נוזל עמוד שדרת MicroRNA פרופיל שימוש כמותי בזמן אמת PCR
Summary
אנו מתארים פרוטוקול של PCR בזמן אמת לפרופיל מיקרו RNA בנוזל המוח והשדרה (CSF). למעט פרוטוקולי מיצוי RNA, ההליך יכול להתארך עד RNA המופק מנוזלים אחרים בגוף, תאים בתרבית, או דגימות רקמה.
Abstract
מיקרו RNA (miRNAs) מהווה שכבה חזקה של ויסות הגנים על ידי המנחה RISC למקד לאתרים הממוקמים על mRNAs וכתוצאה מכך, על ידי ויסות דיכוי translational שלהם. שינויים בביטוי מירנה הוכחו להיות מעורבים בפיתוח של כל המחלות מורכבות הגדולות. יתר על כן, הממצאים אחרונים הראו כי יכול להיות מופרש miRNAs לסביבה תאית ולהיכנס למחזור הדם ונוזלי גוף אחרים שבו הם יכולים להסתובב עם יציבות גבוהה. הפונקציה של miRNAs במחזור כזה נשארה במידה רבה חמקמקה, אבל גישות שיטתיות תפוקה גבוהה, כגון מערכי פרופיל מירנה, יש להוביל לזיהוי של חתימות מירנה בכמה מצבים פתולוגיים, כוללים הפרעות ניווניות ומספר סוגים של סרטן. בהקשר זה, את זיהוי של פרופיל ביטוי מירנה בנוזל השדרה, כפי שדווח במחקר שנערך לאחרונה שלנו, הופך את המועמדים אטרקטיביים miRNAs לניתוח סמן ביולוגי.
_content "> ישנם מספר כלים זמינים לאפיון מיקרו RNA, כגון microarrays, כמותיים בזמן אמת PCR (qPCR), ורצף עמוק. כאן אנו מתארים שיטה רגישה לפרופיל מיקרו RNA בנוזלי המוח והשדרה על ידי בזמן אמת PCR כמוני. השתמש בפנלי האדם PCR Exiqon microRNA מוכנים לשימוש I ו-II V2.R, המאפשר זיהוי של מיקרו RNA האנושי 742 הייחודי. ביצענו מערכים בריצות בשלושה עותקים ועבדנו וניתחנו נתונים באמצעות תוכנת Genex המקצועית 5.באמצעות פרוטוקול זה, יש לנו צדודית בהצלחה מיקרו RNA בסוגים שונים של שורות תאים ותאים ראשוניים, CSF, פלזמה, וברקמות מוטבעות פרפין קבוע פורמלין.
Introduction
מיקרו RNA שייך למשפחתו של קטן (21-23 NT באורך) noncoding RNAs המווסתים את ביטוי הגנים שלאחר תעתיק. יכול להיות מופרש מיקרו RNA במרחב תאי שבו הם נראים יציבים יחסית. תוך קביעת שינויים בביטוי מירנה יכולה להיות צעד חשוב לקראת זיהוי של סמנים ביולוגיים, ביצוע פרופילי מירנה וטיפול בכמות גדולה של נתונים עלולים להיות מפחיד.
כאן אנו מתארים פרוטוקול כדי לקבוע שינויים בביטוי מירנה בנוזל המוח והשדרה (החלים על נוזלי גוף אחרים) על ידי בזמן אמת רגיש ה-PCR. אנו גם מתארים את השימוש בתוכנות לניתוח נתונים, כוללים ניתוח סטטיסטי וייצוג גרפי של תוצאות. התהליך כולו הוא קל ופשוט יחסית, ותלוי במספר דגימות להיות צדודית ומספר מכונות PCR בזמן אמת זמין, גם מהיר יחסית. החלק הניסיוני דורש דיוק בטיפולרנ"א וpipetting לתוך צלחות 384 גם, ואילו סעיף ניתוח נתונים באמצעות Genex דורש קצת ידע בסיסי באינפורמטיקה ונתונים סטטיסטיים.
Protocol
Representative Results
Discussion
מיקרו RNA הוא RNAs noncoding הקטן המווסתים את ביטוי הגנים על ידי עיכוב תרגום ו / או קידום mRNA השפלה 2. בשל היציבות הגבוהה שלהם בתנאים ללא תא, מיקרו RNA שכבר זוהה בנוזלי גוף רבים. יתר על כן, פרופיל ביטוי מובהק של מיקרו RNA כבר בקורלציה עם שלב ו / או התקדמות בסוגים שונים של הסרטן א?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
הפרויקט המתואר נתמכה על ידי מספר פרס R01MH079751 (PI: פ Peruzzi) מהמכון הלאומי לבריאות נפש. התוכן הוא באחריות בלעדית של הכותבים ולא בהכרח מייצג את הדעות הרשמיות של המכון הלאומי לבריאות נפש או המכון הלאומי לבריאות.
Materials
Table III. List of equipment
|
Equipment |
Company |
Catalog Number |
|
Finnpipette Novus Multichannel Pipetter |
Thermo Scientific |
HH05279 |
|
Finntip Pipette Tips |
Thermo Scientific |
9400613 |
|
Thermal Cycler C1000 |
Biorad |
|
|
0.2 ml Low Profile, Clear PCR tubes |
Biorad |
TLS0801 |
|
Flat Cap Strips |
Biorad |
TLS0803 |
|
LightCycler® 480 Real-Time PCR System |
Roche |
|
|
LightCycler® 480 Sealing Foil |
Roche |
04 729 757 001 |
|
Refrigerated Centrifuge 5804R |
Eppendorf |
|
|
Swing-bucket Rotor, 4-place |
Eppendorf |
A-4-44 |
|
Bench-Top Mini Centrifuge |
Fisher |
05-090-100 |
|
Bench-Top Vortex |
Fisher |
|
|
1.5 ml Microcentrifuge Tubes, Sterilized |
Fisher |
02-681-5 |
|
Matrix Reagent Reservoir, 25 ml |
Thermo Scientific |
8093 |
|
Thermomixer Confort |
Eppendorf |
|
|
Bench-To Mini Centrifuge Sigma 1-15 |
Sigma |
|
|
Bench-Top Vortex |
Velp Scientifica |
F202A0173 |
Table IV. List of reagents
|
Reagents |
Company |
Catalog Number |
|
Universal c-DNA synthesis kit, 16-32 rxns |
Exiqon |
203300 |
|
SYBR Green master mix, Universal RT, 25 ml |
Exiqon |
203400 |
|
Ultrapure Distilled Water Dnase, Rnase free |
Invitrogen |
10977-015 |
|
MicroRNA Ready to use PCR Human Panels (I+II) V2.R |
Exiqon |
203608 |
|
mirVana™ miRNA isolation Kit, 40 isolations |
Ambion |
AM1556 |
|
MS2 RNA carrier |
Roche Applied Science |
10165948001 |
|
2Betamercaptoethanol 98% |
Sigma Aldrich |
M3148-25ml |
|
Ethanol 100% |
Carlo Erba |
64-17-5 |
|
Nuclease free water |
Qiagen |
1039480 |
|
RNAse Zap® |
Ambion |
AM9780 |
References
- Pacifici, M., et al. Cerebrospinal fluid miRNA profile in HIV-encephalitis. J. Cell. Physiol. 10, (2012).
- Krol, J., Loedige, I., Filipowicz, W. The widespread regulation of microRNA biogenesis, function and decay. Nat. Rev. Genet.. 11, 597-610 (2010).
- Calin, G. A., Croce, C. M. MicroRNA signatures in human cancers. Nat. Rev. Cancer. 6, 857-866 (2006).
- Chen, X., et al. Characterization of microRNAs in serum: a novel class of biomarkers for diagnosis of cancer and other diseases. Cell Res. 18, 997-1006 (2008).
- De Smaele, E., Ferretti, E., Gulino, A. MicroRNAs as biomarkers for CNS cancer and other disorders. Brain Res. 1338, 100-111 (2010).
- Heneghan, H. M., Miller, N., Kerin, M. J. MiRNAs as biomarkers and therapeutic targets in cancer. Curr. Opin. Pharmacol. 10, 543-550 (2010).
- Kosaka, N., Iguchi, H., Ochiya, T. Circulating microRNA in body fluid: a new potential biomarker for cancer diagnosis and prognosis. Cancer Sci. 101, 2087-2092 (2010).
- Lu, J., et al. MicroRNA expression profiles classify human cancers. Nature. 435, 834-838 (2005).
- Shah, A. A., Leidinger, P., Blin, N., Meese, E. miRNA: small molecules as potential novel biomarkers in cancer. Curr. Med. Chem. 17, 4427-4432 (2010).
- Blondal, T., et al. Assessing sample and miRNA profile quality in serum and plasma or other biofluids. Methods. 59, 1-6 (2013).
- Jensen, S. G., et al. Evaluation of two commercial global miRNA expression profiling platforms for detection of less abundant miRNAs. BMC Genomics. 12, 435 (2011).
