא גם ירדה באופן משמעותי שיעור תמותה, בהשוואה להליך במדריך הקודם שלנו. בבדיקת MRI ברזולוציה גבוהה vivo מאפשרת ההדמיה של נגעי multifocal hyperintense, קטן כמו 310 מיקרומטר קוטר ב-T-משוקלל 2 תמונות ב3 שבועות לאחר הזרקה. FolloMRI w למעלה חושף את צמיחת גידול תוך גולגולתי ומספר גדל של גרורות שלהפיץ בכל המוח כולו.
Introduction
גרורות במוח היא הגידול הממאיר תוך גולגולתי השכיחה ביותר במבוגרים. התחזית היא ענייה מאוד, עם חציון הישרדות של 4-6 חודשים אפילו עם טיפול אגרסיבי. סרטן השד הוא אחת משלושת סוגי הסרטן העיקריים גדולים עם תחלואה גבוהה של גרורות במוח 1-3. קווי סרטן שד המוח טרופי כמה הם מסוגלים לפתח גרורות במוח לאחר intracardiac או הזרקת intracarotid 4. הזרקה ישירה של תאים סרטניים לתוך החדר השמאלי יכולה לעקוף את מיטת נימי ריאה ובכך להגדיל את השכיחות של יצירת גרורות במוח תוך מזעור גרורות קרביים. קו מד"א-MB231Br הוא אחד קווי סרטן השד האנושיים הנפוצים ביותר לפתח גרורות במוח במודלים של מכרסמים 5,6.
כמו רבים מחקרים אחרים 4,7, אנחנו צריכים לבצע הליך ידני של הזרקת intracardiac במחקרים הקודמים שלנו. עם זאת, רק 50% שיעור מוצלח הושג עם המדריךהזרקה ושבריר של עכברים מתו מהפרוצדורות פולשניות החוזרות ונשנות במידה וניסויים לפני נכשלו. כאן, אנו מציגים את השימוש בהליך מונחה הדמיה כדי לאבטח את ההזרקה של תאי סרטן שד המבקש מוח לתוך החדר השמאלי של עכברי athymic. MRI ברזולוציה גבוהה אורך מוחל לעקוב אחר התפתחות תוך גולגולתי של גרורות במוח.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
נהלי כל החיה אושרו על ידי הוועדה המוסדית טיפול בבעלי חיים ושימוש במרכז Southwestern הרפואי של אוניברסיטת טקסס.
1. הכנת תאי MDA-MB231/Br-GFP
- אחזר ותרבות תאי MDA-MB231/Br-GFP (הניתנים באדיבות על ידי בני הזוג. פלמיירי וSteeg, NCI) במדיום DMEM המכיל 10% FBS, גלוטמין 1% ו -1% פניצילין / סטרפטומיצין.
- שים לב למצבם של התאים והצבע של מדיום, ולהחליף בינוני כל 2-3 ימים.
- Trypsinize ולאסוף את התאים כאשר מגיע למפגש 80% כפי שמתואר בצעדים 1.3.1-1.3.5:
- הסר את המדיום הישן לחלוטין ולהוסיף 5 מיליליטר PBS (1x) כדי לשטוף את התאים בעדינות. הסר את PBS מהצלחת.
- הוסף 1.5 מיליליטר טריפסין בצלחת; להטות את הצלחת בעדינות כדי להבטיח את כל התאים מכוסים על ידי טריפסין. שים את הצלחת בחזרה לתא החממה ולשמור אותו ב37 מעלות צלזיוס במשך דקות 1.
- קח את המנה מתוך חממה ולבחוןהתאים תחת מיקרוסקופ אופטי כדי להבטיח את התאים להתנתק המנה.
- הוסף 3 מיליליטר בינוני כדי לעצור את ההשפעה של טריפסין. לאסוף את תערובת התאים בצינור צנטריפוגות. צנטריפוגה את התערובת על 2,000 סל"ד למשך 5 דקות.
- הסר את המדיום בזהירות וresuspend תאי 5 בינוני סרום ללא מיליליטר עד הומוגנית.
- רוזן המספר מתאים של תאי resuspend אותם במדיום DMEM החופשי בסרום עם ריכוז סופי של 1.75 x 10 5 תאים ב100 μl נפח.
- קח 50 תערובת תא μl ולהוסיף 50 μl Trypan הכחול. לאחר הערבוב, לקחת 10 תערובת μl ובזהירות להוסיף לשקופית ספירת תאים. השתמש בדוגמאות רבות כדי להבטיח הערכת מספר התא מדויקת.
- היצמד בשקופית ספירת תאים, קצה אחד בכל פעם ודלפק התא מתחיל לספור באופן אוטומטי. קח את הממוצע של כל תוצאות הספירה והחישוב הכולל מספר התא.
- צנטריפוגה התאים שוב וresuspend אותםהנפח המתאים של מדיום סרום ללא לגרום לריכוז הסופי של 1.75 x 10 5 cells/100 μl נפח.
- תאים מניחים על קרח לפני זריקת intracardiac.
2. הזרקת intracardiac מונחה ההדמיה אולטראסאונד
- השתמש בעכברי עירום נשיים (BALB / ג נו / נו) בין 6-8 שבועות.
- התחבר מערכת ההדמיה. לאתחל את 704 (MHz 40) מתמר.
- התחל מחקר חדש ולמלא את הפרטים.
- הרדימי (3% O isoflurane/100% 2 בחדר אינדוקציה) ולשמור על בעלי החיים עם isoflurane (2%) ב100% O 2 (DM 1 3 / min) במהלך ההליך כולו באמצעות חרטומו. הרדמה הוא אישר כאשר לא רפלקס נסיגה הוא ציין עם קמצוץ הבוהן.
- הגדר את הטמפרטורה של טבלת ההדמיה 37 ° C. תדביק את העכבר הרדים לשולחן ההדמיה המחומם במצב שכיבה.
- שמור ג'ל אולטרסאונד על 37 מעלות צלזיוס לפני imהזדקנות. להחיל את הג'ל לחזו של העכבר.
- הר מתמר בבעל. מנמיכים את המתמר עד שיגיע לעומק ההדמיה הרצוי. להזיז את הבמה עד לחדר השמאלי מזוהה עם אב העורקים עולים כאתר (איור 1 א). נעל את הבמה כאשר תצוגה ברורה של חדר השמאלי היא מדמיין.
- צייר של תערובת תא 100 μl לתוך מזרק 1 מיליליטר עם מחט G 22. מקום ולתקן את המזרק על מזרק הר.
- הזז את המזרק קדימה לכיוון החזה בעכבר ולעבור אותו בזהירות מצד לצד עד שקצה המחט הוא בתחום ההדמיה של נוף (לפני הכניסה לעכבר).
- התאם את גובה המחט וזווית כדי לכוון את החדר השמאלי.
- לחדור את מחט המזרק לתוך חלל intercoastal מייד דרך שכבות עור ושרירים לתוך החדר השמאלי תחת הדרכתו של ההדמיה אולטרה סאונד.
אינדיקציה להחדרה מוצלחת של המחט לתוך ventri השמאלCLE הוא ריפלוקס של דם טרי בעורקים (צבע ורוד בניגוד לדם ורידים אדום כהה) לתוך המזרק - הזרק את תערובת התא לאט (איור 1).
- בסיום, למשוך את המחט, להרים את המתמר, לנקות את הג'ל אולטרסאונד עם גזה לחה ולהסיר קלטת.
- הכן את כלוב נקי עם כרית שחומם מראש.
- מניחים את החיה על הכרית ולבחון את החיה עד להחלמה מלאה.
- לפקח על התנהגותם של בעלי החיים בכל שעות 24 במשך יומיים.
- תנאים כלליים וסימני נוירולוגים של סיבוכים בעכברי ניסוי מנוטרים באופן שיגרתי.
3. ניטור ה-MRI של התפתחות גידול תוך גולגולתי
- להשתמש במגנט טסלה 9.4 לעקוב אחר התפתחות תוך גולגולתי של גרורות במוח.
- ליזום MRI שבועיים לאחר השתלת גידול ולחזור פעם בשבוע לתקופה של עד שלושה שבועות.
- להרדים את החיות עם 3% isoflurane ולשמור אותם תחת גןההרדמה RAL (isoflurane 1.5%).
- לפקח ולשמור על טמפרטורת הגוף של בעלי החיים ומתמידים נשימה לאורך כל הניסוי.
- multislice ברזולוציה גבוהה (14 פרוסות עם 1 מ"מ עובי, אין פער) T 1 - ו-T 2 משוקללי תמונות העטרה, המכסות את האזור מהאונה הקדמית לפוסה האחורית, נרכשים עם הפרמטרים הבאים: תמונות 1 משוקללת-T: ספין הפרוסה מרובה הד (SEM), TR / TE אלפיות = 400 msec/20, מטריקס: 256 x 256, FOV מ"מ 20 x 20, ברזולוציה מטוס: 78 x 78 מיקרומטר 2. תמונות משוקללות-2 T: מהירות ספין הד הפרוסה מרובה רצפים (FSEMS), TR / TE אלפיות = 2500 msec/48, 8 רכבות הד, מטריקס: 256 x 256, FOV 20 x 20 מ"מ, ברזולוציה מטוס: 78 x 78 מיקרומטר 28,9.
נגעים סרטניים מופיעים בהירים יותר מרקמות מוח נורמליות על T תמונות משוקללת 2. - גודל גידול נקבע על T תמונות 2-משוקללות ידי התוויית enhan ידניcing חלק מהמסה על כל תמונה על ידי שימוש בתוכניות MATLAB שנכתבו על ידינו 8.
בהתחשב ביותר של הגידול בקטרים קטנים יותר מהעובי פרוס (1 מ"מ), גודל הגידול מוצג כבאזור מטוס ולא את עוצמת הקול.
4. H & E מכתים אישור גרורות
- להקריב את העכברים מייד לאחר MR האחרון לסרוק, לנתח את המוח של נושאי גידול ולהטביע אותו במדיום OCT ו קפוא ב-80 ° C.
- סעיף סדרה של 10 מוח העטרה מיקרומטר בעובי דגימות עם cryostat.
- לבצע צביעת H & E על החלקים במוח.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
עם הרזולוציה מרחבית הגבוהה של ה-MRI (78 מיקרומטר ברזולוציה מטוס), ניתן לזהות נגעי hyperintense קטנים כמו 310 מיקרומטר קוטר (איור 2). מאז גרורות במחקר זה הן קטנות מאוד והתפתחות של נמק ובצקת הוא מינימאלי, נגע hyperintense על T תמונות משוקללת 2 באמת ייצג את מסת הגידול.
מחקרי MRI אורך לאפשר בהערכה לא פולשנית vivo של גידול. כפי שניתן לראות באיור 3, MRI ברזולוציה הגבוהה היה מסוגל לזהות כמה נגעים קטנים 3 שבועות לאחר (איור 3 א) הזרקת intracardiac. בשבוע 4, הנגעים שנראו בסריקה הקודמת כל הפכו לגדולים יותר, יותר נגעים חדשים הופיעו בתמונות T משוקללות-2 (איור 3 ב).
צביעת H & E חשפה או מפוזרת או גרורות סוג האשכול (איור 4).כלי מוגדל נראו לעתים קרובות סביב הגידול, מה שמעיד אנגיוגנזה nonsprouting (איור 4D).
איור 1. הזרקה מונחה אולטרסאונד intracardiac. (א) זיהוי של אב העורקים עולים (חץ) כנקודת הציון של חדר השמאלי של לב העכבר. (ב) החדרת מחט (חץ) לתוך החדר השמאלי להזריק את תאי גידול. לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.
איור 2. רזולוציה גבוהה T 2 משוקלל תמונות של גרורות במוח סרטן השד. ארבע עשר פרוסות MRI ברציפות של מוח עכבר נציג, שנרכש וארבעה שבועות לאחר הזרקת intracardiac, ברור חשף גרורות multifocal הפצה דרך כל מוח העכבר, מנורת חוש הריח לpontine ומדולה. הקליקו כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.
איור 3. MRI אורך של התפתחות של גרורות במוח. . שישה סעיפי MRI העטרה ברציפות בשבוע 3 זיהו נגעים מרובים עם Hyper-עוצמה על T תמונות משוקללת 2. ב '. מספר גדל של ליטרesions הופיע בתמונות בשבוע 4, ואלה הנגעים ראו בשבוע 3 היו גדולים יותר. לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.
איור 4. נגעים מיקרוסקופיים נצפו על צביעת H & E.. סעיף העטרה הר שלם מתואר נגעים מרובים. BD. תמונות בהגדלה גבוהות יותר הראו גם מפוזרת או נגעי סוג האשכול (B ו-C). כלי מוגדל נראו סביב הגידול. לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
במחקר הנוכחי, יש לנו הראו כי הזרקה של חדר השמאל מונחה הדמיה אולטרסאונד מבטיחה את הדיוק, כך שכל בעלי חיים בגרורות במוח מחקר פיתח את זה ולא מוות של בעלי חיים נצפו. היופי של הזרקת דימוי מודרך הוא שהדרך של חדירת מחט לעור ולבסוף לתוך החדר השמאלי יכולה להיות במעקב ומותאם תחת תמונה, שהוא שונה מההליך הידני הדורש ציוני דרך אנטומיים קפדניות לעקוב.
הבנות הנוכחיות של התפתחות של גרורות במוח תוך גולגולת מבוססות במידה רבה על מחקרים היסטולוגית במודלים של בעלי החיים 4,10. עם זאת, מחקרים היסטולוגית בדרך כלל דורשים מספר רב של עכברים, כי הם נהרגו בנקודות זמן שונות לאחר השתלת גידול. חשוב מכך, מידע על פיתוח זמני בנגעי אדם חסר ממחקרים היסטולוגית.
In vivo הדמיה מבטיחה דואר גדול יותרfficiency שכן כל בעלי חיים משמש כשליטה שלו ונקודות זמן מרובות יכול להיבחן ברצף 7,11. תמונות T 2 משוקלל ברזולוציה גבוהה תאפשר זיהוי של התחלה של גידול בmultifocal בשלב מוקדם מאוד (נגעים בקוטר קטן כמו 310 מיקרומטר נראה לעין). אורך ה-MRI מאפשר גרורות במוח אדם כדי להיבחן לאורך זמן. יתר על כן, in vivo פולשנית MRI יהיה יקר במיוחד במחקר אורך של תגובה טיפולית, כגון: קרינת המוח כולו.
היווצרות של גרורות במוח multifocal היא המאפיינים של מודל מד"א-MB231Br. חוץ משורת תאי MDA-MB231/Br-GFP שהראינו במחקר הנוכחי, MDA-MB231/Br שיבוט ההורים וMDA-MB231/Br-luc גם תערוכת גרורות דומות. לעומת זאת, הוכחו כמה קווים שוחר אחרים במוח כגון MCF-7Br ו4T1 לפתח גרורות בודדות לאחר הזרקת intracardiac 12. שניהםמודלים, שיקוף עמיתים קליניים, הם מודלים של בעלי חיים שימושיים של גרורות במוח. עם זאת, בנוסף לגרורות במוח, גרורות קרביים, כגון גרורות ריאות ועצמות הם נצפו לעתים קרובות במודל זה. הקמת מודלים של בעלי חיים המתפתחים גרורות במוח באופן בלעדי תהיה קריטית, בפרט, להערכת תגובה לטיפול.
לסיכום, יש לנו הפגנו את השימושיות של הזרקת intracardiac מונחה הדמיה לבסס מודל מוח גרורות עכבר וMRI ברזולוציה הגבוהה כדי להעריך את ההתפתחות תוך גולגולתי של גרורות multifocal במודל של עכברים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
אין ניגודי האינטרסים הכריזו.
Acknowledgments
אנו אסירי תודה לבני זוג. דיאן פלמיירי ופטרישיה Steeg של NCI שספק לנו תאי MDA-MB231Br. אנו מודים לד"ר ראלף מייסון, מר ג'ייסון Reneau וגב 'רמונה לופס לתמיכה טכנית וקולגיאלית. עבודה זו נתמכה בחלקה על ידי IDEA DOD פרסים W81XWH-08-1-0,583 וW81XWH-12-1-0,317. ניסויי MRI בוצעו במרכז ההדמיה מתקדם למחקר, מתקן NIH BTRP # P41-RR02584, והזרקת intracardiac אולטרסאונד מונחה בוצעה עם VisualSonics Vevo 770 תחת 1S10RR02564801.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | HyClone | SH30022.01 | |
| Trypsin | Mediatech | 25-051-C1 | |
| Automatic cell counter | BioRad | TC10 | |
| Isoflurane | Baxter International Inc. | 1001936060 | |
| VisualSonics Vevo 770 High-Resolution Imaging System | Visual Sonics Inc. | ||
| 9.4 T horizontal bore magnet with a Varian INOVA Unity system | Agilent | ||
| O.C.T Compound | Sakura Finetek USA | 4583 |
References
- Schouten, L. J., et al. Incidence of brain metastases in a cohort of patients with carcinoma of the breast, colon, kidney, and lung and melanoma. Cancer. 94, 2698-2705 (2002).
- Lin, N. U., et al.
- Eichler, A. F., et al. The biology of brain metastases-translation to new therapies. Nat. Rev. Clin. Oncol. , (2011).
- Lockman, P. R., et al. Heterogeneous blood-tumor barrier permeability determines drug efficacy in experimental brain metastases of breast cancer. Clin. Cancer Res. 16, 5664-5678 (2010).
- Yoneda, T., et al. A bone-seeking clone exhibits different biological properties from the MDA-MB-231 parental human breast cancer cells and a brain-seeking clone in vivo and in. 16, 1486-1495 (2001).
- Palmieri, D., et al. Her-2 overexpression increases the metastatic outgrowth of breast cancer cells in the brain. Cancer Res. 67, 4190-4198 (2007).
- Percy, D. B., et al. In vivo characterization of changing blood-tumor barrier permeability in a mouse model of breast cancer metastasis: a complementary magnetic resonance imaging approach. Invest. Radiol. 46, 718-725 (2011).
- Zhou, H., et al. Longitudinal MRI evaluation of intracranial development and vascular characteristics of breast cancer brain metastases in a mouse model. PLoS One. 8, (2013).
- Zhou, H., et al. Dynamic near-infrared optical imaging of 2-deoxyglucose uptake by intracranial glioma of athymic mice. PLoS One. 4, (2009).
- Zhang, R. D., et al. Differential permeability of the blood-brain barrier in experimental brain metastases produced by human neoplasms implanted into nude mice. Am. J. Pathol. 141, 1115-1124 (1992).
- Mason, R. P., et al. Tumor oximetry: comparison of 19F MR EPI and electrodes. Adv. Exp. Med. Biol. 530, 19-27 (2003).
- Gril, B., et al. Pazopanib reveals a role for tumor cell B-Raf in the prevention of HER2+ breast cancer brain metastasis. Clin. Cancer Res. 17, 142-153 (2010).
