Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Medicine

Cerebrospinalvæske microRNA ved brug af kvantitativ real time PCR

doi: 10.3791/51172 Published: January 22, 2014

Summary

Vi beskriver en protokol af real time PCR til at profilere microRNA i cerebrospinalvæsken (CSF). Med undtagelse af RNA ekstraktionsprotokoller kan fremgangsmåden udvides til RNA ekstraheret fra andre legemsvæsker, dyrkede celler eller vævsprøver.

Abstract

MicroRNA (miRNA) udgør en potent lag af genregulering ved at vejlede RISC at målrette sites placeret på mRNAs og dermed ved at modulere deres translationel undertrykkelse. Har vist ændringer i miRNA udtryk for at være involveret i udviklingen af ​​alle større komplekse sygdomme. Desuden viste de seneste resultater, at miRNA kan udskilles til det ekstracellulære miljø og ind i blodbanen og andre kropsvæsker, hvor de kan cirkulere med høj stabilitet. Funktionen af ​​sådanne cirkulerende miRNA er stort set undvigende, men systematiske højkapacitetmetoder såsom miRNA arrays, har ført til identifikation af miRNA underskrifter i flere patologiske tilstande, herunder neurodegenerative sygdomme og flere typer af kræft. I denne sammenhæng identifikation af miRNA udtryk profil i cerebrospinalvæsken, som rapporteret i vores seneste undersøgelse, gør miRNA attraktive kandidater til biomarkør analyse.

_content "> Der er flere værktøjer til rådighed for at profilere microRNA, såsom microarrays, kvantitativ real-time PCR (qPCR) og dyb sekventering. Her beskriver vi en følsom metode til at profilere microRNA i cerebrospinalvæske ved kvantitativ real-time PCR. Vi brugte Exiqon microRNA klar-til-brug PCR menneskelige paneler I og II V2.R, hvilket muliggør påvisning af 742 unikke menneskelige microRNA. Vi udførte arrays i tredobbelte kørsler og vi behandlet og analyseret data ved hjælp af Genex Professional 5-softwaren.

Ved hjælp af denne protokol, har vi med succes profileret microRNA i forskellige typer af cellelinier og primære celler, CSF, plasma og formalin-paraffinindlejrede væv.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

MicroRNA hører til familien af ​​små (21-23 nt i længden) noncoding RNA, som regulerer genekspression post-transkriptionelt. microRNA kan secerneres i det ekstracellulære rum, hvor de synes at være forholdsvis stabile. Mens fastsættelsen ændringer i miRNA udtryk kan være et vigtigt skridt i retning af identifikation af biomarkører, der udfører miRNA-profiler og håndtering af en stor mængde data, kan være skræmmende.

Her beskriver vi en protokol for at bestemme ændringer i miRNA-ekspression i cerebrospinalvæsken (gældende for andre kropsvæsker) af en følsom real time PCR. Vi beskriver også anvendelsen af ​​software til dataanalyse, herunder statistisk analyse og grafisk gengivelse af resultater. Hele proceduren er forholdsvis let og ligetil, og afhængigt af antallet af prøver, der skal profilerede, og antallet af real time PCR maskiner til rådighed, også relativt hurtige. Den eksperimentelle del nøjagtighed i håndteringen kræverRNA og pipettering 384 brønde, mens dataanalyse sektion hjælp Genex kræver nogle grundlæggende viden i informatik og statistik.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Følgende protokol beskriver den normale procedure for at isolere RNA fra FSR og profil microRNA anvender klar PCR-plader. Bemærk, at den organiske fase ekstraktion er valgfri, og at en bærer-RNA tilsættes til prøven under ekstraktion sikre maksimal genvinding af RNA. Følgelig er der ingen grund til at kvantificere RNA.

Generelt kan et gennemsnit på 6-8 plader køres på én dag, hvis cDNA syntetiseres dagen før (ca. 2 timer). Analyse af data er udført, når alle prøver er blevet profileret og indlæses i softwaren. Afhængig af antallet af prøver / grupper eller deres kombination til sammenligning kan dataanalyse kræve fra en til flere timer.

1.. RNA-ekstraktion

Den RNA-ekstraktion blev udført fra CSF-prøver, opbevaret frosset ved -80 ° C i alikvoter indtil analyse. Ved denne fremgangsmåde skal Mirvana Paris isolation kit blev anvendt efter producentens instruKTIONER for den samlede RNA isolation. Bemærk, at selv om berigelse for små RNA arter er muligt med dette kit, er dette trin ikke gjort, og RNA-ekstraktion procedure sluttede efter det totale RNA isolation skridt. Hertil kommer, at selv om Mirvana Paris isolationssæt (ligesom andre kommercielt tilgængelige RNA isolation sæt) ikke kræver organisk ekstraktion, en protokol for denne procedure kan findes nedenfor.
Protokollen for RNA-ekstraktion består af to trin:
1.1. Økologisk Extraction (ikke påkrævet, hvis du bruger Mirvana Paris RNA ekstraktion kit)
1.2.2. Total RNA-isolering

1.1. Økologisk udvinding

1.1.1. Forbered reagenser

  1. Tilføj 375 pi 2-mercaptoethanol til 2x Denaturerende løsning, og opbevar det ved 4 ° C.

1.1.2. Forbered CSF

  1. Optø hver portion af CSF på is før RNA-ekstraktion. Tilsæt 1 ug MS2 RNA luftfartsselskab til 0,5 ml optøet CSF og forsigtigtblandes. Bemærk, at hvis den organiske ekstraktion udelades, vil MS2 bærer sættes til prøven før RNA-isolering er beskrevet i 1.2.2.1 nedenfor.
  2. Bland 0,5 ml 2x Denaturering Solution ved stuetemperatur til FSR.
  3. Der tilsættes 1 ml syre-phenol: chloroform til CSF plus 2x Denaturering Løsning: Sørg for at trukket den nederste fase indeholdende syre-phenol: chloroform, ikke den vandige buffer, der ligger på toppen af ​​blandingen. Derudover bemærkes, at syre-phenol: chloroform indeholder fenol, som er en gift og et irritationsmoment, at bruge handsker og andre personlige værnemidler, når man arbejder med denne reagens.
  4. Vortex i 30-60 sek for at blande. For nemheds skyld de 2 ml prøve / denaturerende opløsning / syre-phenol: chloroform blanding er opdelt i to 1,5 ml Eppendorf-rør.
  5. Centrifuger i 5 minutter ved maksimal hastighed (10.000 x g) ved stuetemperatur.
  6. Fjern forsigtigt vandige (øverste) fase uden at forstyrre den nederste fase eller interfase og overføre det til enfrisk rør. Bemærk lydstyrken inddrevet.

1.2. RNA-isolering

Det anbefales at have en dedikeret bænk, sæt af pipetter og stativer til håndtering af RNA-prøver. Arbejdsområdet og værktøjer dekontamineres ved hjælp af RNase Zap spray og klude før hvert forsøg.

1.2.1. Forbered reagenser:

  1. Tilføj 21 ml 100% ethanol til miRNA Wash Solution 1 og 40 ml 100% ethanol til Wash Solution 2/3. Bemærk, at miRNA Wash Solution 1 indeholder guanidiumthiocyanat der er et potentielt farligt stof.

1.2.2. Total RNA-isolering

  1. Tilføj 1,25 volumen stuetemperatur 100% ethanol til den vandige fase fra den organiske udvinding og bland grundigt.
  2. Placer en filterpatron ind i en af ​​Collection Tubes.
  3. Pipettér højst 700 pi af lysatet / ethanol blandingen på filterpatron.
  4. Centrifugeres i 30 sekunder ved maksimalhastighed. Påfør blandingen over 700 ul i successive programmer til det samme filter. Kassér gennemstrømning efter hver centrifugering og gemme Collection Tube til vasketrinene.
  5. Påfør 700 ul miRNA Wash Solution 1 til filterpatronen og centrifugeres i 15 sekunder ved maksimal hastighed. Kassér gennemstrømningen fra Collection Tube og udskifte filterpatronen i samme Collection Tube.
  6. Påfør 500 ul Wash Solution 2/3 og centrifuger i 15 sekunder ved maksimal hastighed. Kassér gennemstrømningen fra Collection Tube og udskifte filterpatronen i samme Collection Tube. Påfør en anden 500 ul Wash Solution 2/3 og centrifuger i 15 sekunder ved maksimal hastighed. Kassér gennemstrømningen fra Collection Tube og udskifte filterpatronen i samme Collection Tube. Spin forsamlingen til 1 min ved maksimal hastighed for at fjerne resterende væske fra filteret.
  7. Overfør filterpatron ind i en frisk Collection Tube. Påfør 100 & mu; L forvarmet (95 ° C) nuclease-frit vand til centrum af filteret, og luk hætten. Centrifugeres i 30 sek ved maksimal hastighed at inddrive RNA.
  8. Eluatet opsamles indeholder RNA og opbevar det ved -80 ° C for senere ansøgninger.
  9. Kvantificere 1 ml af RNA ved hjælp af NanoDrop 2000c spektrofotometer. Bemærk, at RNA-kvantificering kan springes over, hvis der tilføjes en RNA luftfartsselskab til prøven under RNA ekstraktion. I dette tilfælde 8 pi RNA underkastes cDNA-syntese som beskrevet nedenfor.

2. miRNA Profil: qRT-PCR-protokollen

Protokollen for miRNA-profilering består af to trin:

  1. Første streng cDNA-syntese
  2. Real-time PCR-amplifikation

2.1. Første streng cDNA-syntese

2.1.1. Fortynd template-RNA

  1. Juster hver af skabelon RNA-prøver til en koncentration på 5 ng / ul bruge nukleasefrit vand. HvisRNA er ikke blevet kvantificeret (se trin 1.2.2.9), og derefter 8 pi RNA er brugt til cDNA-syntese

2.1.2. Forbered reagenser

  1. Forsigtigt tø 5x Reaction buffer og nukleasefrit vand, og straks placere på is.
  2. Vortexes. Resuspender RNA spike-in ved at tilsætte 40 ul nukleasefrit vand til røret og vortexes, overlade det på is i 15-20 min. Umiddelbart før brug fjernes enzymet mix fra fryseren, bland ved at svirpe rørene og placere på is. Spin ned alle reagenser.

2.1.3. Revers transcription reaktion setup

  1. Forbered den nødvendige mængde RT arbejder opløsning i et 1,5 ml Eppendorf-rør, eller tilsvarende (i andelene anført i tabel 1, med undtagelse af RNA-template), blandes ved hvirvelbehandling (1-2 sek ved maks. hastighed) kortvarigt dreje ned ( vi bruger en mini Eppendorf centrifuge med fast hastighed, 10 sek) og placere den på is. Bemærk, at UniSp6 RNA spike-I sættes til prøven før RT-reaktionen (se tabel 1).
  2. Dispensere RT arbejder løsning i nukleasefrit PCR-rør.
  3. Doser skabelon RNA i hvert rør.
    Bemærk: Husk at beregne 10% overskydende volumen / hvert reagens for pipettering og / eller robot døde volumen.
    Reagens Panel I Volume (ul) Panel I + II bind (ul)
    5x reaktionsbuffer 4.4 8.8
    Nuklease frit vand 9.9 19.8
    Enzymblanding 2.2 4.4
    UniSp6 RNA Spike-skabelon 1.1 2.2
    Template total RNA (5 ng / pl) 4.4 8.8 Totalvolumen 22 44

    Tabel 1. Reverse transcription reaktionen setup.

2.1.4. Bland og spin reagenser

  1. Bland reaktionen ved forsigtig (1-2 sek) vortex at sikre, at alle reagenser blandes grundigt. Efter blanding, spin ned (mini Eppendorf centrifuge med fast hastighed, 10 sek).

2.1.5. Inkuber og varme inaktivere

  1. Programmere en PCR-maskine som følger:
  2. Inkuber i 60 minutter ved 42 ° C
  3. Heat-inaktivere reverse transkriptase i 5 minutter ved 95 ° C
  4. Umiddelbart afkøles til 4 ° C
  5. Opbevares ved 4 ° C eller nedfryses
    Bemærk: protokollen kan afbrydes på dette stadium. Det ufortyndede cDNA kan opbevares ved -20 ° C i op til 5 uger (valgfri opbevares ved 4 ° C i op til 4 dage).

2.2.1. Forbered reagenser til Real-time PCR

  1. Placer cDNA (fra trin 2.1.5) på is.
  2. Tø nukleasefrit vand og PCR Master mix på is. Beskyt PCR Master Mix hætteglas fra lys ved at dække dem med aluminiumsfolie. Umiddelbart før brug blandes PCR Master vortexes 1-2 sek i en mini centrifuge og spin ned ved 1.500 xg i 1 min.

2.2.2. Kombiner SYBR Green mester mix, vand og cDNA og tilføje til PCR-plader

Anbefales følgende procedure for at undgå lave koncentrationer af cDNA fra at overholde rør overflade:

  1. Før du fjerner pladen segl, kortvarigt spin ned pladen (r) i en nedkølet centrifuge ved 1.500 xg i 1 min.
  2. I en 15 ml konisk rør, kombinere 2x PCR Master mix og vand. Panel I: 2.000 ul 2x mester mix og 1.980 pi vand Panel I + II: 4.000 ul 2x mester mix og 3.960 μ; L vand.
  3. Tilsæt 20 ul cDNA (panel I) eller 40 pi cDNA (panel I + II) og blandes.
  4. Bland forsigtigt ved vortex 1-2 sek og spin ned i en nedkølet centrifuge ved 1.500 xg i 1 min.
  5. Placer PCR Master Mix / cDNA mix i en multikanal pipette reservoir. Du kan have til at identificere et reservoir, der har længden af ​​multikanalpipette. Dette holder niveauet af volumen høj nok giver mulighed for lige volumen portioner hele multikanal. Dette er kritisk over de sidste par portioner.
  6. Doser 10 pi PCR Master mix / cDNA mix til hver brønd i 384-brønds plade under anvendelse af en 16-kanals pipette.
  7. Forsegle skiltet med optisk tætning.
  8. Spin plade kortvarigt i en nedkølet centrifuge (1.500 xg i 1 min), at blande de løsninger og fjerne luftbobler.

    Bemærk: forsøget kan sættes på pause på dette punkt. Opbevar reaktioner beskyttet mod lys ved 4 ° C i op til 24 timer.

2.2.3. Real-Time PCR

Udfør real-time PCR-amplifikation og smeltekurve analyse efter de parametre, der er beskrevet i tabel 2..

Procestrin Indstillinger, Roche LC480
Polymerase Aktivering / Denaturation 95 ° C, 10 min
Forstærkning 45 amplifikationscyklusser på
95 ° C, 10 sek
60 ° C, 1 min
Rampe-rate
1,6 ° C / sek
Optisk læsning
Melting kurveanalyse Ja

Tabel 2. Real-time PCR cyklus betingelser ved hjælp af Roche LightCycler 480.

2.3. Real-time PCR dataanalyse

Real time PCR dataanalyse sker med Exiqon Genex Professional 5,0, efter than anbefalede anvisninger. Genex trin-for-trin-vejledning kan downloades på http://www.exiqon.com/ls/Documents/Scientific/Exiqon-data-analysis-guide.pdf
Dataanalyse består af tre trin:

  1. Import af data
  2. Forbehandling af data
  3. Statistisk analyse

2.3.1. Import af data

  1. I Roche LightCycler 480 vælge den 2. afledte analysemetode og beregne CQ værdier. Data eksporteres som en tabel og gemmes som tekstfiler.
  2. For at importere data, åbent Genex og klik på Exiqon guiden import knap og klikke på "Start". Følg instruktionerne for at vælge format, instrument og plade layout fil (er). Bemærk, at pladelayout filer (Excel-filer), der downloades fra Exiqons hjemmeside ( http://www.exiqon.com/plate-layout-files ).
  3. Vigt Paneler I og II og klik på "Næste".
  4. Tabellen genereret efter fil import indeholder foruddefinerede kolonner. Prøver navne kan redigeres og kolonner klassificering kan tilføjes eller fjernes på dette trin. Klik på "Næste", når du er færdig.
  5. Gemme data og indlæse til data Editor.

2.3.2. Forbehandling af data

  1. Som anbefalet af Exiqon og Genex, når man sammenligner flere plader den første ting at gøre, er at kalibrere data mellem pladerne ved at vælge mellem plade kalibreringen fra forbehandlingsfasen menuen.
  2. Det anbefales at køre miRNA arrays i tredobbelte kørsler. Hvis en miRNA ikke er til stede i mindst to ud af tre replikaer det vil blive indstillet som nonexpressed.
  3. I det næste trin i forbehandling, angive en cut off. Definition af en cut off-værdi angiver, at data med en tærskel-cyklus (C t) højere end denne værdi kasseres. I de foreliggende eksperimenter ved hjælp af cerebrospinalvæske eksemplar blev afskåret sat til 39.. Therør, vil alle prøver med en C t højere end 39 i de tre replikaer kasseres. Hvis en miRNA har en C t> 39 for en sonde (en kopi ud af tre), vil denne læsning blive erstattet med gennemsnittet af C t for de to andre sonder, forudsat at de er begge under 39.
  4. Definer reference-gener. Genex Professional har mulighed for at udnytte geNorm og / eller NormFinder at identificere reference-gener. Vælg en liste over miRNA, der har lignende CQ-værdier på tværs af alle prøve og køre geNorm og / eller NormFinder. Ifølge denne analyse, i eksemplet forudsat her, miR-622 og miR-1266 havde de mest ensartede værdier på tværs af prøverne og blev valgt som reference-gener (figur 1).
  5. Dernæst data normaliseres ved hjælp af reference-generne og de ​​opnåede værdier svarer til ΔC t
  6. Hvis cDNA syntese reaktioner blev udført i tre eksemplarer, på dette tidspunkt de værdier skal beregnes.
  7. Godkend ark til reflytte tomme og næsten tomme kolonner. I forbehandlingsfasen vinduet vælge "Godkend ark" og end finde anvendelse på den fjerne tomme kolonner linje. I linjen nedenfor, valgte den ønskede procentdel af valide data og klik på Anvend. For eksempel skal du vælge 100%, hvis man ønsker at sammenligne kun miRNA fælles for alle prøver.
  8. Håndtag manglende data.
    Vælg "Manglende data" fra Forbehandling menuen og valgte en af ​​de muligheder for at håndtere manglende data. Dette trin er nødvendigt. Bemærk at Genex vil give dig fejl, hvis du forsøger at indlæse filer, der indeholder unhandled manglende data.
  9. Bestem relativ kvantificering mellem grupper af prøver (dvs.. Eksperiment versus kontrol). Relativ kvantificering blandt grupper beregnes ved hjælp af ΔΔ C t-metoden. I Genex Klik på fanen programmeringssproget og vælg relativ kvantificering. I vinduet Vælg følgegruppen og ramte anvendelse. Bemærk, at for grafiske repræsentationer og / eller for yderligere statistiske analyser udtrykession data skal konverteres til en logaritmisk skala. I forbehandlingsfasen du vælge log2.

2.3.3. Statistisk analyse

Genex software giver en bred vifte af statistiske analyser, herunder T-test og ANOVA.

  1. Læg den endelige mdf fil i Genex og åbne data manager. Det er afgørende at vælge de rigtige prøver eller grupper af prøver, for hvilke statistiske analyser er udført.
  2. Vælg "Statistik" og valgte ikon, der svarer til den ønskede test.
  3. Klik på "Kør" i kontrolpanelet vinduet. Gem resultaterne som excel eller MDF filer.

2.3.4. Expression profilering

MicroRNA og prøver kan klassificeres, klynger, og visualiseret på varme-kort og dendrograms, som følger

  1. Læg den endelige mdf fil i Genex og åbne data manager. Brug dette vindue til at vælge og oprette grupper af prøver eller miRNA. Klik på "Anvend", når du er færdig.
  2. <li> I øverste venstre hjørne skal du vælge klynge, og klik på ikonet heatmap
  3. I kontrolpanelet vinduet klikke på "Kør". Den heatmap kan gemmes i forskellige formater såsom tiff eller bmp, og det kan også kopieres og ændres efter behov.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Resultaterne fra denne undersøgelse er tidligere blevet offentliggjort 1.. Figur 1 viser resultaterne fra analysen af kandidat referencepunkter microRNA hjælp geNorm ansøgning. Følgelig to microRNA, miR-622 og miR-1266, blev identificeret som reference-gener og blev brugt til at normalisere miRNA værdier.

For CSF undersøgelsen havde vi tre grupper af prøver: HIV-(n = 10), hive (n = 4), og hiv + uden Encephalitis (HIV +, n = 5). De to grupper, HIVE og HIV +, blev sammenlignet med kontrolgruppen HIV-gruppe. Efter statistisk analyse (afsnit 2.3.3) blev fundet statistisk signifikant 1. Figur 2 repræsenterer en kasse plot af denne elleve microRNA ekspressionsniveauer af elleve microRNA, miR-1203,-1224-3P, -182 *,-19b-2 *, -204,-362-5p, -484, -720, -744 *, -934 og -937. Hver kolonne viser fordelingen af ​​data på tværs af prøverne inden for koncernen (grøn for bikuben og rød for HIV + uden ningphalitis). Whiskers angiver medianen, 1. (Q1) og 3. (Q3) kvartil, og den maksimale og minimale nonoutliers.

Figur 1
Figur 1. Grafisk bar viser resultater fra geNorm ansøgning inden Genex. Ti microRNA blev analyseret som mulige referencepunkter gener og resultater tyder miR-622 og miR-1266 (røde søjler) som den mest stabilt udtrykte miRNA. Klik her for at se større billede.

Figur 2
Figur 2. Box plot, der viser fordelingen af data feller hver af de elleve miRNA inden for de grupper af HIVE (grøn) og HIV + uden hjernebetændelse (HIV +, rød). De knurhår i hver kolonne angiver medianen, 1. (Q1, bunden af kassen) og 3. (Q3, top af boksen) kvartiler, maksimum og minimum værdier, der er nonoutliers (sorte linjer). Klik her for at se større billede.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

MicroRNA er små kodende RNA, som regulerer genekspression ved at hæmme oversættelse og / eller fremme mRNA nedbrydning 2. På grund af deres høje stabilitet i celle-fri betingelser, der er påvist microRNA i mange kropsvæsker. Desuden har tydelig ekspression profil microRNA blevet korreleret med trin og / eller progression i en række forskellige humane cancere 3-9.

Der er flere værktøjer til rådighed til at profilere microRNA, herunder klassiske chip arrays eller den nyeste dyb sekventering teknologi. , Valgte vi at anvende en meget følsom qPCR platform 10, 11, som har den yderligere fordel, at kræve minimal mængde af RNA'er. Den miRCURY LNA Universal RT microRNA PCR-protokol er optimeret til at bruge 20 ng samlet RNA pr 20 ul cDNA syntese reaktion, 40 ng for hele to-panel array. At have mulighed for at anvende små mængder af RNA er meget vigtigt, når det drejer sig valuabl e og svære at opnå kliniske prøver såsom CSF eller formalin-paraffinindlejrede væv 1. Vigtigere er det, at udnytte lave mængder RNA minimere koncentrationen af ​​mulige inhibitorer er til stede i prøven. Ud af range Ct-værdier for spike-in sandsynligvis vil indikere tilstedeværelsen af ​​nogle inhibitorer i prøven. Spike-in prober kan købes separat for at teste prøverne for tilstedeværelsen af ​​inhibitorer før miRNA-profilering. Til denne test, er enkelt real time PCR udføres ved hjælp af stigende koncentrationer af RNA (uanset ng eller ul).

I den nuværende protokol, rapporterer vi den organiske fase ekstraktion før RNA isolation. Det skal bemærkes, at mange nye RNA-ekstraktionsmetoder kits ikke kræver denne procedure. For eksempel har vi med succes profileret plasma miRNA hjælp miRCURY RNA isolation kit biofluids til RNA-ekstraktion direkte fra 200 pi plasma (data ikke vist) uden phenol / chloroform ekstraktion.

_content "> I almindelighed er det vigtigt at designe eksperimentet på forhånd med henblik på at bestemme den korrekte antal gentagelser er nødvendige for at opnå statistisk signifikante resultater. Antallet af gentagelser kan afhænge af antallet af prøver, der skal analyseres, og kan afhænge af den variationer inden for de prøver eller gruppe af prøver. For vores undersøgelse, som vi brugte et relativt lavt antal prøver, 20 i alt, besluttede vi at oprette cDNA syntese reaktionen i tre eksemplarer. Consulting med biostatistisk før opsætning af eksperimenterne kan være et klogt valg, og kan varmt anbefales.

Definition af C t afskåret værdi er vigtig og afhænger af den type af prøver for højt udtrykt miRNA det kan indstilles mellem 25-35, men for lavt udtrykt miRNA, såsom vores CSF prøver, kan indstilles højere. Et andet afgørende skridt, når det kommer til dataanalyse er valget af henvisningen gen (erne). For nogle solide data (såsom miRNA profilering i dyrkede celler) aglobal normalisering, som repræsenterer den gennemsnitlige C t alle prøver, kan anvendes. Men dette er ikke en mulighed for prøver som CSF som præsenterer variationer. Ligeledes kunne vi ikke bruge som reference-gener disse miRNA, der generelt anses uændret i kropsvæsker. I stedet valgte vi alle miRNA, der viste tilsvarende C t på tværs af alle prøver, herunder reproduktioner, og kørte geNorm analyse findes i Genex (figur 1). Resultaterne indikerede miR-1266 og miR-622 som den mindst variabelt udtrykte miRNA og de blev brugt som reference-gener. Sammenligning af ekspressionen af miRNA mellem grupper kan bestemmes ved hjælp af den relative kvantificering værktøj Genex, der følger den standard formel 2 - (Ct-Ctrel). Endelig kan resultaterne visualiseres som zonekort diagrammer, grafiske barer eller andre typer af plots, såsom box plot i figur 2.. Andre typer af visualisering til rådighed i Genex omfatter hierarkisk klyngedannelse,Selvorganiseret kort (SOM), og principal komponent analyse (PCA). Ud over miRNA kan Genex software anvendes til analyse af andre typer af matrixer, såsom lange kodende RNA'er (lncRNAs) profilering. Pladen layout kan importeres i Excel-format og data kan håndteres som beskrevet for miRNA-analyse. Faktisk har vi profilerede lncRNAs fra primære embryonale mus corticalneuroner hjælp af Mirvana miRNA isolation kit, som beskrevet i ovenstående trin, og vi analyserede data ved hjælp af Genex (upublicerede resultater).

Sammenfattende beskrev vi en protokol for at profilere microRNA i cerebrospinalvæsken. Med nogle modifikationer i tilknytning til RNA-ekstraktion, kan denne fremgangsmåde tilpasses til profil miRNA i andre kropsvæsker og / eller andre former for væv. Bemærk, at i den her beskrevne procedure, er et skridt på organisk ekstraktion udføres før RNA isolation. I almindelighed er det ikke nødvendigt ved anvendelse af kommercielt tilgængelige kits, såsom Mirvana Paris ext-fraktion kit. Hertil kommer, når ekstraktion af RNA fra kropsvæsker og en bærer-RNA tilsættes til prøverne ikke er nødvendigt at kvantificere RNA og 2-8 pi RNA underkastes cDNA-syntese. Fra vores erfaring og i betragtning af de høje omkostninger i forbindelse med denne type eksperimenter, anbefaler vi at teste nogle prøver først, og derefter rådføre sig med en statistiker for antallet af prøver / reproduktioner skal profileres for at opnå statistisk signifikante resultater.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ikke noget at afsløre.

Acknowledgments

Det beskrevne projekt blev støttet af Award Number R01MH079751 (PI: F. Peruzzi) fra National Institute of Mental Health. Indholdet er alene forfatternes ansvar og repræsenterer ikke nødvendigvis de officielle synspunkter fra National Institute of Mental Health, eller National Institute of Health.

Materials

Name Company Catalog Number Comments

Table 3. List of equipment.

Finnpipette Novus Multichannel Pipetter

Thermo Scientific

HH05279

Finntip Pipette Tips

Thermo Scientific

9400613

Thermal Cycler C1000

Biorad

0.2 ml Low Profile, Clear PCR tubes

Biorad

TLS0801

Flat Cap Strips

Biorad

TLS0803

LightCycler 480 Real-Time PCR System

Roche

LightCycler 480 Sealing Foil

Roche

04 729 757 001

Refrigerated Centrifuge 5804R

Eppendorf

Swing-bucket Rotor, 4-place

Eppendorf

A-4-44

Bench-Top Mini Centrifuge

Fisher

05-090-100

Bench-Top Vortex

Fisher

1.5 ml Microcentrifuge Tubes, Sterilized

Fisher

02-681-5

Matrix Reagent Reservoir, 25 ml

Thermo Scientific

8093

Thermomixer Confort

Eppendorf

Bench-Top Mini Centrifuge Sigma 1-15

Sigma

Bench-Top Vortex

Velp Scientifica

F202A0173

Table 4. List of reagents.

Universal c-DNA synthesis kit, 16-32 rxns

Exiqon

203300

SYBR Green master mix, Universal RT, 25 ml

Exiqon

203400

Ultrapure Distilled Water Dnase, Rnase free

Invitrogen

10977-015

MicroRNA Ready to use PCR Human Panels (I+II) V2.R

Exiqon

203608

mirVana miRNA isolation Kit, 40 isolations

Ambion

AM1556

MS2 RNA carrier

Roche Applied Science

10165948001

2-mercaptoethanol 98%

Sigma Aldrich

M3148-25ml

Ethanol 100%

Carlo Erba

64-17-5

Nuclease free water

Qiagen

1039480

RNAse Zap

Ambion

AM9780

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Pacifici, M., et al. Cerebrospinal fluid miRNA profile in HIV-encephalitis. J. Cell. Physiol. 10, (2012).
  2. Krol, J., Loedige, I., Filipowicz, W. The widespread regulation of microRNA biogenesis, function and decay. Nat. Rev. Genet.. 11, 597-610 (2010).
  3. Calin, G. A., Croce, C. M. MicroRNA signatures in human cancers. Nat. Rev. Cancer. 6, 857-866 (2006).
  4. Chen, X., et al. Characterization of microRNAs in serum: a novel class of biomarkers for diagnosis of cancer and other diseases. Cell Res. 18, 997-1006 (2008).
  5. De Smaele, E., Ferretti, E., Gulino, A. MicroRNAs as biomarkers for CNS cancer and other disorders. Brain Res. 1338, 100-111 (2010).
  6. Heneghan, H. M., Miller, N., Kerin, M. J. MiRNAs as biomarkers and therapeutic targets in cancer. Curr. Opin. Pharmacol. 10, 543-550 (2010).
  7. Kosaka, N., Iguchi, H., Ochiya, T. Circulating microRNA in body fluid: a new potential biomarker for cancer diagnosis and prognosis. Cancer Sci. 101, 2087-2092 (2010).
  8. Lu, J., et al. MicroRNA expression profiles classify human cancers. Nature. 435, 834-838 (2005).
  9. Shah, A. A., Leidinger, P., Blin, N., Meese, E. miRNA: small molecules as potential novel biomarkers in cancer. Curr. Med. Chem. 17, 4427-4432 (2010).
  10. Blondal, T., et al. Assessing sample and miRNA profile quality in serum and plasma or other biofluids. Methods. 59, 1-6 (2013).
  11. Jensen, S. G., et al. Evaluation of two commercial global miRNA expression profiling platforms for detection of less abundant miRNAs. BMC Genomics. 12, 435 (2011).
Cerebrospinalvæske microRNA ved brug af kvantitativ real time PCR
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Pacifici, M., Delbue, S., Kadri, F., Peruzzi, F. Cerebrospinal Fluid MicroRNA Profiling Using Quantitative Real Time PCR. J. Vis. Exp. (83), e51172, doi:10.3791/51172 (2014).More

Pacifici, M., Delbue, S., Kadri, F., Peruzzi, F. Cerebrospinal Fluid MicroRNA Profiling Using Quantitative Real Time PCR. J. Vis. Exp. (83), e51172, doi:10.3791/51172 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter