Líquido cefalorraquidiano MicroRNA perfil usando Quantitative PCR em Tempo Real

Summary

Nós descrevemos um protocolo de PCR em tempo real para o perfil de microRNAs no líquido cefalorraquidiano (LCR). Com a excepção dos protocolos de extracção de ARN, o procedimento pode ser estendido para o RNA extraído a partir de outros fluidos do corpo, as células cultivadas, ou amostras de tecido.

Abstract

MicroRNAs (miRNAs) constituem uma camada poderosa de regulação gênica, orientando RISC para atingir sítios localizados em mRNAs e, conseqüentemente, modulando sua repressão translacional. Alterações na expressão de miARN têm mostrado estar envolvidas no desenvolvimento de todas as principais doenças complexas. Além disso, resultados recentes demonstraram que os miRNAs pode ser secretada para o meio extracelular e entram na corrente sanguínea e outros fluidos corporais onde pode circular com elevada estabilidade. A função de tais miRNAs circulantes permanece difícil, mas as abordagens de alto rendimento sistemáticos, tais como matrizes de perfil miRNA, levaram à identificação de assinaturas miRNA em várias condições patológicas, incluindo doenças neurodegenerativas, e vários tipos de cancros. Neste contexto, a identificação do perfil de expressão de miRNA no líquido cefalorraquidiano, como relatado em nosso estudo recente, faz miRNAs candidatos atraentes para análise de biomarcadores.

_content "> Existem várias ferramentas disponíveis para perfilar microRNAs, tais como microarrays, quantitativa PCR em tempo real (qPCR) e seqüenciamento de profundidade. Aqui, descrevemos um método sensível para o perfil de microRNAs em fluidos cerebrospinal por quantitativa PCR em tempo real. Nós utilizados os painéis humanos PCR prontos para uso Exiqon microRNA I e II V2.R, que permite a detecção de 742 microRNAs humanos únicos. Realizamos as matrizes em triplicado corridas e nós processados ​​e analisados ​​dados usando o software GenEx Professional 5.

Usando este protocolo, temos perfilado com sucesso microRNAs em vários tipos de linhas celulares e pilhas, CSF, plasma e tecidos embebidos em parafina fixadas em formalina.

Introduction

MicroRNAs pertencem à família de pequenos (21-23 nt de comprimento) não codificante ARN que regulam a expressão do gene de pós-transcricionalmente. microRNAs pode ser secretada no espaço extracelular, onde eles parecem ser relativamente estável. Ao determinar mudanças na expressão de miRNA pode ser um passo importante para identificação de biomarcadores, realizando perfis de miRNA e lidar com uma grande quantidade de dados pode ser intimidante.

Aqui, nós descrevemos um protocolo para determinar mudanças na expressão de miRNA no líquido cefalorraquidiano (aplicável a outros fluidos corporais) por um tempo real sensível PCR. Nós também descrevem o uso de software para análise de dados, incluindo a análise estatística e representação gráfica dos resultados. Todo o procedimento é relativamente simples e fácil e, dependendo do número de amostras a serem perfiladas e o número de máquinas de PCR em tempo real disponíveis, também relativamente rápidos. A parte experimental requer precisão na manipulaçãoRNA e pipetagem em placas de 384 poços, enquanto a seção de análise de dados usando GenEx requer alguns conhecimentos básicos em informática e estatística.

Protocol

O protocolo a seguir descreve o procedimento padrão para isolar RNA de LCR e de perfil microRNAs usando placas de PCR prontos. Note-se que a extracção de fase orgânica é opcional, e que um ARN transportador é adicionado à amostra durante a extracção para assegurar a recuperação máxima de ARN. Consequentemente, não há necessidade de quantificar o ARN. Em geral, a média de 6-8 placas pode ser executado no mesmo dia que o cDNA é sintetizado no dia anterior (cerca de 2 horas). A …

Representative Results

Os resultados deste estudo foram publicados anteriormente 1. Figura 1 mostra os resultados da análise de microRNAs de referência candidatos usando o aplicativo geNorm. Por conseguinte, dois microRNAs, miR-622 e miR-1266, foram identificados como genes de referência e foram usadas para normalizar os valores de miRNA. Para o estudo CSF que tinha três grupos de amostras: VIH-(n = 10), COLMEIA (n = 4), e HIV + sem Encefalite (VIH +, n = …

Discussion

MicroRNAs são pequenos RNAs não codificadores que regulam a expressão de genes, inibindo a tradução e / ou a promoção da degradação do mRNA ^2. Devido à sua elevada estabilidade em condições livres de células, microRNAs foram detectados em muitos fluidos corporais. Além disso, o perfil de expressão de microRNAs distinta tem sido correlacionada com o estágio e / ou progressão em uma variedade de cânceres humanos ^3-9.

Existem várias ferramentas disponív…

Materials

Table III. List of equipment

Equipment	Company	Catalog Number
Finnpipette Novus Multichannel Pipetter	Thermo Scientific	HH05279
Finntip Pipette Tips	Thermo Scientific	9400613
Thermal Cycler C1000	Biorad
0.2 ml Low Profile, Clear PCR tubes	Biorad	TLS0801
Flat Cap Strips	Biorad	TLS0803
LightCycler® 480 Real-Time PCR System	Roche
LightCycler® 480 Sealing Foil	Roche	04 729 757 001
Refrigerated Centrifuge 5804R	Eppendorf
Swing-bucket Rotor, 4-place	Eppendorf	A-4-44
Bench-Top Mini Centrifuge	Fisher	05-090-100
Bench-Top Vortex	Fisher
1.5 ml Microcentrifuge Tubes, Sterilized	Fisher	02-681-5
Matrix Reagent Reservoir, 25 ml	Thermo Scientific	8093
Thermomixer Confort	Eppendorf
Bench-To Mini Centrifuge Sigma 1-15	Sigma
Bench-Top Vortex	Velp Scientifica	F202A0173

Table IV. List of reagents

Reagents	Company	Catalog Number
Universal c-DNA synthesis kit, 16-32 rxns	Exiqon	203300
SYBR Green master mix, Universal RT, 25 ml	Exiqon	203400
Ultrapure Distilled Water Dnase, Rnase free	Invitrogen	10977-015
MicroRNA Ready to use PCR Human Panels (I+II) V2.R	Exiqon	203608
mirVana™ miRNA isolation Kit, 40 isolations	Ambion	AM1556
MS2 RNA carrier	Roche Applied Science	10165948001
2Betamercaptoethanol 98%	Sigma Aldrich	M3148-25ml
Ethanol 100%	Carlo Erba	64-17-5
Nuclease free water	Qiagen	1039480
RNAse Zap®	Ambion	AM9780