Cerebrospinalvæske microRNA ved brug af kvantitativ real time PCR

Summary

Vi beskriver en protokol af real time PCR til at profilere microRNA i cerebrospinalvæsken (CSF). Med undtagelse af RNA ekstraktionsprotokoller kan fremgangsmåden udvides til RNA ekstraheret fra andre legemsvæsker, dyrkede celler eller vævsprøver.

Abstract

MicroRNA (miRNA) udgør en potent lag af genregulering ved at vejlede RISC at målrette sites placeret på mRNAs og dermed ved at modulere deres translationel undertrykkelse. Har vist ændringer i miRNA udtryk for at være involveret i udviklingen af ​​alle større komplekse sygdomme. Desuden viste de seneste resultater, at miRNA kan udskilles til det ekstracellulære miljø og ind i blodbanen og andre kropsvæsker, hvor de kan cirkulere med høj stabilitet. Funktionen af ​​sådanne cirkulerende miRNA er stort set undvigende, men systematiske højkapacitetmetoder såsom miRNA arrays, har ført til identifikation af miRNA underskrifter i flere patologiske tilstande, herunder neurodegenerative sygdomme og flere typer af kræft. I denne sammenhæng identifikation af miRNA udtryk profil i cerebrospinalvæsken, som rapporteret i vores seneste undersøgelse, gør miRNA attraktive kandidater til biomarkør analyse.

_content "> Der er flere værktøjer til rådighed for at profilere microRNA, såsom microarrays, kvantitativ real-time PCR (qPCR) og dyb sekventering. Her beskriver vi en følsom metode til at profilere microRNA i cerebrospinalvæske ved kvantitativ real-time PCR. Vi brugte Exiqon microRNA klar-til-brug PCR menneskelige paneler I og II V2.R, hvilket muliggør påvisning af 742 unikke menneskelige microRNA. Vi udførte arrays i tredobbelte kørsler og vi behandlet og analyseret data ved hjælp af Genex Professional 5-softwaren.

Ved hjælp af denne protokol, har vi med succes profileret microRNA i forskellige typer af cellelinier og primære celler, CSF, plasma og formalin-paraffinindlejrede væv.

Introduction

MicroRNA hører til familien af ​​små (21-23 nt i længden) noncoding RNA, som regulerer genekspression post-transkriptionelt. microRNA kan secerneres i det ekstracellulære rum, hvor de synes at være forholdsvis stabile. Mens fastsættelsen ændringer i miRNA udtryk kan være et vigtigt skridt i retning af identifikation af biomarkører, der udfører miRNA-profiler og håndtering af en stor mængde data, kan være skræmmende.

Her beskriver vi en protokol for at bestemme ændringer i miRNA-ekspression i cerebrospinalvæsken (gældende for andre kropsvæsker) af en følsom real time PCR. Vi beskriver også anvendelsen af ​​software til dataanalyse, herunder statistisk analyse og grafisk gengivelse af resultater. Hele proceduren er forholdsvis let og ligetil, og afhængigt af antallet af prøver, der skal profilerede, og antallet af real time PCR maskiner til rådighed, også relativt hurtige. Den eksperimentelle del nøjagtighed i håndteringen kræverRNA og pipettering 384 brønde, mens dataanalyse sektion hjælp Genex kræver nogle grundlæggende viden i informatik og statistik.

Protocol

Følgende protokol beskriver den normale procedure for at isolere RNA fra FSR og profil microRNA anvender klar PCR-plader. Bemærk, at den organiske fase ekstraktion er valgfri, og at en bærer-RNA tilsættes til prøven under ekstraktion sikre maksimal genvinding af RNA. Følgelig er der ingen grund til at kvantificere RNA. Generelt kan et gennemsnit på 6-8 plader køres på én dag, hvis cDNA syntetiseres dagen før (ca. 2 timer). Analyse af data er udført, når alle prøver er blevet pr…

Representative Results

Resultaterne fra denne undersøgelse er tidligere blevet offentliggjort 1.. Figur 1 viser resultaterne fra analysen af kandidat referencepunkter microRNA hjælp geNorm ansøgning. Følgelig to microRNA, miR-622 og miR-1266, blev identificeret som reference-gener og blev brugt til at normalisere miRNA værdier. For CSF undersøgelsen havde vi tre grupper af prøver: HIV-(n = 10), hive (n = 4), og hiv + uden Encephalitis (HIV +, n = 5). De…

Discussion

MicroRNA er små kodende RNA, som regulerer genekspression ved at hæmme oversættelse og / eller fremme mRNA nedbrydning ^2. På grund af deres høje stabilitet i celle-fri betingelser, der er påvist microRNA i mange kropsvæsker. Desuden har tydelig ekspression profil microRNA blevet korreleret med trin og / eller progression i en række forskellige humane cancere ^3-9.

Der er flere værktøjer til rådighed til at profilere microRNA, herunder klassiske chip arrays ell…

Materials

Table III. List of equipment

Equipment	Company	Catalog Number
Finnpipette Novus Multichannel Pipetter	Thermo Scientific	HH05279
Finntip Pipette Tips	Thermo Scientific	9400613
Thermal Cycler C1000	Biorad
0.2 ml Low Profile, Clear PCR tubes	Biorad	TLS0801
Flat Cap Strips	Biorad	TLS0803
LightCycler® 480 Real-Time PCR System	Roche
LightCycler® 480 Sealing Foil	Roche	04 729 757 001
Refrigerated Centrifuge 5804R	Eppendorf
Swing-bucket Rotor, 4-place	Eppendorf	A-4-44
Bench-Top Mini Centrifuge	Fisher	05-090-100
Bench-Top Vortex	Fisher
1.5 ml Microcentrifuge Tubes, Sterilized	Fisher	02-681-5
Matrix Reagent Reservoir, 25 ml	Thermo Scientific	8093
Thermomixer Confort	Eppendorf
Bench-To Mini Centrifuge Sigma 1-15	Sigma
Bench-Top Vortex	Velp Scientifica	F202A0173

Table IV. List of reagents

Reagents	Company	Catalog Number
Universal c-DNA synthesis kit, 16-32 rxns	Exiqon	203300
SYBR Green master mix, Universal RT, 25 ml	Exiqon	203400
Ultrapure Distilled Water Dnase, Rnase free	Invitrogen	10977-015
MicroRNA Ready to use PCR Human Panels (I+II) V2.R	Exiqon	203608
mirVana™ miRNA isolation Kit, 40 isolations	Ambion	AM1556
MS2 RNA carrier	Roche Applied Science	10165948001
2Betamercaptoethanol 98%	Sigma Aldrich	M3148-25ml
Ethanol 100%	Carlo Erba	64-17-5
Nuclease free water	Qiagen	1039480
RNAse Zap®	Ambion	AM9780