Summary
एक स्तन कैंसर मस्तिष्क मेटास्टेसिस माउस मॉडल MDA-MB231/Br-GFP कोशिकाओं के अल्ट्रासाउंड इमेजिंग निर्देशित intracardiac इंजेक्शन के साथ स्थापित है. Multifocal अंतर्कपालीय metastases के विकास के उच्च संकल्प 9.4 टी एमआरआई प्रयोग अनुलंबीय नजर रखी गई है.
Abstract
स्तन कैंसर मस्तिष्क मेटास्टेसिस, चतुर्थ चरण में स्तन कैंसर के रोगियों के 30% में होने वाली उच्च मृत्यु दर के साथ जुड़ा हुआ है. बीच का अस्तित्व केवल 6 महीने है. यह नैदानिक परिदृश्य में metastatic कोशिकाओं के hemodynamic प्रसार नकल करने के लिए उपयुक्त पशु मॉडल के लिए महत्वपूर्ण है. यहाँ, हम athymic नग्न चूहों के बाएं वेंट्रिकल में मस्तिष्क उष्णकटिबंधीय स्तन कैंसर की कोशिकाओं का एक सटीक इंजेक्शन मार्गदर्शन करने के लिए छोटे जानवर अल्ट्रासाउंड इमेजिंग का उपयोग शुरू कर रहे हैं. अनुदैर्ध्य एमआरआई intracranial दीक्षा और मस्तिष्क metastases के विकास का आकलन करने के लिए प्रयोग किया जाता है. अल्ट्रासाउंड निर्देशित intracardiac इंजेक्शन एक सटीक इंजेक्शन और इसके द्वारा एक उच्च सफल दर न केवल यह सुनिश्चित करता है लेकिन यह भी हमारे पिछले मैनुअल प्रक्रिया की तुलना में काफी मृत्यु दर में कमी हुई. में vivo उच्च संकल्प एमआरआई के रूप में छोटे रूप में, hyperintense Multifocal घावों के दृश्य की अनुमति देता 310 माइक्रोन टी पर व्यास में 3 सप्ताह के बाद इंजेक्शन पर छवियों 2 भारित. Folloडब्ल्यू ऊपर एमआरआई intracranial ट्यूमर के विकास और पूरे मस्तिष्क भर में वितरित कि मेटास्टेसिस की संख्या में वृद्धि का पता चलता है.
Introduction
मस्तिष्क मेटास्टेसिस वयस्कों में सबसे आम अंतर्कपालीय द्रोह है. रोग का निदान भी आक्रामक उपचार के साथ 4-6 महीने की एक औसत अस्तित्व के साथ, अत्यंत गरीब है. स्तन कैंसर मस्तिष्क मेटास्टेसिस 1-3 की एक उच्च रुग्णता के साथ तीन प्रमुख प्राथमिक कैंसर से एक है. कई मस्तिष्क रेखा स्तन कैंसर लाइनों हृदी या intracarotid इंजेक्शन 4 के बाद मस्तिष्क metastases विकसित करने में सक्षम हैं. बाएं वेंट्रिकल में ट्यूमर कोशिकाओं के प्रत्यक्ष इंजेक्शन फेफड़ों केशिका बिस्तर बाईपास और इस प्रकार आंत मेटास्टेसिस जबकि कम से कम मस्तिष्क metastases के गठन की घटनाओं में वृद्धि कर सकते हैं. एमडीए MB231Br लाइन कृंतक मॉडल 5,6 में मस्तिष्क मेटास्टेसिस विकसित करने के लिए सबसे व्यापक रूप से इस्तेमाल मानव स्तन कैंसर लाइनों में से एक है.
कई अन्य अध्ययनों 4,7 की तरह, हम हमारे पिछले अध्ययनों में intracardiac इंजेक्शन की एक पुस्तिका प्रक्रिया का प्रदर्शन किया है. हालांकि, केवल 50% सफल दर मैनुअल के साथ प्राप्त हुई थीपिछले परीक्षणों में विफल रहा है, तो इंजेक्शन और चूहों के एक अंश को दोहराया आक्रामक प्रक्रियाओं से मृत्यु हो गई. यहाँ, हम athymic चूहों के बाएं वेंट्रिकल में मस्तिष्क की मांग स्तन कैंसर की कोशिकाओं के इंजेक्शन को सुरक्षित करने के लिए एक इमेजिंग निर्देशित प्रक्रिया का उपयोग शुरू कर रहे हैं. अनुदैर्ध्य उच्च संकल्प एमआरआई मस्तिष्क metastases के intracranial विकास का पालन करने के लिए लागू किया जाता है.
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Protocol
सभी पशु प्रक्रियाओं टेक्सास विश्वविद्यालय के दक्षिण मेडिकल सेंटर के संस्थागत पशु की देखभाल और उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित किया गया.
1. MDA-MB231/Br-GFP कक्ष की तैयारी
- 10% FBS, 1% glutamine और 1% पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन युक्त DMEM मध्यम में (कृपया डीआरएस. Palmieri और Steeg, NCI द्वारा प्रदान की) MDA-MB231/Br-GFP कोशिकाओं निकालें और संस्कृति.
- कोशिकाओं और मध्यम के रंग की स्थिति का पर्यवेक्षण, और हर 2-3 दिनों मध्यम बदलें.
- Trypsinize और चरणों में उल्लिखित के रूप में 80% संगम 1.3.1-1.3.5 पहुँच जाता है जब कोशिकाओं को इकट्ठा:
- पूरी तरह से पुराने मध्यम निकालें और धीरे कोशिकाओं को धोने के लिए 5 मिलीलीटर पीबीएस (1x) जोड़ें. पकवान से पीबीएस निकालें.
- डिश में 1.5 मिलीलीटर Trypsin जोड़ें, सभी कक्षों Trypsin द्वारा कवर कर रहे हैं सुनिश्चित करने के लिए धीरे पकवान झुकाव. वापस सेल इनक्यूबेटर में पकवान रखो और 1 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर रहते हैं.
- इनक्यूबेटर से बाहर पकवान लो और निरीक्षणकोशिकाओं को सुनिश्चित करने के लिए ऑप्टिकल माइक्रोस्कोप के तहत कोशिकाओं पकवान से अलग.
- Trypsin के प्रभाव को रोकने के लिए 3 एमएल मध्यम जोड़ें. एक अपकेंद्रित्र ट्यूब में सेल मिश्रण लीजिए. 5 मिनट के लिए 2000 rpm पर मिश्रण अपकेंद्रित्र.
- ध्यान से मध्यम निकालें और समरूप तक 5 मिलीलीटर सीरम मुक्त माध्यम में कोशिकाओं resuspend.
- कोशिकाओं की उचित संख्या की गणना और 100 μl मात्रा में 1.75 x 10 5 कोशिकाओं के अंतिम एकाग्रता के साथ सीरम मुक्त DMEM मध्यम में resuspend.
- 50 μl सेल मिश्रण ले लो और 50 μl Trypan ब्लू जोड़ें. मिश्रण के बाद, 10 μl मिश्रण लेने के लिए और ध्यान से सेल गिनती स्लाइड में जोड़ें. सही सेल नंबर आकलन सुनिश्चित करने के लिए कई नमूने का प्रयोग करें.
- सेल गिनती स्लाइड, एक समय में एक अंत और सेल काउंटर स्वतः गिनती शुरू होता है में रहो. सभी गिनती के परिणाम की औसत ले और कुल सेल संख्या की गणना.
- फिर कोशिकाओं अपकेंद्रित्र और में resuspendमात्रा μl 1.75 x 10 5 cells/100 के अंतिम एकाग्रता में परिणाम के लिए सीरम मुक्त माध्यम से उचित मात्रा.
- पूर्व intracardiac इंजेक्शन के लिए बर्फ पर जगह कोशिकाओं.
2. अल्ट्रासाउंड इमेजिंग निर्देशित intracardiac इंजेक्शन
- पुराने 6-8 सप्ताह के बीच महिला नग्न चूहों (BALB / ग परमाणु / यू) का प्रयोग करें.
- इमेजिंग प्रणाली में लॉग इन करें. ट्रांसड्यूसर 704 (40 मेगाहर्ट्ज) को प्रारम्भ करें.
- एक नए अध्ययन शुरू करें और जानकारी भरें.
- चतनाशून्य (एक प्रेरण कक्ष में 3% isoflurane/100% 2 हे) और एक नाक शंकु के माध्यम से पूरी प्रक्रिया के दौरान 100% 2 हे (1 डीएम 3 / मिनट) में isoflurane (2%) के साथ पशुओं को बनाए रखने. कोई वापसी पलटा पैर के अंगूठे चुटकी के साथ मनाया जाता है जब संज्ञाहरण की पुष्टि की है.
- 37 डिग्री सेल्सियस के लिए इमेजिंग तालिका का तापमान सेट लापरवाह स्थिति में गरम इमेजिंग मेज पर anesthetized माउस टेप.
- Im करने से पहले 37 डिग्री सेल्सियस पर अल्ट्रासाउंड जेल रखेंउम्र बढ़ने. माउस की छाती को जेल लागू करें.
- धारक में ट्रांसड्यूसर माउंट. वांछित इमेजिंग गहराई तक पहुँच जाता है जब तक ट्रांसड्यूसर कम करें. बाएं वेंट्रिकल मील का पत्थर के रूप में आरोही महाधमनी (चित्रा 1 ए) के साथ की पहचान की है, जब तक मंच पर ले जाएँ. बाएं वेंट्रिकल की एक स्पष्ट दृष्टिकोण कल्पना है जब मंच लॉक.
- एक 22 जी सुई के साथ एक 1 मिलीलीटर सिरिंज में सेल मिश्रण के 100 μl ड्रा. प्लेस और माउंट सिरिंज पर सिरिंज तय कर लो.
- माउस छाती की ओर आगे सिरिंज ले जाएँ और सुई टिप (माउस प्रवेश करने से पहले) देखने के इमेजिंग क्षेत्र में है जब तक ध्यान से यह पक्ष को ओर ले जाएँ.
- बाएं वेंट्रिकल नीचे उद्देश्य के लिए सुई ऊंचाई और कोण समायोजित करें.
- अल्ट्रासाउंड इमेजिंग के मार्गदर्शन में बाएं वेंट्रिकल में तुरंत त्वचा और मांसपेशियों की परतों के माध्यम से intercoastal अंतरिक्ष में सिरिंज सुई घुसना.
बाईं ventri में सुई की सफल सम्मिलन का एक संकेत हैCLE सिरिंज में ताजा रक्त धमनियों (गहरे लाल शिरापरक रक्त के विपरीत गुलाबी रंग) के भाटा है - सेल मिश्रण धीरे धीरे (चित्रा 1 बी) इंजेक्षन.
- पूरा होने पर, सुई वापस लेने ट्रांसड्यूसर उठा, घटा धुंध के साथ अल्ट्रासाउंड जेल साफ और टेप हटा दें.
- एक preheated पैड के साथ एक साफ पिंजरे तैयार करें.
- पैड पर पशु रखें और पूरी वसूली तक पशु पालन.
- जानवर के व्यवहार दो दिनों के लिए हर 24 घंटे की निगरानी.
- सामान्य अनुदेश और प्रयोगात्मक चूहों में जटिलताओं के तंत्रिका संबंधी लक्षण नियमित निगरानी कर रहे हैं.
3. Intracranial ट्यूमर के विकास का एमआरआई निगरानी
- मस्तिष्क metastases के intracranial विकास पर नजर रखने के लिए एक 9.4 टेस्ला चुंबक का उपयोग करें.
- दो सप्ताह ट्यूमर आरोपण के बाद एमआरआई और आरंभ करने के लिए तीन सप्ताह तक एक बार एक सप्ताह दोहराएँ.
- 3 isoflurane% के साथ जानवरों शांत और जीन के तहत उन्हें बनाए रखने केRAL संज्ञाहरण (1.5 isoflurane%).
- मॉनिटर और प्रयोग के दौरान पशु शरीर का तापमान और श्वसन निरंतर बनाए रखें.
- उच्च संकल्प multislice (1 मिमी के साथ 14 स्लाइस मोटी, कोई अंतर) 1 टी - और टी 2 भारित राज्याभिषेक पीछे खात को ललाट पालि से क्षेत्र को कवर छवियों, निम्नलिखित मानकों के साथ प्राप्त कर रहे हैं: 1 टी भारित छवियों: गूंज कई टुकड़ा (एसईएम) स्पिन, टी.आर. / ते = 400 msec/20 मिसे, मैट्रिक्स: x 256 256, विमान संकल्प में FOV 20 x 20 मिमी,: 78 x 78 माइक्रोन 2. टी 2 भारित छवियों: 256 x 256, FOV 20 x 20 मिमी, विमान संकल्प में: 78 x 78 माइक्रोन तेजी से स्पिन कई टुकड़ा (FSEMS) दृश्यों, टी.आर. / ते = 2500 msec/48 मिसे, 8 गूंज गाड़ियों, मैट्रिक्स गूंज 28,9.
ट्यूमर के घावों टी 2 भारित छवियों पर सामान्य मस्तिष्क के ऊतकों की तुलना में उज्जवल दिखाई देते हैं. - ट्यूमर के आकार को मैन्युअल enhan रूपरेखा से टी 2 भारित छवियों पर निर्धारित किया जाता हैहमें 8 द्वारा लिखित matlab कार्यक्रमों का उपयोग करके प्रत्येक छवि पर जन के हिस्से cing.
व्यास टुकड़ा मोटाई (1 मिमी) से छोटे हैं ट्यूमर का सबसे को देखते हुए, ट्यूमर के आकार बल्कि मात्रा से विमान क्षेत्र में के रूप में प्रस्तुत किया है.
4. एच एंड ई धुंधला Metastases अनुरुप
- ट्यूमर असर दिमाग काटना, तुरंत पिछले एमआर स्कैन करने के बाद चूहों बलिदान और अक्टूबर माध्यम में यह एम्बेड और सेल्सियस -80 में जमे हुए
- धारा 10 माइक्रोन मोटी राज्याभिषेक मस्तिष्क की एक श्रृंखला cryostat के साथ नमूनों.
- मस्तिष्क वर्गों पर एच ई धुंधला प्रदर्शन करना.
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Representative Results
एमआरआई (विमान संकल्प में 78 माइक्रोन) के उच्च स्थानिक संकल्प के साथ, hyperintense घावों (चित्रा 2) के व्यास में 310 मीटर के रूप में छोटे रूप में पहचाना जा सकता है. इस अध्ययन में मेटास्टेसिस बहुत छोटे और गल जाना और सूजन के विकास के बाद से टी 2 भारित छवियों पर hyperintense घाव सही मायने में ट्यूमर जन प्रतिनिधित्व कम है.
अनुदैर्ध्य एमआरआई अध्ययन ट्यूमर के विकास के विवो noninvasive मूल्यांकन में अनुमति देते हैं. 3 चित्र में दिखाया गया है, उच्च संकल्प एमआरआई 3 सप्ताह intracardiac इंजेक्शन (चित्रा 3) के बाद कई छोटे घावों का पता लगाने में सक्षम था. सप्ताह 4, पिछले स्कैन सभी में देखा गया था कि घावों बड़ा हो गया है, और अधिक नए घावों टी 2 भारित छवियों (3B चित्रा) पर दिखाई दिया.
एच एंड ई धुंधला (चित्रा 4) फैलाना या क्लस्टर प्रकार metastatic घावों या तो पता चला.बढ़े जहाजों अक्सर nonsprouting angiogenesis (चित्रा 4D) का संकेत है, ट्यूमर के आसपास देखा गया था.
चित्रा 1. अल्ट्रासाउंड निर्देशित intracardiac इंजेक्शन. माउस दिल के बाएं वेंट्रिकल के लिए मील का पत्थर के रूप में आरोही महाधमनी (तीर) (ए) पहचान. (बी) के ट्यूमर कोशिकाओं इंजेक्षन करने के लिए बाएं वेंट्रिकल में एक सुई (तीर) सम्मिलन. बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें .
चित्रा 2. उच्च संकल्प टी 2 भारित स्तन कैंसर मस्तिष्क मेटास्टेसिस की छवियों. चौदह लगातार एमआरआई स्लाइस चार सप्ताह intracardiac इंजेक्शन के बाद का अधिग्रहण एक प्रतिनिधि माउस मस्तिष्क, की, स्पष्ट रूप से Multifocal मेटास्टेसिस pontine और मज्जा को घ्राण बल्ब से, पूरे माउस मस्तिष्क के माध्यम से वितरण. पता चला बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें .
चित्रा 3. मस्तिष्क metastases के विकास के अनुदैर्ध्य एमआरआई. 3 सप्ताह में एक. लगातार छह राज्याभिषेक एमआरआई वर्गों टी 2 भारित छवियों. बी पर अति तीव्रता के साथ कई घावों की पहचान की. एल की संख्या में वृद्धिesions 4 सप्ताह में छवियों पर दिखाई दिया, और सप्ताह 3 पर देखा उन घावों बड़ा हो गया. बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें .
चित्रा 4. सूक्ष्म घावों एच ई धुंधला पर मनाया गया. ए. एक पूरा पर्वत राज्याभिषेक अनुभाग कई घावों दर्शाया. बी. उच्च बढ़ाई छवियों (बी और सी) फैलाना या क्लस्टर प्रकार के घावों या तो पता चला. बढ़े वाहिकाओं ट्यूमर के आसपास देखा गया था. बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें .
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Discussion
अध्ययन में मौजूद है, हम इस अध्ययन विकसित मस्तिष्क metastases में हर जानवर और कोई जानवर मौत मनाया गया इतना है कि अल्ट्रासाउंड इमेजिंग निर्देशित बाएं निलय इंजेक्शन सटीकता सुनिश्चित करता है कि प्रदर्शन किया है. छवि निर्देशित इंजेक्शन की सुंदरता त्वचा और अंत में बाएं वेंट्रिकल में की सुई प्रवेश के मार्ग पर नजर रखी और पालन करने के सख्त शारीरिक स्थलों की आवश्यकता मैनुअल प्रक्रिया से अलग है जो छवि है, के तहत समायोजित किया जा सकता है.
मस्तिष्क metastases के intracranial विकास की वर्तमान समझ काफी हद तक पशु मॉडल 4,10 पर ऊतकीय अध्ययन पर आधारित हैं. हालांकि, ऊतकीय पढ़ाई सामान्य रूप से ट्यूमर आरोपण के बाद अलग अलग समय बिंदुओं पर मारे गए हैं कि चूहों की एक बड़ी संख्या की आवश्यकता होती है. इससे भी महत्वपूर्ण बात, व्यक्तिगत घावों में अस्थायी विकास के बारे में जानकारी ऊतकीय पढ़ाई से कमी है.
Vivo में इमेजिंग अधिक से अधिक ई का वादाfficiency प्रत्येक जानवर का अपना नियंत्रण और कई बार बिंदुओं के रूप में कार्य करता है के बाद से क्रमिक रूप से 7,11 की जांच की जा सकती है. (310 माइक्रोन दिखाई दे रहे हैं के रूप में छोटे रूप में व्यास के साथ घावों) उच्च संकल्प टी 2 भारित छवियों शुरूआती चरण में ही Multifocal ट्यूमर दीक्षा का पता लगाने के लिए सक्षम करें. अनुदैर्ध्य एमआरआई व्यक्तिगत मस्तिष्क metastases समय पर जांच की अनुमति देता है. इसके अलावा, vivo noninvasive एमआरआई चिकित्सकीय प्रतिक्रिया, जैसे पूरे मस्तिष्क विकिरण के अनुदैर्ध्य अध्ययन में विशेष रूप से महत्वपूर्ण हो जाएगा.
Multifocal मस्तिष्क metastases के गठन एमडीए MB231Br मॉडल की विशेषताओं है. MDA-MB231/Br-GFP सेल लाइन के अलावा हम, वर्तमान अध्ययन में माता पिता का क्लोन MDA-MB231/Br दिखाया और MDA-MB231/Br-luc भी इसी तरह metastatic घावों दिखा रहे हैं. इसके विपरीत, MCF-7Br और 4T1 के रूप में कई अन्य मस्तिष्क की मांग लाइनों intracardiac इंजेक्शन 12 के बाद एक एकान्त मेटास्टेसिस विकसित करने के लिए दिखाया गया है. दोनोंमॉडल, नैदानिक समकक्षों mirroring, मस्तिष्क मेटास्टेसिस के उपयोगी पशु मॉडल हैं. हालांकि, इस तरह के फेफड़ों और हड्डी metastases के रूप में मस्तिष्क metastases, आंत का metastases के अलावा, अक्सर इस मॉडल में मनाया जाता है. विशेष रूप से मस्तिष्क metastases के विकास कि पशु मॉडल की स्थापना के उपचार की प्रतिक्रिया के मूल्यांकन के लिए, विशेष रूप से, महत्वपूर्ण होगा.
अंत में, हम एक मस्तिष्क मेटास्टेसिस माउस मॉडल और एक माउस मॉडल में Multifocal मेटास्टेसिस के intracranial विकास का आकलन करने के लिए उच्च संकल्प एमआरआई स्थापित करने के लिए इमेजिंग निर्देशित intracardiac इंजेक्शन की उपयोगिता का प्रदर्शन किया है.
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Disclosures
ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.
Acknowledgments
हम डीआरएस के लिए आभारी हैं. हमें एमडीए MB231Br कोशिकाओं को प्रदान करने के लिए डायने Palmieri और NCI की पेट्रीसिया Steeg. हम तकनीकी और collegial समर्थन के लिए डॉ. राल्फ मेसन, श्री जेसन Reneau और सुश्री रमोना लोपेज धन्यवाद. इस काम डीओडी आईडिया पुरस्कार W81XWH-08-1-0583 और W81XWH-12-1-0317 द्वारा भाग में समर्थित किया गया. एमआरआई प्रयोगों उन्नत इमेजिंग रिसर्च सेंटर, एक एनआईएच BTRP # P41-RR02584 सुविधा में प्रदर्शन किया गया, और अल्ट्रासाउंड निर्देशित intracardiac इंजेक्शन 1S10RR02564801 तहत Visualsonics Vevo 770 के साथ प्रदर्शन किया गया था.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | HyClone | SH30022.01 | |
| Trypsin | Mediatech | 25-051-C1 | |
| Automatic cell counter | BioRad | TC10 | |
| Isoflurane | Baxter International Inc. | 1001936060 | |
| VisualSonics Vevo 770 High-Resolution Imaging System | Visual Sonics Inc. | ||
| 9.4 T horizontal bore magnet with a Varian INOVA Unity system | Agilent | ||
| O.C.T Compound | Sakura Finetek USA | 4583 |
References
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