Summary

Cerebrospinalvæske microRNA ved brug af kvantitativ real time PCR

Published: January 22, 2014
doi:

Summary

Vi beskriver en protokol af real time PCR til at profilere microRNA i cerebrospinalvæsken (CSF). Med undtagelse af RNA ekstraktionsprotokoller kan fremgangsmåden udvides til RNA ekstraheret fra andre legemsvæsker, dyrkede celler eller vævsprøver.

Abstract

MicroRNA (miRNA) udgør en potent lag af genregulering ved at vejlede RISC at målrette sites placeret på mRNAs og dermed ved at modulere deres translationel undertrykkelse. Har vist ændringer i miRNA udtryk for at være involveret i udviklingen af ​​alle større komplekse sygdomme. Desuden viste de seneste resultater, at miRNA kan udskilles til det ekstracellulære miljø og ind i blodbanen og andre kropsvæsker, hvor de kan cirkulere med høj stabilitet. Funktionen af ​​sådanne cirkulerende miRNA er stort set undvigende, men systematiske højkapacitetmetoder såsom miRNA arrays, har ført til identifikation af miRNA underskrifter i flere patologiske tilstande, herunder neurodegenerative sygdomme og flere typer af kræft. I denne sammenhæng identifikation af miRNA udtryk profil i cerebrospinalvæsken, som rapporteret i vores seneste undersøgelse, gør miRNA attraktive kandidater til biomarkør analyse.

_content "> Der er flere værktøjer til rådighed for at profilere microRNA, såsom microarrays, kvantitativ real-time PCR (qPCR) og dyb sekventering. Her beskriver vi en følsom metode til at profilere microRNA i cerebrospinalvæske ved kvantitativ real-time PCR. Vi brugte Exiqon microRNA klar-til-brug PCR menneskelige paneler I og II V2.R, hvilket muliggør påvisning af 742 unikke menneskelige microRNA. Vi udførte arrays i tredobbelte kørsler og vi behandlet og analyseret data ved hjælp af Genex Professional 5-softwaren.

Ved hjælp af denne protokol, har vi med succes profileret microRNA i forskellige typer af cellelinier og primære celler, CSF, plasma og formalin-paraffinindlejrede væv.

Introduction

MicroRNA hører til familien af ​​små (21-23 nt i længden) noncoding RNA, som regulerer genekspression post-transkriptionelt. microRNA kan secerneres i det ekstracellulære rum, hvor de synes at være forholdsvis stabile. Mens fastsættelsen ændringer i miRNA udtryk kan være et vigtigt skridt i retning af identifikation af biomarkører, der udfører miRNA-profiler og håndtering af en stor mængde data, kan være skræmmende.

Her beskriver vi en protokol for at bestemme ændringer i miRNA-ekspression i cerebrospinalvæsken (gældende for andre kropsvæsker) af en følsom real time PCR. Vi beskriver også anvendelsen af ​​software til dataanalyse, herunder statistisk analyse og grafisk gengivelse af resultater. Hele proceduren er forholdsvis let og ligetil, og afhængigt af antallet af prøver, der skal profilerede, og antallet af real time PCR maskiner til rådighed, også relativt hurtige. Den eksperimentelle del nøjagtighed i håndteringen kræverRNA og pipettering 384 brønde, mens dataanalyse sektion hjælp Genex kræver nogle grundlæggende viden i informatik og statistik.

Protocol

Følgende protokol beskriver den normale procedure for at isolere RNA fra FSR og profil microRNA anvender klar PCR-plader. Bemærk, at den organiske fase ekstraktion er valgfri, og at en bærer-RNA tilsættes til prøven under ekstraktion sikre maksimal genvinding af RNA. Følgelig er der ingen grund til at kvantificere RNA. Generelt kan et gennemsnit på 6-8 plader køres på én dag, hvis cDNA syntetiseres dagen før (ca. 2 timer). Analyse af data er udført, når alle prøver er blevet pr…

Representative Results

Resultaterne fra denne undersøgelse er tidligere blevet offentliggjort 1.. Figur 1 viser resultaterne fra analysen af kandidat referencepunkter microRNA hjælp geNorm ansøgning. Følgelig to microRNA, miR-622 og miR-1266, blev identificeret som reference-gener og blev brugt til at normalisere miRNA værdier. For CSF undersøgelsen havde vi tre grupper af prøver: HIV-(n = 10), hive (n = 4), og hiv + uden Encephalitis (HIV +, n = 5). De…

Discussion

MicroRNA er små kodende RNA, som regulerer genekspression ved at hæmme oversættelse og / eller fremme mRNA nedbrydning 2. På grund af deres høje stabilitet i celle-fri betingelser, der er påvist microRNA i mange kropsvæsker. Desuden har tydelig ekspression profil microRNA blevet korreleret med trin og / eller progression i en række forskellige humane cancere 3-9.

Der er flere værktøjer til rådighed til at profilere microRNA, herunder klassiske chip arrays ell…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Det beskrevne projekt blev støttet af Award Number R01MH079751 (PI: F. Peruzzi) fra National Institute of Mental Health. Indholdet er alene forfatternes ansvar og repræsenterer ikke nødvendigvis de officielle synspunkter fra National Institute of Mental Health, eller National Institute of Health.

Materials

Table III. List of equipment

Equipment

Company

Catalog Number

Finnpipette Novus Multichannel Pipetter

Thermo Scientific

HH05279

Finntip Pipette Tips

Thermo Scientific

9400613

Thermal Cycler C1000

Biorad

0.2 ml Low Profile, Clear PCR tubes

Biorad

TLS0801

Flat Cap Strips

Biorad

TLS0803

LightCycler® 480 Real-Time PCR System

Roche

LightCycler® 480 Sealing Foil

Roche

04 729 757 001

Refrigerated Centrifuge 5804R

Eppendorf

Swing-bucket Rotor, 4-place

Eppendorf

A-4-44

Bench-Top Mini Centrifuge

Fisher

05-090-100

Bench-Top Vortex

Fisher

1.5 ml Microcentrifuge Tubes, Sterilized

Fisher

02-681-5

Matrix Reagent Reservoir, 25 ml

Thermo Scientific

8093

Thermomixer Confort

Eppendorf

Bench-To Mini Centrifuge Sigma 1-15

Sigma

Bench-Top Vortex

Velp Scientifica

F202A0173

Table IV. List of reagents

Reagents

Company

Catalog Number

Universal c-DNA synthesis kit, 16-32 rxns

Exiqon

203300

SYBR Green master mix, Universal RT, 25 ml

Exiqon

203400

Ultrapure Distilled Water Dnase, Rnase free

Invitrogen

10977-015

MicroRNA Ready to use PCR Human Panels (I+II) V2.R

Exiqon

203608

mirVana™ miRNA isolation Kit, 40 isolations

Ambion

AM1556

MS2 RNA carrier

Roche Applied Science

10165948001

2Betamercaptoethanol 98%

Sigma Aldrich

M3148-25ml

Ethanol 100%

Carlo Erba

64-17-5

Nuclease free water

Qiagen

1039480

RNAse Zap®

Ambion

AM9780

References

  1. Pacifici, M., et al. Cerebrospinal fluid miRNA profile in HIV-encephalitis. J. Cell. Physiol. 10, (2012).
  2. Krol, J., Loedige, I., Filipowicz, W. The widespread regulation of microRNA biogenesis, function and decay. Nat. Rev. Genet.. 11, 597-610 (2010).
  3. Calin, G. A., Croce, C. M. MicroRNA signatures in human cancers. Nat. Rev. Cancer. 6, 857-866 (2006).
  4. Chen, X., et al. Characterization of microRNAs in serum: a novel class of biomarkers for diagnosis of cancer and other diseases. Cell Res. 18, 997-1006 (2008).
  5. De Smaele, E., Ferretti, E., Gulino, A. MicroRNAs as biomarkers for CNS cancer and other disorders. Brain Res. 1338, 100-111 (2010).
  6. Heneghan, H. M., Miller, N., Kerin, M. J. MiRNAs as biomarkers and therapeutic targets in cancer. Curr. Opin. Pharmacol. 10, 543-550 (2010).
  7. Kosaka, N., Iguchi, H., Ochiya, T. Circulating microRNA in body fluid: a new potential biomarker for cancer diagnosis and prognosis. Cancer Sci. 101, 2087-2092 (2010).
  8. Lu, J., et al. MicroRNA expression profiles classify human cancers. Nature. 435, 834-838 (2005).
  9. Shah, A. A., Leidinger, P., Blin, N., Meese, E. miRNA: small molecules as potential novel biomarkers in cancer. Curr. Med. Chem. 17, 4427-4432 (2010).
  10. Blondal, T., et al. Assessing sample and miRNA profile quality in serum and plasma or other biofluids. Methods. 59, 1-6 (2013).
  11. Jensen, S. G., et al. Evaluation of two commercial global miRNA expression profiling platforms for detection of less abundant miRNAs. BMC Genomics. 12, 435 (2011).

Play Video

Cite This Article
Pacifici, M., Delbue, S., Kadri, F., Peruzzi, F. Cerebrospinal Fluid MicroRNA Profiling Using Quantitative Real Time PCR. J. Vis. Exp. (83), e51172, doi:10.3791/51172 (2014).

View Video