Líquido cefalorraquídeo MicroRNA perfiles utilizando cuantitativa en tiempo real PCR
Summary
Se describe un protocolo de PCR en tiempo real para perfilar microRNAs en el líquido cefalorraquídeo (LCR). Con la excepción de los protocolos de extracción de ARN, el procedimiento se puede extender a ARN extraído de otros fluidos corporales, células cultivadas o muestras de tejido.
Abstract
Los microARNs (miRNAs) constituyen una capa potente de la regulación de genes guiando RISC en los sitios diana situados en ARNm y, por consiguiente, mediante la modulación de su represión de traducción. Cambios en la expresión de los genes miARN se han demostrado estar involucrados en el desarrollo de todas las principales enfermedades complejas. Por otra parte, los recientes hallazgos mostraron que los miRNAs pueden ser secretadas al medio extracelular y entran al torrente sanguíneo y otros fluidos corporales en los que pueden circular con alta estabilidad. La función de dicho miRNAs circulantes permanece en gran medida difícil de alcanzar, pero los enfoques de alto rendimiento sistemáticas, tales como arrays miARN perfiles, han llevado a la identificación de los genes miARN firmas en varios estados patológicos, incluyendo los trastornos neurodegenerativos y varios tipos de cánceres. En este contexto, la identificación de perfil de expresión de los genes miARN en el líquido cefalorraquídeo, como se informa en nuestro estudio reciente, hace miRNAs candidatos atractivos para el análisis de biomarcadores.
_content "> Hay varias herramientas disponibles para crear perfiles de microRNAs, como microarrays, cuantitativa en tiempo real PCR (qPCR), y la secuencia de profundidad. A continuación, describimos un método sensible para perfilar microRNAs en líquido cefalorraquídeo por cuantitativa en tiempo real PCR. Nosotros utilizado los Exiqon microARN PCR paneles humanos-listas para usar I y II V2.R, que permite la detección de 742 microARNs humanos únicos. Realizamos los arrays en carreras por triplicado y se procesaron y analizaron los datos utilizando el software de GenEx Professional 5.El uso de este protocolo, se ha perfilado con éxito microRNAs en diversos tipos de líneas celulares y células primarias, CSF, plasma y tejidos embebidos en parafina fijado en formol.
Introduction
Los microARNs pertenecen a la familia de pequeñas (21-23 nt de longitud) RNAs no codificantes que regulan la expresión de genes después de transcriptionally. microARNs pueden secretarse en el espacio extracelular donde parecen ser relativamente estables. Si bien la determinación de los cambios en la expresión de miRNA puede ser un paso importante hacia la identificación de biomarcadores, la realización de perfiles de miARN y el manejo de una gran cantidad de datos puede ser intimidante.
Aquí se describe un protocolo para determinar los cambios en la expresión de miRNA en el líquido cefalorraquídeo (aplicable a otros fluidos corporales) por un tiempo real sensibles PCR. También describe el uso de software para análisis de datos, incluyendo el análisis estadístico y representación gráfica de los resultados. Todo el procedimiento es relativamente fácil y sencillo y, en función del número de muestras que se perfilados y el número de máquinas de PCR en tiempo real disponibles, también relativamente rápidos. La parte experimental requiere precisión en el manejoARN y el pipeteo en placas de 384 pocillos, mientras que la sección de análisis de datos utilizando de GenEx requiere algunos conocimientos básicos en informática y estadística.
Protocol
Representative Results
Discussion
Los microARNs son pequeños RNAs no codificantes que regulan la expresión génica mediante la inhibición de la traducción y / o la promoción de la degradación del mRNA 2. Debido a su alta estabilidad en condiciones libres de células, los microRNAs se han detectado en muchos fluidos corporales. Además, el perfil de expresión distinta de microRNAs se ha correlacionado con la etapa y / o la progresión en una variedad de cánceres humanos 3-9.
Hay varias herramient…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
El proyecto que se describe fue apoyado por el premio número R01MH079751 (PI: F. Peruzzi) del Instituto Nacional de Salud Mental. El contenido es de exclusiva responsabilidad de sus autores y no representa necesariamente las opiniones oficiales del Instituto Nacional de Salud Mental o el Instituto Nacional de Salud.
Materials
Table III. List of equipment
|
Equipment |
Company |
Catalog Number |
|
Finnpipette Novus Multichannel Pipetter |
Thermo Scientific |
HH05279 |
|
Finntip Pipette Tips |
Thermo Scientific |
9400613 |
|
Thermal Cycler C1000 |
Biorad |
|
|
0.2 ml Low Profile, Clear PCR tubes |
Biorad |
TLS0801 |
|
Flat Cap Strips |
Biorad |
TLS0803 |
|
LightCycler® 480 Real-Time PCR System |
Roche |
|
|
LightCycler® 480 Sealing Foil |
Roche |
04 729 757 001 |
|
Refrigerated Centrifuge 5804R |
Eppendorf |
|
|
Swing-bucket Rotor, 4-place |
Eppendorf |
A-4-44 |
|
Bench-Top Mini Centrifuge |
Fisher |
05-090-100 |
|
Bench-Top Vortex |
Fisher |
|
|
1.5 ml Microcentrifuge Tubes, Sterilized |
Fisher |
02-681-5 |
|
Matrix Reagent Reservoir, 25 ml |
Thermo Scientific |
8093 |
|
Thermomixer Confort |
Eppendorf |
|
|
Bench-To Mini Centrifuge Sigma 1-15 |
Sigma |
|
|
Bench-Top Vortex |
Velp Scientifica |
F202A0173 |
Table IV. List of reagents
|
Reagents |
Company |
Catalog Number |
|
Universal c-DNA synthesis kit, 16-32 rxns |
Exiqon |
203300 |
|
SYBR Green master mix, Universal RT, 25 ml |
Exiqon |
203400 |
|
Ultrapure Distilled Water Dnase, Rnase free |
Invitrogen |
10977-015 |
|
MicroRNA Ready to use PCR Human Panels (I+II) V2.R |
Exiqon |
203608 |
|
mirVana™ miRNA isolation Kit, 40 isolations |
Ambion |
AM1556 |
|
MS2 RNA carrier |
Roche Applied Science |
10165948001 |
|
2Betamercaptoethanol 98% |
Sigma Aldrich |
M3148-25ml |
|
Ethanol 100% |
Carlo Erba |
64-17-5 |
|
Nuclease free water |
Qiagen |
1039480 |
|
RNAse Zap® |
Ambion |
AM9780 |
References
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- Krol, J., Loedige, I., Filipowicz, W. The widespread regulation of microRNA biogenesis, function and decay. Nat. Rev. Genet.. 11, 597-610 (2010).
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- De Smaele, E., Ferretti, E., Gulino, A. MicroRNAs as biomarkers for CNS cancer and other disorders. Brain Res. 1338, 100-111 (2010).
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