Nous décrivons un protocole de PCR en temps réel pour le profil de microARN dans le liquide céphalo-rachidien (LCR). A l'exception des protocoles d'extraction d'ARN, la procédure peut être étendue à l'ARN extrait à partir d'autres fluides corporels, des cellules en culture, ou des échantillons de tissus.
Les microARN (miARN) constituent une couche puissante de la régulation des gènes en guidant RISC à cibler des sites situés sur des ARNm et, par conséquent, en modulant leur répression de la traduction. Changements dans l'expression des miARN ont été révélés être impliqués dans le développement de toutes les grandes maladies complexes. En outre, des études récentes ont montré que les miARN peuvent être sécrétées dans l'environnement extracellulaire et dans la circulation sanguine et d'autres fluides corporels où ils peuvent circuler avec une grande stabilité. La fonction de ces miARN circulation reste largement insaisissable, mais des approches à haut débit systématiques, telles que miRNA tableaux de profilage, ont conduit à l'identification de signatures miRNA dans plusieurs conditions pathologiques, y compris les maladies neurodégénératives et plusieurs types de cancers. Dans ce cadre, l'identification de miARN profil d'expression dans le liquide céphalo-rachidien, comme indiqué dans notre étude récente, rend miARN candidats intéressants pour l'analyse de marqueurs biologiques.
_content "> Il existe plusieurs outils disponibles pour le profilage de microARN, comme les puces, quantitative PCR en temps réel (qPCR), et le séquençage profond. Ici, nous décrivons une méthode sensible au profil microARN dans liquide céphalo-rachidien par PCR quantitative en temps réel. Nous utilisé les panneaux droits Exiqon microARN prêts à l'emploi PCR I et II V2.R, qui permet la détection de 742 microARN humains uniques. Nous avons effectué les tableaux en triple courses et nous avons traité et analysé les données en utilisant le logiciel GenEx Professional 5.En utilisant ce protocole, nous avons profilé succès microARN dans divers types de lignées cellulaires et des cellules primaires, CSF, le plasma et les tissus inclus en paraffine fixés au formol.
Les microARN appartiennent à la famille de la petite (21-23 nt de long) non codantes des ARN qui régulent l'expression des gènes post-transcriptionnel. microARN peuvent être sécrétées dans l'espace extracellulaire où ils semblent être relativement stables. Alors que la détermination des changements dans l'expression des miARN peut être une étape importante vers l'identification de biomarqueurs, effectuer profils miRNA et la manipulation d'une grande quantité de données peut être intimidant.
Ici, nous décrivons un protocole pour déterminer les changements dans l'expression des miARN dans le liquide céphalo-rachidien (applicable à d'autres fluides corporels) par un temps réel sensible PCR. Nous décrivons également l'utilisation de logiciels d'analyse de données, y compris l'analyse statistique et la représentation graphique des résultats. Toute la procédure est relativement simple et facile et, en fonction du nombre d'échantillons à profilés et le nombre de machines de PCR en temps réel disponibles, également relativement rapides. La partie expérimentale nécessite précision dans la manipulationARN et pipetage dans des plaques à 384 puits, tandis que la section d'analyse de données à l'aide GenEx nécessite quelques connaissances de base en informatique et en statistiques.
Les microARN sont de petits ARN non codantes qui régulent l'expression des gènes par l'inhibition de la traduction et / ou de promotion de la dégradation de l'ARNm 2. En raison de leur grande stabilité dans des conditions exemptes de cellules, les microARN ont été détectés dans de nombreux fluides corporels. En outre, le profil d'expression de microARN distinct a été corrélée avec le stade et / ou de la progression dans une variété de cancers chez l'homme 9.3.
…The authors have nothing to disclose.
Le projet décrit a été soutenue par Prix Nombre R01MH079751 (PI: F. Peruzzi) de l'Institut national de la santé mentale. Le contenu est exclusivement la responsabilité de leurs auteurs et ne représentent pas nécessairement les vues officielles de l'Institut national de santé mentale ou l'Institut national de la santé.
Table III. List of equipment
Equipment |
Company |
Catalog Number |
Finnpipette Novus Multichannel Pipetter |
Thermo Scientific |
HH05279 |
Finntip Pipette Tips |
Thermo Scientific |
9400613 |
Thermal Cycler C1000 |
Biorad |
|
0.2 ml Low Profile, Clear PCR tubes |
Biorad |
TLS0801 |
Flat Cap Strips |
Biorad |
TLS0803 |
LightCycler® 480 Real-Time PCR System |
Roche |
|
LightCycler® 480 Sealing Foil |
Roche |
04 729 757 001 |
Refrigerated Centrifuge 5804R |
Eppendorf |
|
Swing-bucket Rotor, 4-place |
Eppendorf |
A-4-44 |
Bench-Top Mini Centrifuge |
Fisher |
05-090-100 |
Bench-Top Vortex |
Fisher |
|
1.5 ml Microcentrifuge Tubes, Sterilized |
Fisher |
02-681-5 |
Matrix Reagent Reservoir, 25 ml |
Thermo Scientific |
8093 |
Thermomixer Confort |
Eppendorf |
|
Bench-To Mini Centrifuge Sigma 1-15 |
Sigma |
|
Bench-Top Vortex |
Velp Scientifica |
F202A0173 |
Table IV. List of reagents
Reagents |
Company |
Catalog Number |
Universal c-DNA synthesis kit, 16-32 rxns |
Exiqon |
203300 |
SYBR Green master mix, Universal RT, 25 ml |
Exiqon |
203400 |
Ultrapure Distilled Water Dnase, Rnase free |
Invitrogen |
10977-015 |
MicroRNA Ready to use PCR Human Panels (I+II) V2.R |
Exiqon |
203608 |
mirVana™ miRNA isolation Kit, 40 isolations |
Ambion |
AM1556 |
MS2 RNA carrier |
Roche Applied Science |
10165948001 |
2Betamercaptoethanol 98% |
Sigma Aldrich |
M3148-25ml |
Ethanol 100% |
Carlo Erba |
64-17-5 |
Nuclease free water |
Qiagen |
1039480 |
RNAse Zap® |
Ambion |
AM9780 |