Summary
इस प्रोटोकॉल आत्मीय GFP संवाददाताओं और फ्लो के माध्यम से GFP अभिव्यक्ति को प्रोत्साहित करने के लिए ATFs क्षमता की मात्रा का ठहराव के साथ कृत्रिम प्रतिलेखन कारक (ATFs) का तेजी से निर्माण के लिए एक प्रयोगात्मक प्रक्रिया का वर्णन है.
Abstract
सिंथेटिक जीव विज्ञान के तर्क से डिजाइन और वांछित मात्रात्मक गुणों के साथ सिंथेटिक सर्किट का निर्माण, साथ ही देशी नियंत्रण सर्किट की संरचना से पूछताछ करने के लिए उपकरण प्रदान करना है. दोनों ही मामलों में, कोई बंद लक्ष्य प्रभाव के साथ, एक तेजी से और tunable फैशन में जीन की अभिव्यक्ति कार्यक्रम करने की क्षमता उपयोगी हो सकता है. हम मानव एस्ट्रोजन रिसेप्टर और VP16 के ligand बाध्यकारी डोमेन के बाद URA3 कैसेट की ACT1 प्रमोटर अपस्ट्रीम युक्त खमीर उपभेदों का निर्माण किया है. URA3 की उपस्थिति के खिलाफ एक डीएनए बाध्यकारी डोमेन और चयन युक्त एक रेखीय पीसीआर उत्पाद के साथ इस तनाव को बदलने के द्वारा, एक रचनात्मक रूप में व्यक्त कृत्रिम प्रतिलेखन कारक (एटीएफ) मुताबिक़ पुनर्संयोजन द्वारा उत्पन्न किया जा सकता है. इस फैशन में इंजीनियर ATFs जिससे बंद लक्ष्य सक्रियण और आमतौर पर इस्तेमाल किया conditi के साथ पाया nonphysiological विकास की स्थिति दोनों को नष्ट करने, inducer की उपस्थिति में एक अनूठा लक्ष्य जीन को सक्रिय कर सकते हैंonal जीन अभिव्यक्ति प्रणालियों. ब्याज की एक देशी या कृत्रिम प्रतिलेखन कारक के लिए विशेष रूप से जवाब है कि GFP संवाददाता plasmids के तेजी से निर्माण के लिए एक सरल तरीका भी प्रदान की जाती है.
Introduction
खमीर में आनुवंशिक स्विच का विकास शैक्षणिक और औद्योगिक दोनों अनुसंधान के क्षेत्र में बहुत रुचि है. आदर्श मामले में, आनुवंशिक स्विच प्रयोगकर्ता द्वारा वांछित केवल जब एक विशेष जीन (या जीन का समूह) को सक्रिय करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. नीचे की ओर एक सिंथेटिक प्रमोटर के रखा एक जीन अनुक्रम कोडन एक उत्प्रेरण अणु के अभाव में व्यक्त नहीं कर रहा है: inducer के अलावा पर जीन तेजी से व्यक्त किया जाना चाहिए. यह केवल हाल ही में इस तरह के एक स्विच inducer के अभाव में, तनाव एक विलोपन phenotype प्रदर्शित करता है, लेकिन inducer की उपस्थिति में, अभिव्यक्ति सभी कक्षों में inducer के स्तर के अनुपात में सक्रिय है जहां खमीर में इंजीनियर हो सकता है कि प्रदर्शन किया गया है 1,2. ऐतिहासिक, खमीर में सशर्त अभिव्यक्ति प्रणालियों मिले, फोटो, और लड़की प्रमोटरों (जिनकी गतिविधियों methionine, फॉस्फेट की बाह्य स्तर के प्रति संवेदनशील हैं, और सहित पोषक तत्व उत्तरदायी डीएनए दृश्यों, पर भारी भरोसागैलेक्टोज, क्रमशः). सशर्त अभिव्यक्ति प्राप्त किया जा सकता है, यह महत्वपूर्ण pleiotropic प्रभाव की कीमत पर आता है.
ऐसे मानव एस्ट्रोजन रिसेप्टर्स के रूप में हार्मोन रिसेप्टर्स यूकैर्योसाइटों 3,4 में प्रभावी स्विच साबित किया है. हार्मोन के अभाव में, एक हार्मोन रिसेप्टर के लिए जुड़े हुए एक प्रोटीन यह Hsp90 निगरानी जटिल के साथ सूचना का आदान प्रदान जहां कोशिका द्रव्य में तनहा किया जा सकता है. उचित ligand बंधन पर, रिसेप्टर यह Hsp90 निगरानी जटिल से जारी होने के कारण और एक परमाणु स्थानीयकरण संकेत खुलासा, एक गठनात्मक बदलाव आए. एक खास हार्मोन रिसेप्टर युक्त प्रोटीन का स्थानीयकरण गतिशीलता का पालन करने के लिए, हम Gal4dbd.ER.VP16 (GeV, Gal4p डीएनए बाध्यकारी डोमेन, मानव एस्ट्रोजन रिसेप्टर की ligand बाध्यकारी डोमेन युक्त सिंथेटिक प्रतिलेखन कारक की एक सी टर्मिनल संलयन बनाया , और VP16) GFP 2 के साथ. परमाणु स्थानीयकरण के अलावा निम्नलिखित 8 मिनट के भीतर मनाया गयाजो जंगली प्रकार खमीर पूरी तरह निष्क्रिय है, inducer, एसएस estradiol की मात्रा saturating. इस समय तक, कोशिकाओं के बहुमत (सीटू संकरण में प्रतिदीप्ति के माध्यम से assayed) GeV लक्ष्य जीन के लिए स्पष्ट रूप से दिखाई सक्रिय प्रतिलेखन साइटों के साथ ही पूरी तरह से परिपक्व mRNAs 2,5 है. GeV लक्ष्य जीन यह नाभिक को सरकाना डीएनए बाँध, और प्रतिलेखन सक्रिय करने के लिए <कैमेरिक उत्प्रेरक के लिए 2.5 मिनट लगते हैं कि प्रदर्शन, 2.5 मिनट 2,6 (प्रोटीन का उपयोग करके मापा) के भीतर अभिव्यक्ति> 2 गुना में वृद्धि हुई है.
कई पर स्विच अन्य, कोई भी गति प्राप्त कर ली है (कोलाई Escherichia से क्लासिक डॉक्सीसाइक्लिन आधारित स्विच 7,8 और Arabidopsis thaliana से एक इंडिगो आधारित स्विच 9 सहित) विभिन्न छोटे अणुओं या ड्रग्स का उपयोग कि खमीर में लागू किया गया है, विशिष्टता, या हार्मोन आधारित स्विच द्वारा प्रदर्शित विनियमन की तंगी. यह टी उल्लेख के लायक हैटोपी तेजी से स्विच बंद भी खमीर में विकसित किया गया है, और आमतौर पर अनुक्रम 2,10,11,12 को लक्षित एक प्रोटीज या ubiquitin ligase के लिए एक जीन fusing द्वारा काम करते हैं. तेजी से सेल से एक लक्ष्य प्रोटीन को दूर करने की क्षमता आवश्यक जीन का अध्ययन करने के साथ ही 10 नष्ट कर दिया जब आनुवंशिक दमन से ग्रस्त हैं कि जीन की सुविधा.
इस प्रोटोकॉल में वर्णित विधियों के निर्माण और पर स्विच खमीर में सिंथेटिक निस्र्पक के लिए कर रहे हैं. सबसे पहले, हम तेजी से ब्याज की एक डीएनए बाध्यकारी डोमेन से मिलकर genomically एकीकृत संलयन प्रोटीन उत्पन्न करने के लिए कैसे दिखा, ligand मानव एस्ट्रोजन रिसेप्टर के डोमेन बंधन, और VP16 (DBD-EV है). हमारे प्रोटोकॉल के बाद, संलयन प्रोटीन एक ACT1 प्रमोटर से व्यक्त किया है. हम तो एटीएफ के लिए एक आत्मीय संवाददाता प्लाज्मिड बनाने और फ्लो का उपयोग कर अपनी कार्यक्षमता का परीक्षण करने के लिए दिखा. हम इन रिपोर्टर प्लास्मिड नई ATFs (चित्रा 1) के साथ इस्तेमाल किया जा रहा कल्पना है, वे कर सकते हैं खई के रूप में अच्छी तरह से एक देशी transcriptional उत्प्रेरक के लिए संवाददाताओं के रूप में इस्तेमाल किया. अंत में, 96 अच्छी तरह प्लेटें में सेल के विकास पर एटीएफ सक्रियण के प्रभाव के परीक्षण के लिए और inducible जीनोमिक alleles इंजीनियरिंग के लिए जानकारी प्रदान की जाती है.
Protocol
चित्रा 2 प्रोटोकॉल वर्गों 1-3 की एक योजनाबद्ध प्रदान करता है.
1. ATFs का निर्माण
- पीसीआर ब्याज की डीएनए बाध्यकारी डोमेन amplifying के लिए प्राइमरों बनाएँ. ACT1 प्रमोटर और हार्मोन रिसेप्टर के लिए अनुरूपता (आंकड़े 3 और 4 में वर्णित है) तनाव yMN15 में सही पुनर्संयोजन की सुविधा के लिए पीसीआर के माध्यम से जोड़ा जाता है.
- पीसीआर एक उच्च निष्ठा पोलीमर्स का उपयोग ब्याज की DBD बढ़ाना.
- लिथियम एसीटेट विधि 13 का उपयोग खमीर में शुद्ध पीसीआर उत्पाद के> 1 ग्राम रूपांतरण.
- Microcentrifuge में 15 सेकंड के लिए शीर्ष गति से परिवर्तन, स्पिन कोशिकाओं के बाद और परिवर्तन मिश्रण को हटा दें.
- YPD पर बाँझ पानी और थाली की ~ 200 μl में Resuspend.
- अगले दिन, YPD से प्रतिकृति प्लेट 5 FOA प्लेटों पर 13 (कोल्ड स्प्रिंग हार्बर खमीर पुस्तिका में वर्णित के रूप में 5 FOA प्लेटें बना रहे हैं).
- 2-4 घ के लिए वृद्धि की अनुमति देंays, और restreak कम से कम 5-10 कालोनियों YPD पर. शामिल किए जाने को सत्यापित करने के लिए 1 टेबल और अनुक्रम में प्राइमरों का उपयोग कर एक कॉलोनी पीसीआर प्रदर्शन करना.
2. एटीएफ प्लाज्मिड रिपोर्टर का निर्माण
- (साहित्य से आने के लिए सबसे अधिक संभावना) एटीएफ की बाध्यकारी साइट निर्धारण करते हैं.
- (यदि आवश्यक हो तो, या Ultramers) आदेश oligos के रूप में बाध्यकारी क्षेत्र वांछित. तालिका 2 में दिखाया गया है चना XbaI के लिए सही overhangs के साथ ऊपर और नीचे किस्में के रूप में आदेश.
- Equimolar सांद्रता (100 माइक्रोन) को oligos पतला.
- टी -4 polynucleotide kinase और thermocycler में तो पानी रखना का उपयोग phosphorylate. प्रतिक्रिया की स्थिति तालिका 3 में हैं.
- डाइजेस्ट ~ 1-2 37 डिग्री सेल्सियस (4 तालिका में प्रतिक्रिया की स्थिति) पर 1 घंटे के लिए चना-HF और XbaI साथ pMN8 के ग्राम.
- जेल रीढ़ बैंड शुद्ध.
- 10 एनजी / μl को शुद्ध रीढ़ पतला.
- डबल असहाय, phosphoryl पतलाμl प्रति रीढ़ की दाढ़ एकाग्रता 5x के लिए बाध्यकारी साइट पैदा.
- टी -4 डीएनए ligase का प्रयोग, 30 मिनट (5 तालिका) के लिए कमरे के तापमान पर पचा रीढ़ की हड्डी में बाध्यकारी साइटों ligate.
- परिवर्तन के लिए, मानक के 50 μl, ऐसे XL1 ब्लू या DH5-अल्फा के रूप में रासायनिक सक्षम Escherichia कोलाई को आधा बंधाव प्रतिक्रिया जोड़ें.
- फिर गर्मी झटका एक 42 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में 45 सेकंड के लिए कोशिकाओं और 2 मिनट के लिए बर्फ पर जगह है.
- परिवर्तन प्रतिक्रिया करने के लिए समाज के माध्यम के 900 μl जोड़ें.
- एक रोलर ड्रम पर 1 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर आगे बढ़ें.
- लेग + एएमपी (100 माइक्रोग्राम / एमएल) प्रति प्लेट 100-200 μl कोशिकाओं बिखरा हुआ है और रातोंरात सेते हैं.
- ई. बड़े हो जाओ लेग + एएमपी में कोली तरल और फसल प्लास्मिड डीएनए. अनुक्रम प्राइमर 5'-GTACCTTATATTGAATTTTC -3 'का उपयोग कर बंधाव कालोनियों से नया संवाददाता प्लाज्मिड सत्यापित.
- एटीएफ युक्त खमीर Str नए संवाददाता प्लाज्मिड रूपांतरणलिथियम एसीटेट परिवर्तन का उपयोग कर धारा 1 से ऐन.
3. GFP संवाददाता का प्रयोग जीन अभिव्यक्ति पर एटीएफ प्रेरण के प्रभाव यों
नमूने की तैयारी:
- 25 मिमी β-estradiol शेयर (β-estradiol की इथेनॉल + 0.0681 जी की 10 मिलीलीटर) बनाते हैं. फ्रिज में रखें.
- एटीएफ + 5ml SC-URA में रात भर तनाव रिपोर्टर युक्त हो जाओ.
- प्राप्त नौ 250 मिलीलीटर बोतल मिलाने और प्रत्येक को 25 मिलीलीटर SC-URA जोड़ें.
- 0 एनएम, 0.1 एनएम, 1 एनएम, 10 एनएम, 100 एनएम, 1 माइक्रोन, या 10 माइक्रोन β-estradiol जोड़ें. यह सबसे अधिक आसानी से 25 मिमी β-estradiol के स्टॉक का 10 गुना धारावाहिक dilutions बनाकर किया जाता है. 10 माइक्रोन β-estradiol की एक अंतिम एकाग्रता के लिए SC-URA की 25 मिलीलीटर के लिए 25 मिमी β-estradiol के स्टॉक के 10 μl जोड़ें.
- बोतल (1:200 कमजोर पड़ने) को रात भर संस्कृतियों के 125 μl जोड़ें.
- 2 शेष बोतल के लिए, एक विधान GFP उत्पादन strai साथ टीका लगानाn और GFP कमी तनाव. इन प्रवाह cytometer औजार के लिए आवश्यक हैं.
- 12-18 घंटे के लिए 30 डिग्री सेल्सियस पर 200 rpm पर हिला.
नोट: इष्टतम ऊष्मायन समय GFP प्रेरण अब कोई परिवर्तन β-estradiol के अलावा के बाद जब पहचान के द्वारा निर्धारित किया जाता है. - प्रत्येक संस्कृति के 500 μl लो और अलग 1.7 एमएल microcentrifuge ट्यूब में नीचे स्पिन.
- महाप्राण SC-URA.
- 1 मिलीलीटर पीबीएस 0.1% बीच 20 और महाप्राण में एक बार धोएं.
- पीबीएस 0.1% बीच 20 और resuspend के 1 मिलीलीटर जोड़ें.
- फाल्कन ट्यूबों को पीबीएस 0.1% बीच 20 के 1 मिलीलीटर जोड़ें.
- 5 एमएल ट्यूब (अंतिम मात्रा = 2 मिलीलीटर) को resuspended कोशिकाओं जोड़ें (कई दिनों के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर भंडारित किया जा सकता है).
- वैकल्पिक: गोलमाल करने के लिए हल्के से sonicate कोशिकाओं किसी भी clumped कोशिकाओं.
प्रवाह cytometry विश्लेषण: अवलोकन: 10,000-100,000 कोशिकाओं के प्रतिदीप्ति आम तौर पर प्रति नमूना विश्लेषण किया है. डाटा FlowJo में या Matlab में कस्टम स्क्रिप्ट का उपयोग कर या तो कार्रवाई की जा सकतीआर GFP सकारात्मक और नकारात्मक नियंत्रण का उपयोग कर GFP चैनल का वोल्टेज जांच करने के लिए सुनिश्चित करें. एफसीएस फ़ाइलें निर्यात कर रहे हैं एक बार, इस तरह के समारोह fca_readfcs (साथ साथ चित्रा 6 में से एक के रूप में एक स्क्रिप्ट http://www.mathworks.com/matlabcentral/fileexchange/9608-fcs-data-reader ) को संसाधित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है डेटा. - फ्लो प्रदर्शन करना.
- खमीर कोशिकाओं की पहचान का उपयोग आगे तितर बितर (एफएससी) और पक्ष तितर बितर (एसएससी).
- ~ 3000 कोशिकाओं / सेक करने के प्रवाह की दर निर्धारित करें.
- GFP (FITC चैनल) उपाय.
- डेटा एकत्र कर रहे हैं, निर्यात. एफसीएस फाइलें
- MATLAB लोड करें.
- . एफसीएस फाइलें, fcs_readfcs.m, और चित्रा 6 से एक ही फ़ोल्डर में है कि इसी तरह एक स्क्रिप्ट हटो.
- डेटा और लिपियों युक्त फ़ोल्डर में उपस्थित कार्य निर्देशिका बदलें.
- (ध्यान दें चित्रा 6 से स्क्रिप्ट चलाएँ:कथा स्वयं) 7 चित्र में देखा है क्या निर्माण करने के लिए दर्ज किया गया है.
4. सेल के विकास पर एटीएफ प्रेरण के प्रभाव यों
- जमे हुए शेयरों से, दोनों बाहर लकीर (1) अलग YPD प्लेटों पर एक एटीएफ युक्त तनाव और (जैसे yMN15 के रूप में) (2) एक एटीएफ कमी तनाव.
- विकास के 2 दिनों के बाद, प्रत्येक तनाव के साथ YPD तरल के 5 मिलीलीटर युक्त अलग संस्कृति ट्यूब टीका लगाना और 30 डिग्री सेल्सियस पर रातोंरात बढ़ने
- 10 गुना 100% इथेनॉल में 10,000 गुना (0.025 माइक्रोन β-estradiol) के लिए एक 0.25 एमएम β-estradiol के शेयर समाधान के धारावाहिक dilutions प्रदर्शन.
- YPD तरल (1-250 कमजोर पड़ने) का 10 मिलीलीटर के लिए रातोंरात संस्कृतियों के 40 μl जोड़ें.
- प्रत्येक तनाव के लिए, एक 96 अच्छी तरह से थाली के 18 कुओं को पतला कोशिकाओं के 96 μl जोड़ें.
- कोशिकाओं को β-estradiol की 4 μl जोड़ें. एक आवश्यक बिंदु प्रत्येक अच्छी तरह से कुल इथेनॉल की एक ही राशि है बनाना है. (वैकल्पिक रूप से, एक मो β-estradiol की केंद्रित स्टॉक का इस्तेमाल किया और बाद में बात करने के लिए पतला किया जा सकता है फिर से वृद्धि पर इथेनॉल के प्रभाव) औसत दर्जे का नहीं है.
- तीन प्रतियों में प्रदर्शन करते हैं. प्रत्येक तनाव के लिए कुओं में से तीन इथेनॉल ही नियंत्रण होना चाहिए.
- गैस पारगम्य झिल्ली में 96 अच्छी तरह से थाली को कवर किया.
- प्लेट रीडर में वृद्धि (600 आयुध डिपो) की निगरानी.
- ऐसे अधिकतम ढलान खोजने के रूप में मानक तरीकों के किसी भी संख्या का उपयोग कर विकास दर यों.
नोट: हम आर प्रोग्रामिंग वातावरण में चलाता है जो खुला स्रोत सॉफ्टवेयर पैकेज grofit 14, के साथ अच्छी सफलता मिली है यह उल्लेखनीय है कि 96 अच्छी तरह से थाली assays से गणना की वृद्धि दर (25 मिलीलीटर संस्कृतियों) बोतल हिला की तुलना करते हुए. कर रहे हैं जरूरी नहीं कि (कारण शरीर क्रिया विज्ञान में और इंस्ट्रूमेंटेशन में दोनों मतभेद के लिए), हम (यह हमेशा मामला नहीं हो सकता है) के सापेक्ष विकास दर समान होते हैं जो देखा है वही.
- PMN10, (विपरीत अभिविन्यास में) KanMX के लिए जुड़े हुए pMN8 से एटीएफ उत्तरदायी प्रमोटर के साथ एक noncentromeric प्लाज्मिड प्राप्त करते हैं.
- प्रतिबंध की धारा 2 के रूप में वेक्टर रीढ़ की हड्डी और जेल निकालने पचाने.
- पानी रखना, phosphorylate, और धारा 2 में वर्णित के रूप में उपयुक्त साइटों बंधन युक्त कटी घमनी को बांधना oligos.
- अनुक्रम सत्यापित. यह प्लाज्मिड अब inducible एलील बनाने के लिए एक डीएनए टेम्पलेट के रूप में काम करेगा.
- ब्याज की इसी एटीएफ व्यक्त खमीर तनाव प्राप्त करते हैं.
- पीसीआर तालिका 6 से प्राइमरों का उपयोग KanMX प्रमोटर कैसेट (~ 2 KB) बढ़ाना.
- लिथियम एसीटेट विधि का उपयोग एटीएफ व्यक्त तनाव में पीसीआर उत्पाद रूपांतरण.
- YPD + G418 अगले दिन पर YPD और प्रतिकृति प्लेट पर प्लेट.
- वें के लिए आगे प्राइमर (5'-CTGCAGCGAGGAGCCGTAAT -3 ') और एक रिवर्स प्राइमर आंतरिक का उपयोग प्रमोटर के उपयुक्त प्रविष्टि की पुष्टिजिसका प्रवर्तक ई जीन बदल दिया गया है. रिवर्स प्राइमर आमतौर पर पहली ATG 15 के बहाव 200-300 बीपी के बीच बनाया गया है. अंतिम पीसीआर उत्पाद ~ 1.2 केबी है.
Representative Results
चित्रा 5 समय के साथ जेड 3 EV, जेड 4 ईवी, या GeV द्वारा GFP के शामिल होने से पता चलता है. डोमेन बाध्यकारी nonyeast डीएनए युक्त ATFs के जवाब में GFP उत्पादन में वृद्धि पर ध्यान दें. हमने हाल ही में इस खमीर जीनोम 1 में एकल जीन विशिष्टता प्राप्त करने के लिए इन कारकों का परिणाम है कि अनुमान लगाया. Z 3 EV और जेड 4 ईवी केवल नीचे की ओर उचित बाध्यकारी साइटों (5'-GCGTGGGCG -3 'और 5'युक्त एक सिंथेटिक प्रमोटर के रखा एक लक्ष्य जीन की अभिव्यक्ति को सक्रिय जबकि अकेले GeV प्रेरण, जीनों के सैकड़ों की सक्रियता / दमन करने के लिए सुराग GCGGCGGAGGAG -3 ', क्रमशः) 1. 7 चित्रा प्रणाली (कोई detectable GFP में कोई inducer परिणाम) की और सभी कोशिकाओं को एक सीमा के पार GFP प्रेरित करने के लिए z 3 EV की क्षमता inducer के जवाब में प्रेरित मिलता है कि तंग विनियमन दर्शाता β-estradiol सांद्रता 8 चित्र में दिखाया गया है.
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चित्रा 1. Β-estradiol एटीएफ को बांधता है कृत्रिम प्रतिलेखन कारक β-estradiol. के अभाव में Hsp90 के साथ बातचीत, Hsp90 एटीएफ नाभिक में प्रवेश और प्लाज्मिड संवाददाता से अभिव्यक्ति को सक्रिय करने की इजाजत दी, dissociates.
चित्रा 2. कृत्रिम प्रतिलेखन कारक और निर्माण / आत्मीय GFP संवाददाताओं परीक्षण होते हैं कि इंजीनियरिंग उपभेदों के लिए प्रोटोकॉल के योजनाबद्ध.
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चित्रा 3. Leu2 ठिकाना पर तनाव yMN15 में ACT1pr-URA3-EV अनुक्रम.
सफलतापूर्वक yMN15 में तब्दील जब एक नया संलयन प्रोटीन उत्पन्न करने के लिए अतिरिक्त अनुक्रम अनुरूपता साथ ब्याज की एक डीएनए बाध्यकारी डोमेन amplifying के लिए पीसीआर प्राइमरों की चित्रा 4. डिजाइन.
चित्रा 5. GFP प्रेरण 1 माइक्रोन β-estradiol के जवाब में तीन अलग एटीएफ प्रमोटर जोड़े द्वारा. </ P>
चित्रा 6. Cytometry डेटा प्रसंस्करण प्रवाह के लिए एक matlab स्क्रिप्ट. यह स्क्रिप्ट से लिया गया था http://openwetware.org/wiki/McClean:_Matlab_Code_for_Analyzing_FACS_Data .
0 μ एम β-estradiol और प्रेरण के 18 घंटे के बाद 1 माइक्रोन β-estradiol के जवाब में जेड 3 EV द्वारा GFP की चित्रा 7. प्रेरण. प्रतिदीप्ति भी विदेश मंत्रालय थाz 3 EV प्रणाली की तंग विनियमन वर्णन करने के लिए GFP कमी कोशिकाओं से आश्वस्त. यह आंकड़ा चित्रा 6 में कोड का उपयोग कर उत्पन्न किया गया था.
चित्रा 8. Inducer एकाग्रता और अभिव्यक्ति उत्पादन के बीच के रिश्ते ~ 1 के एक हिल गुणांक के साथ वर्गीकृत है. (ए) β-estradiol एकाग्रता के एक समारोह के रूप में GFP अभिव्यक्ति का वितरण. (बी) (ए) से वितरण का मतलब प्रतिदीप्ति. डेटा डी β-estradiol खुराक है जहां जी = मिनट (G अधिकतम जी मिनट) डी एन / (कश्मीर एन डी एन), जी मिनट और जी अधिकतम न्यूनतम हैं समारोह जी (डी) के लिए फिट थे और अधिकतम GFP मूल्यों, को छोड़करpectively, एन हिल गुणांक है, और कश्मीर साढ़े (जी अधिकतम + जी मिनट) है कि पैदावार β-estradiol खुराक है.
| Oligonucleotide अनुक्रम | नाम |
| 5'-TTGAAACCA AACTCGCCTCT -3 ' | DBD फॉरवर्ड जाँचें |
| 5'-tccagagac ttcagggtgct -3 ' | DBD चेक रिवर्स |
तालिका 1. एस्ट्रोजन रिसेप्टर के लिए ब्याज की DBD की सही संलयन की पुष्टि के लिए प्राइमर. आगे प्राइमर मुताबिक़ ACT1 प्रमोटर है और रिवर्स प्राइमर एस्ट्रोजन रिसेप्टर के मुताबिक़ है. ठेठ DBDs (~ 300 बीपी) के लिए, पीसीआर उत्पाद <1.5 केबी है.
| Oligonucleotide अनुक्रम | नाम |
| 5'-ggccgc ... DBD binging साइट ... T-3 ' | शीर्ष oligo |
| 5'-ctaga ... डीएनए बाध्यकारी साइट रिवर्स ... जीसी -3 ' | निचला oligo |
| 5'-जीसीसी gcGTGGGCG टी GCGTGGGCG जी जी CGTGGGCG टी GCGTGGGCG जी GCGTG GGCG टी GCGTGGGCG टी -3 ' | शीर्ष oligo + 6x Zif268 बाध्यकारी साइटें |
| 5'-ctagaCGCCCACGCACGCCCACGCC CGCCCACGCACGCCCACGCCCGCC CACGCACGCCCACgc -3 ' | निचला oligo + 6x Zif268 बाध्यकारी साइटें |
ब्याज की साइटों बंधन युक्त dsDNA बनाने के लिए प्राइमरों की तालिका 2. एस tructure. Z 3 EV उत्तरदायी प्रमोटर बनाने के लिए, oligonucleotides के शीर्ष oligo + 6x Zif268 बाध्यकारी साइटें और निचला oligo + 6x Zif268 बाध्यकारी इस्तेमाल किया गया.सही डीएनए overhangs बनाने के लिए दृश्यों लोअरकेस में हैं. Zif268 आम सहमति बाध्यकारी साइट, GCGTGGGCG, शीर्ष oligo में रेखांकित किया है.
| अभिकर्मक | राशि |
| टी -4 polynucleotide kinase बफर | 5 μl |
| टी -4 polynucleotide kinase (10,000 इकाइयों / एमएल @) | 1 μl |
| शीर्ष oligo (100 माइक्रोन) | 1.5 μl |
| निचला oligo (100 माइक्रोन) | 1.5 μl |
| पानी | 41 μl |
तालिका 3. Phosphorylate और ऊपर वर्णित प्रतिक्रिया के 50 μl का उपयोग कर एक thermocycler में पानी रखना प्राइमरों. दो thermocycler कदम उठाए हैं. चरण 1: 37 डिग्री सेल्सियस 30 मिनट (phosphorylate), और चरण 2: 95 डिग्री सेल्सियस 30 सेकंड (पानी रखना), 4 डिग्री सेल्सियस तक 1 डिग्री सेल्सियस नीचे हर 30 सेकंड कदम.
| अभिकर्मक | राशि |
| XbaI | 1 μl |
| चना-HF | 1 μl |
| प्लास्मिड डीएनए | 5 μl (1-2 ग्राम) |
| 10x कट स्मार्ट बफर | 5 μl |
| पानी | 38 μl |
तालिका 4. XbaI और चना के साथ प्लाज्मिड pMN8 के प्रतिबंध डाइजेस्ट.
| अभिकर्मक | राशि |
| टी -4 ligase Buffer | 2 μl |
| टी -4 ligase | 0.2 μl |
| 10 एनजी / μl @ बैकबोन | 1 μl |
| 5x दाढ़ एकाग्रता / μl @ बंधन दृश्यों | 1 μl |
| पानी | 15.8 μl |
सारणी 5. प्लास्मिड डीएनए में बाध्यकारी साइटों कटी घमनी को बांधना.
| भजन की पुस्तक | विवरण |
| ~ 40 बीपी अपस्ट्रीम के ATG + CGCACTTAACTTCGCATCTG -3 ' | KanMX प्रमोटर amplifying के लिए आगे प्राइमर |
| 5'-रिवर्स पूरक (ATG + ~ 37bp) + TATAGTTTTTTCTCCTTGACG -3 ' | प्राथमिक रिवर्सKanMX प्रमोटर amplifying के लिए मेर |
| 5'-caatttgtctgctcaagaaaataaa ttaaatacaaataaaCGCAC TTAACTTCGCATCTG -3 ' | GCN4 प्रमोटर स्वैप करने के लिए आगे प्राइमर. |
| 5'-tggatttaaagcaaataaacttgg ctgatattcggacatTATAGTT TTTTCTCCTTGACG -3 ' | GCN4 प्रमोटर स्वैप बनाने के लिए प्राइमर उल्टा. |
6 तालिका. पीसीआर titratible एलील बनाने के लिए KanMX प्रमोटर बढ़ाना.
Discussion
यहाँ वर्णित हार्मोन आधारित स्विच विवो में एक डीएनए अनुक्रम को लक्षित करने के लिए ब्याज की एक डीएनए बाध्यकारी डोमेन की क्षमता का परीक्षण करने के लिए मूल कोशिका जीव विज्ञान का अध्ययन करने से, असंख्य आवेदन किया है. प्रणाली inducer, तेजी से कार्रवाई की, और तंग विनियमन के लिए एक वर्गीकृत प्रतिक्रिया सहित कई वांछित सुविधाओं, है (यानी. कोई औसत दर्जे का leakiness, 7 चित्र देखें). हालांकि, सुधार और विस्तार के लिए कमरे में अभी भी वहाँ है.
सिंथेटिक जीव विज्ञान में हाल ही में काम बहुसंकेतन सिंथेटिक सिस्टम पर जोर दिया और अच्छी तरह से विशेषता, प्रोग्राम डीएनए भागों 16 के प्रदर्शनों की सूची का विस्तार किया है. विशिष्ट लक्ष्य जीन की स्वतंत्र, सशर्त अभिव्यक्ति कई inducers और अतिव्यापी विशिष्टता की कमी है कि डीएनए बाध्यकारी डोमेन दोनों की आवश्यकता है. इंजीनियर और स्वाभाविक रूप से होती रिसेप्टर्स की उपलब्धता नया कृत्रिम प्रतिलेखन कारक विकसित करने के साथ जो भागों का एक बड़ा सेट प्रदान करता है. विस्तार करनापरस्पर orthogonal स्विच के प्रदर्शनों की सूची बहुत 17,18 दृष्टिकोण का निर्देशन विकास द्वारा सहायता प्राप्त किया गया है. हमारे कृत्रिम प्रतिलेखन कारक के ligand बाध्यकारी विशिष्टता reprogram करने के लिए वर्तमान प्रयासों भविष्य में प्रस्तुत किया जाएगा.
इससे पहले, जीन विलोपन / overexpression की प्ररूपी परिणाम बड़े पैमाने पर खमीर 19,20 में अध्ययन किया गया है. हालांकि, यह अभिव्यक्ति के स्तर की एक सीमा से अधिक अलग phenotypes पर अभिव्यक्ति के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए सरल नहीं किया गया है. इस के साथ साथ प्रस्तुत प्रणाली के एक प्राथमिक सुविधा अपने वर्गीकृत प्रकृति (8 चित्रा) है. अक्सर ग्रहण करते हैं, जीन अभिव्यक्ति और ब्याज की phenotypes के बीच संबंध जरूरी monotonic नहीं हो सकता है. ऐसे z 3 EV और जेड 4 EV के रूप में कृत्रिम प्रतिलेखन कारक सीधा जीन अभिव्यक्ति में परिवर्तन करने के लिए प्ररूपी प्रतिक्रियाओं परख करने की क्रिया का कार्य करना होगा.
अंत में, प्रोटोकॉल पर चर्चाइस पांडुलिपि के एड इंजीनियरिंग और estradiol β का जवाब है कि कृत्रिम प्रतिलेखन कारक निस्र्पक के लिए हैं, लेकिन, एक महत्वपूर्ण विकल्प रासायनिक उत्तरदायी डोमेन (जैसे PhyB/Pif3, LOV, और BLUF के रूप में) प्रकाश उत्तरदायी डोमेन का इस्तेमाल होता है, जिनकी गतिविधियों संस्कृति मध्यम विकास 21-23 उपद्रव करने के लिए बिना प्रतिवर्ती हैं. प्रकाश आधारित प्रणालियों spatiotemporal जीन अभिव्यक्ति के नियंत्रण, प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत, आयन परिवहन, और पहले से ही 21-26 शक्तिशाली सिद्ध कर दिया है जो enzymatic गतिविधि, सुविधा.
अंत में, हम खमीर में inducible, कृत्रिम प्रतिलेखन कारक का तेजी से निर्माण के लिए तरीके प्रस्तुत किया है. इस प्रोटोकॉल उनके आत्मीय GFP पत्रकारों के साथ संयोजन के रूप में निर्माण, साथ ही प्रवाह cytometry का उपयोग संवाददाता डेटा का विश्लेषण करने और विकास पर एटीएफ सक्रियण के प्रभाव को परख करने की क्रिया के लिए तरीकों के लिए एक टेम्पलेट प्रदान करता है.
Disclosures
McIsaac, Noyes, और Botstein (दूसरों के साथ) एक पेटेंट प्रकटीकरण के रूप में इस प्रणाली का हिस्सा प्रस्तुत किया है.
Acknowledgments
RSM NSF ग्रेजुएट रिसर्च फैलोशिप से धन स्वीकार करता है. एमबीएन एक लुईस-Sigler फैलोशिप से धन और पीटर लुईस के संपन्न उपहार स्वीकार करता है. डीबी एनआईएच (GM046406) मात्रात्मक जीवविज्ञान (GM071508) के लिए जनरल मेडिकल साइंसेज सेंटर के राष्ट्रीय संस्थान से धन स्वीकार करता है. हम फ्लो प्रयोगों के साथ सहायता के लिए क्रिस्टीना Decoste को स्वीकार करते हैं.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Name of the Reagent | Company | Catalogue Number | Comments |
| Expand High Fidelity PCR System | Roche | 11 732 650 001 | |
| T4 DNA Ligase | NEB | M0202S | |
| Competent E. coli | Life Technologies | 18258-012 | |
| Estradiol | Tocris Biosciences | 2824 | |
| Ampicillin | Fisher Scientific | BP1760-5 | |
| T4 Polynucleotide Kinase | NEB | M0201 | |
| PBS | Life Technologies | 10010-23 | |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | 9005-64-5 | |
| clonNAT | Jena Bioscience | AB-102L | |
| XbaI | NEB | R0145S | |
| NotI-HF | NEB | R3189S | |
| CutSmart Buffer | NEB | B7204S | |
| Glucose | Fisher Scientific | D15-500 | |
| Bacto-Peptone | BD Biosciences | 211677 | |
| Yeast Extract | BD Biosciences | 210929 | |
| Agarose | BD Biosciences | 214010 | |
| 100% Ethanol | Decon Laboratories | 04-355-222 | |
| G418 | Life Technologies | 11811-031 | |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | QIAGEN | 27104 | |
| Lithium acetate dihydrate | Sigma-Aldrich | L-6883 | |
| Salmon sperm DNA | Sigma-Aldrich | 93283 | |
| PEG 3350 | Sigma-Aldrich | P-3640 | |
| Plasmids pMN8 and pMN10; yeast strain yMN15 | Noyes or Botstein labs | ||
| Luria Broth | Sigma-Aldrich | L3397 | |
| EQUIPMENT: | |||
| LSRII Flow Cyometer | BD Biosciences | Various Models | |
| MATLAB or FlowJo | MATLAB or FlowJo | Software for analyzing .FCS files from flow cytometry experiments | |
| R | Open Source | For analyzing growth-rate data from plate reader. | |
| Falcon Tubes | BD Biosciences | 352052 | |
| 1.7 ml Eppendorf Tubes | GeneMate | C3262-1 | |
| 250 ml Shake Flasks | Corning | 4446-250 | |
| 96-well, flat-bottom plates | Costar | 3635 | |
| Plate Reader (Synergy H1 Multi-Mode Plate Reader) | BioTek | H1MG | |
| Breathe-Easy Membranes | Sigma-Aldrich | Z380059-1PAK | |
| Thermocycler | various companies | Various models | |
| SC-Ura powder | MP Biomedicals | 114410622 | |
| 5-FOA | Zymo Research | F9001-1 |
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