Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Medicine

Cerebrospinalvätska MikroRNA Profilering Med kvantitativa realtid-PCR

doi: 10.3791/51172 Published: January 22, 2014

Summary

Vi beskriver ett protokoll för realtids-PCR för att profilera mikroRNA i cerebrospinalvätskan (CSF). Med undantag för RNA-extraktion protokoll kan förfarandet utökas till RNA extraherat från andra kroppsvätskor, odlade celler eller vävnadsprover.

Abstract

MikroRNA (miRNA) utgör en potent skikt av genreglering genom att styra RISC till målställen belägna på mRNA och följaktligen genom att modulera deras translations repression. Förändringar i miRNA uttryck har visat sig vara involverad i utvecklingen av alla större komplexa sjukdomar. Dessutom visade nya rön att miRNA kan utsöndras till den extracellulära miljön och in i blodomloppet och andra kroppsvätskor där de kan cirkulera med hög stabilitet. Funktionen för sådana cirkulerande miRNA är i stort sett svårfångade, men systematiska hög genomströmning metoder, till exempel miRNA profilering arrayer, har lett till identifiering av miRNA signaturer i flera sjukdomstillstånd, bland annat neurodegenerativa sjukdomar och flera typer av cancer. I detta sammanhang, såsom rapporteras i vår nyligen genomförd studie, som gör identifiering av miRNA expressionsprofil i cerebrospinalvätskan miRNA attraktiva kandidater för biomarkör analys.

_content "> Det finns flera verktyg för profilering mikroRNA, som microarrays, kvantitativ realtids-PCR (qPCR), och djupa sekvensering. Här beskriver vi en känslig metod för att profilera mikroRNA i cerebrospinal vätska genom kvantitativ realtids-PCR. Vi använde Exiqon mikroRNA färdiga att använda PCR mänskliga paneler I och II V2.R, vilket möjliggör detektion av 742 unika mänskliga mikroRNA. Vi utförde arrayer i trippel körningar och vi bearbetat och analyserat data med hjälp av Genex Professional 5 programvara.

Med användning av detta protokoll har vi framgångsrikt profilerad microRNAs i olika typer av cellinjer och primära celler, CSF, plasma och formalinfixerade paraffininbäddade vävnader.

Introduction

MicroRNAs tillhör familjen av små (21 till 23 nt i längd) icke-kodande RNA-molekyler, som reglerar genuttryck posttranskriptionellt. microRNAs kan utsöndras i det extracellulära utrymmet där de verkar vara relativt stabil. Medan bestämma förändringar i miRNA uttryck kan vara ett viktigt steg mot att identifiera biomarkörer, utföra miRNA profiler och hantera en stor mängd data kan vara skrämmande.

Här beskriver vi ett protokoll för att fastställa förändringar i miRNA uttryck i cerebrospinalvätskan (gäller för andra kroppsvätskor) med en känslig realtids-PCR. Vi beskriver också användningen av mjukvara för dataanalys, inklusive statistisk analys och grafisk presentation av resultaten. Hela förfarandet är relativt enkel och okomplicerad och, beroende på antalet prover som skall profilerade och antalet realtid PCR maskiner tillgängliga, också relativt snabbt. Den experimentella delen kräver noggrannhet vid hanteringRNA och pipett överförs till 384-hålsplattor, medan avsnittet dataanalys med hjälp Genex kräver vissa grundläggande kunskaper i informatik och statistik.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Följande protokoll beskriver standardförfarande för att isolera RNA från CSF och profil mikroRNA som använder färdiga PCR-plattor. Observera att den organiska extraktion fasen är frivilligt, och att en bärare RNA till provet under extraktion garanterar maximal återvinning av RNA. Följaktligen finns det inget behov av att kvantifiera RNA.

Generellt, kan köras i genomsnitt 6-8 plattor i en dag om cDNA syntetiseras dagen före (ca 2 h). Analys av data som utförs när alla prov har profilerad och laddas in i mjukvaran. Beroende på antalet av samplingar / grupper eller deras kombination för jämförelse kan dataanalys kräva från en till flera timmar.

1. RNA-extraktion

RNA-extraktion utfördes från CSF-prover, förvaras frysta vid -80 ° C i alikvoter fram till analys. För denna procedur den Mirvana Paris isoleringskit användes enligt tillverkarens instruTGÄRDER för den totala RNA-isolering. Observera att även om anrikning för små RNA-arter är möjlig med denna sats, är det här steget inte gjort och RNA-extraktion förfarandet avslutas efter det totala RNA isolering steg. Dessutom, även om Mirvana Paris isolering kit (liksom andra kommersiellt tillgängliga RNA isolering kit) inte kräver organisk extraktion, ett protokoll för detta förfarande finns nedan.
Protokollet för RNA-extraktion består av två steg:
1,1. Organisk Extraction (behövs inte om du använder Mirvana Paris RNA-extraktion kit)
1.2.2. Total RNA-isolering

1,1. Organisk extraktion

1.1.1. Förbered reagenser

  1. Lägg till 375 l av 2-merkaptoetanol till 2x denatureringslösning, och förvara den vid 4 ° C.

1.1.2. Förbered GSR

  1. Tina varje alikvot av CSF på is innan RNA-extraktion. Lägg till 1 mikrogram av MS2 RNA bärare till 0,5 ml tinat CSF och försiktigtblanda. Observera att om den organiska extraktionen utelämnas kommer MS2 bärare sättas till provet före RNA-isolering beskrivs i 1.2.2.1 nedan.
  2. Blanda 0,5 ml 2x Denaturing lösning vid rumstemperatur till cerebrospinalvätskan.
  3. Tillsätt 1 ml syra-fenol: kloroform till CSF plus 2x Denaturing Lösning: var noga med att återkallat den nedre fasen innehåller syra-fenol: kloroform, inte vatten buffert som ligger på toppen av blandningen. Dessutom, notera att syra-fenol: kloroform innehåller fenol, som är ett gift och irriterande, använd handskar och annan personlig skyddsutrustning vid arbete med detta reagens.
  4. Vortexa i 30-60 sekunder för att blanda. För enkelhetens skull de 2 ml av prov / denatureringslösning / syra-fenol: kloroform blandning är uppdelade i två 1,5 ml Eppendorf-rör.
  5. Centrifugera i 5 minuter vid maximal hastighet (10.000 xg) i rumstemperatur.
  6. Ta försiktigt bort vatten (övre) fasen utan att störa den undre fasen eller inter och överföra den till enfärskt rör. Anteckna volymen utvanns.

1,2. RNA-isolering

Det rekommenderas att ha en särskild bänk, satt av pipetter, och ställningar för hantering av RNA-prover. Arbetsområdet och verktyg dekontamineras med RNas Zap spray och våtservetter före varje experiment.

1.2.1. Förbered reagenser:

  1. Lägg till 21 ml av 100% etanol till miRNA tvättlösning 1 och 40 ml av 100% etanol till tvättlösning 2/3. Observera att miRNA Tvättlösning 1 innehåller guanidiumtiocyanat som är en potentiellt farlig substans.

1.2.2. Total RNA-isolering

  1. Lägg 1.25 volymer av rumstemperatur 100% etanol till vattenfasen från den organiska utvinning och blanda väl.
  2. Placera en filterpatron i en av Collection Tubes.
  3. Pipette högst 700 pl av lysat / etanolblandning på filterpatron.
  4. Centrifugera i 30 sekunder vid maximalhastighet. Applicera blandningen överstiger 700 pl i på varandra följande ansökningar till samma filter. Kassera genomflödet efter varje centrifugering och spara uppsamlingsröret för tvättstegen.
  5. Applicera 700 l miRNA tvättlösning 1 till filterpatron och centrifugera i 15 sek vid maximal hastighet. Kasta genomflödet från provröret och byt ut filterpatronen i samma provröret.
  6. Applicera 500 l tvättlösning 2/3 och centrifugera i 15 sek vid maximal hastighet. Kasta genomflödet från provröret och byt ut filterpatronen i samma provröret. Applicera ett andra 500 l tvättlösning 2/3 och centrifugera i 15 sek vid maximal hastighet. Kasta genomflödet från provröret och byt ut filterpatronen i samma provröret. Snurra aggregat för en minut vid maximal hastighet för att avlägsna återstående vätska från filtret.
  7. Överför filterpatronen i en färsk samling Tube. Applicera 100 & mu; Il förvärmd (95 ° C) nukleasfritt vatten till centrum av filtret, och stäng locket. Centrifugera i 30 sekunder vid maximal hastighet för att återvinna RNA.
  8. Samla upp eluatet innehåller RNA och förvara den vid -80 ° C för senare ansökningar.
  9. Kvantifiera 1 l av RNA med hjälp av Nanodrop 2000C spektrofotometer. Observera att RNA-kvantifiering kan hoppas över om en RNA-bärare till provet under RNA-extraktion. I detta fall 8 | il av RNA utsattes för cDNA-syntes enligt beskrivning nedan.

2. miRNA profil: QRT-PCR-protokoll

Protokollet för miRNA profilering består av två steg:

  1. Första sträng-cDNA-syntes
  2. Realtids-PCR-amplifiering

2,1. Första sträng-cDNA-syntes

2.1.1. Späd mall-RNA

  1. Justera varje av templatet RNA-prover till en koncentration av 5 ng / ^ il med hjälp av nukleas-fritt vatten. OmRNA har inte kvantifierats (se steg 1.2.2.9), sedan 8 l av RNA används för cDNA-syntes

2.1.2. Förbered reagenser

  1. Tina försiktigt 5x Reaction buffert och nukleas fritt vatten, och omedelbart placera på is.
  2. Blanda genom att vortexa. Resuspendera RNA spike-in genom att tillsätta 40 pl nukleasfritt vatten till röret och blanda genom att vortexa, låt den på is under 15-20 min. Omedelbart före användning, ta bort enzymet mix från frysen, blanda genom att ställa rören och placera på is. Spinn ner alla reagenser.

2.1.3. Omvänd transkriptionsreaktion inställnings

  1. Förbered den erforderliga mängden RT arbetslösning i ett 1,5 ml Eppendorf-rör, eller motsvarande (i de proportioner som anges i tabell 1, med undantag för det RNA-mall), blanda genom att vortexa (1-2 sek vid max hastighet), kortfattat spinn ner ( Vi använder en mini Eppendorf centrifug med fast varvtal, 10 sek) och placera den på is. Observera att UniSp6 RNA spikeIn sätts till provet före RT-reaktionen (se tabell 1).
  2. Fördela RT arbetslösning i nukleas fritt PCR-rör.
  3. Dispensera mall-RNA i varje rör.
    OBS: Kom ihåg att beräkna 10% överskottsvolym / varje reagens för pipettering och / eller robot död volym.
    Reagens Panel I Volym (^ il) Panel I + II Volym (^ il)
    5x reaktionsbuffert 4,4 8,8
    Nukleas fritt vatten 9,9 19,8
    Enzyme mix 2,2 4,4
    UniSp6 RNA Spike-i mallen 1,1 2,2
    Mall totalt RNA (5 ng / ^ il) 4,4 8,8 Total volym 22 44

    Tabell 1. Omvänd transkription reaktion setup.

2.1.4. Blanda och snurra reagenser

  1. Blanda reaktionen genom mild (1-2 sek) virvling för att säkerställa att alla reagens blandas ordentligt. Efter blandning, spinn ner (mini Eppendorf centrifug med fast varvtal, 10 sek).

2.1.5. Inkubera och värme inaktivt

  1. Programmera en PCR-maskin som följer:
  2. Inkubera under 60 minuter vid 42 ° C
  3. Värme inaktivera det omvända transkriptaset i 5 min vid 95 ° C
  4. Omedelbart kyl till 4 ° C
  5. Lagra vid 4 ° C eller fryst
    Notera: protokollet kan avbrytas i detta skede. Den outspädd cDNA kan förvaras vid -20 ° C i upp till fem veckor (tillval lagra vid 4 ° C i upp till 4 dagar).

2.2.1. Förbered reagenser för Real-time PCR

  1. Placera cDNA (från steg 2.1.5) på is.
  2. Tina nukleas fritt vatten och PCR Mästare mix på is. Skydda PCR Master Mix flaskor från ljus genom att täcka dem med aluminiumfolie. Omedelbart före användning, blanda PCR Master Mix genom virvelbildning 1-2 sekunder i en minicentrifug och spinn ner vid 1500 xg i 1 minut.

2.2.2. Kombinera SYBR Gröna Master Mix, vatten, och cDNA och lägga till PCR-plattor

Följande procedur rekommenderas för att undvika låga koncentrationer av cDNA från att fastna i röret yta:

  1. Före borttagning av plattan tätning, kortfattat spinn ner plattan (er) i en kyld centrifug vid 1500 x g under 1 min.
  2. I ett 15 ml koniskt rör, kombinera 2x PCR Master Mix och vatten. Panel I: 2,000 l 2x Master Mix och 1,980 l vatten, Panel I + II: 4,000 l 2x Master Mix och 3,960 μ, L vatten.
  3. Addera 20 pl cDNA (panel I) eller 40 ^ il cDNA (panel I + II) och blanda.
  4. Blanda försiktigt genom att vortexa 1-2 sek och spinn ner i en kyld centrifug vid 1500 xg under 1 minut.
  5. Placera PCR Master Mix / cDNA blanda i en flerkanalig pipett reservoar. Du kan behöva identifiera en reservoar som har längden på multikanalpipett. Detta håller nivån på volymen tillräckligt hög möjliggör lika volym portioner hela flerkanals. Detta är kritiskt mot de sista portioner.
  6. Fördela 10 pl PCR master mix / cDNA mix till varje brunn på 384-brunnar med hjälp av en 16-kanals pipett.
  7. Täta plattan med optisk tätning.
  8. Spin platta kort i en kyld centrifug (1500 xg i 1 min), för att blanda lösningarna och ta bort luftbubblor.

    Notera: experimentet kan pausas på denna punkt. Förvara reaktionerna skyddas från ljus vid 4 ° C i upp till 24 timmar.

2.2.3. Real-Time PCR

Utför realtids-PCR-amplifiering och smältkurvan analyseras med de parametrar som anges i tabell 2.

Processteg Inställningar, Roche LC480
Polymerase Aktivering / Denature 95 ° C, 10 min
Amplifiering 45 Förstärknings cykler vid
95 ° C, 10 sek
60 ° C, 1 min
Ramp-ränta
1,6 ° C / sek
Optisk läsning
Smältkurvanalys Ja

Tabell 2. Real-time PCR cykelförhållanden med hjälp av Roche LightCycler 480.

2,3. Realtids-PCR dataanalys

Realtid PCR-analys av data görs med Exiqon Genex Professional 5.0, efter than rekommenderade instruktioner. Steg-för-steg-manual Genex kan laddas ner på http://www.exiqon.com/ls/Documents/Scientific/Exiqon-data-analysis-guide.pdf
Dataanalys består av tre steg:

  1. Import av data
  2. Förbehandling av data
  3. Statistisk analys

2.3.1. Import av data

  1. I Roche LightCycler 480 väljer du 2: a derivat analysmetod och beräkna CQ värden. Data exporteras som en tabell och sparas som textfiler.
  2. För att importera data, öppen Genex och klicka på Exiqon importguiden knappen och klicka på "Start". Följ instruktionerna för att välja format, instrument och plattlayoutfilen (er). Observera att plattlayoutfiler (Excel-filer) laddas ner från webbplatsen Exiqon ( http://www.exiqon.com/plate-layout-files ).
  3. Vikt Paneler I och II och klicka på "Nästa".
  4. Tabellen genereras efter fil import innehåller fördefinierade kolumner. Prover namn kan redigeras och klassificerings kolumner kan läggas till eller tas bort i detta steg. Klicka på "Nästa" när du är klar.
  5. Spara uppgifterna och ladda till dataredigeraren.

2.3.2. Förbehandling av data

  1. Som rekommenderas av Exiqon och Genex, när man jämför flera plåtar det första du bör göra är att kalibrera data mellan plattorna genom att välja mellanplatta kalibrering från förbehandlings menyn.
  2. Det rekommenderas att köra miRNA matriser i trippel körningar. Om en miRNA inte är närvarande i åtminstone två av tre kopior det kommer att ställas in som nonexpressed.
  3. I nästa steg i förbehandlingen, bestämma en avskuren. Definiera en cut off-värde anger att data med en tröskelcykeln (K t) högre än detta värde kasseras. I föreliggande experiment med cerebrospinalvätskan exemplar, var avskurna satt till 39. Theröre, kommer alla prover med en C t högre än 39 i de tre repliker kastas. Om en miRNA har en C t> 39 för en sond (en replik av tre), kommer att läsa ersätts med medelvärdet av C t för de andra två sonderna, förutsatt att de är båda under 39.
  4. Definiera referensgener. GENEX Professional har möjlighet att utnyttja geNorm och / eller NormFinder att identifiera referensgener. Välj en lista med miRNA som har liknande Cq värden i alla prov och köra geNorm och / eller NormFinder. Enligt denna analys, i exemplet här, miR-622 och miR-1266 hade de mest enhetliga värden över proverna och valdes som referens gener (Figur 1).
  5. Därefter uppgifterna normaliseras med hjälp av referensgener och de erhållna värdena motsvarar den ΔC t
  6. Om cDNA syntesreaktioner utfördes i tre exemplar, på denna punkt värdena skall beräknas.
  7. Validera arket att återflytta tomma och nästan tomma kolumner. I förbehandlings fönstret välj "Validera ark" och än gäller på Ta bort tomma kolumner linje. På raden nedanför, valde den önskade andelen giltiga uppgifter och klicka på Verkställ. Till exempel, välj 100% om du vill jämföra endast miRNA gemensamma för alla prover.
  8. Handtag saknade uppgifter.
    Välj "Uppgift saknas" från Förbehandling menyn och valde ett av alternativen för att hantera saknade uppgifter. Detta steg krävs. Observera att GENEX ger dig fel om du försöker ladda filer som innehåller ohanterade uppgifter som saknas.
  9. Bestäm relativ kvantifiering mellan grupper av prover (dvs.. Experiment kontra kontroll). Relativ kvantifiering bland grupper beräknas med hjälp av ΔΔ C T-metoden. I Genex, klicka på fliken förbehandling och väljer relativ kvantifiering. I fönstret väljer referensgruppen och slå gälla. Observera att för grafiska representationer och / eller för ytterligare statistiska analyser, expression uppgifter bör omvandlas till en logaritmisk skala. I förbehandlings menyn väljer log2.

2.3.3. Statistisk analys

GENEX programvara kan ett brett spektrum av statistiska analyser, bland annat T-test och ANOVA.

  1. Ladda sista mdf-fil i Genex och öppen uppgiftsansvarige. Det är viktigt att välja rätt prover eller grupper av prover för vilka statistiska analyser utförs.
  2. Välj "Statistik" och valde den ikon som motsvarar den önskade testet.
  3. Klicka på "Kör" i kontrollpanelen fönstret. Spara resultat som excel-eller mdf-filer.

2.3.4. Expression profiling

MikroRNA och prover kan klassificeras, klustrade, och visualiseras på värme-kartor och dendrograms, enligt följande

  1. Ladda sista mdf-fil i Genex och öppen uppgiftsansvarige. Använd det här fönstret för att välja och skapa grupper av prover eller miRNA. Klicka på "Apply" när du är klar.
  2. <li> I det övre vänstra hörnet väljer kluster och klicka på ikonen heatmap
  3. I Panelens fönster klicka på "Kör". Den heatmap kan sparas i olika format som tiff eller bmp, det kan också kopieras och ändras efter behov.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Resultat från denna studie har tidigare offentliggjorts 1. Figur 1 visar resultat från analysen av kandidatreferens microRNAsna använder geNorm ansökan. Följaktligen två microRNAs, miR-622 och miR-1266, identifierades som referens gener och användes för att normalisera miRNA värden.

För CSF studien hade vi tre grupper av prov: HIV-(n = 10), HIVE (n = 4), och HIV + utan encefalit (HIV +, n = 5). De två grupperna, bikupor och HIV +, jämfördes med kontroll HIV-gruppen. Efter statistisk analys (avsnitt 2.3.3) expressionsnivåer av elva mikroRNA hittades statistiskt signifikant 1. Figur 2 representerar ett lådagram av denna elva mikroRNA, miR-1203,-1224-3p, -182 *,-19b-2 *, -204,-362-5p, -484, -720, -744 *, -934 och -937. Varje kolumn visar fördelningen av data över proverna inom gruppen (grönt för bikupor och röda för HIV + utan rensphalitis). Whiskers indikera medianen, en första (Q1) och 3 rd (Q3) kvartilen, och de maximala och minimala nonoutliers.

Figur 1
Figur 1. Grafisk bar visar resultat från geNorm tillämpning inom Genex. Tio mikroRNA analyserades som möjliga referens gener och resultat indikerar miR-622 och miR-1266 (röda staplar) som de mest stabilt uttryckta miRNA. Klicka här för att visa en större bild.

Figur 2
Figur 2. Box diagram som visar fördelningen av data feller var och en av de elva miRNA inom grupperna av HIVE (grön) och HIV + utan encefalit (HIV +, röd). Morrhåren i varje kolumn anger medianen, 1 st (Q1, botten av lådan) och 3: e (Q3, topp lådan) kvartiler, högsta och lägsta värden som är nonoutliers (svarta linjer). Klicka här för att visa en större bild.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

MikroRNA är små icke-kodande RNA som reglerar genuttryck genom att hämma översättning och / eller främja mRNA nedbrytning 2. På grund av deras höga stabilitet i cellfria betingelser har microRNAs påvisats i många kroppsvätskor. Vidare har distinkta uttrycksprofilen för microRNAs korrelerats med scenen och / eller progression i ett flertal humana cancrar 3-9.

Det finns flera verktyg för att profilera mikroRNA, inklusive klassiska chip kedjor eller den senaste djupa sekvensering teknik. Emellertid, valde vi att utnyttja en mycket känslig qPCR plattform 10, 11, som har den ytterligare fördelen att de kräver minimal mängd av RNA. Den miRCURY LNA Universal RT mikroRNA PCR-protokoll är optimerat för att använda 20 ng total RNA per 20 ^ cDNA syntes reaktion, 40 ng för hela två-panel array. Att ha möjlighet att använda en liten mängd av RNA är mycket viktigt när man hanterar valuabl e och som är svåra att erhålla kliniska prover såsom CSF eller formalinfixerade paraffininbäddade vävnader 1. Huvudsakligen utnyttjar små mängder av RNA minimera koncentrationen av möjliga inhibitorer är närvarande i provet. Out of Range Ct-värdena för spik-in sannolikt kommer att indikera förekomsten av vissa inhibitorer i provet. Spike-in sonder kan köpas separat för att testa proverna med avseende på förekomst av inhibitorer före miRNA profilering. För detta test är enda realtids-PCR utförs med ökande koncentrationer av RNA (oavsett ng eller fil).

I det nuvarande protokollet, rapporterar vi den organiska fasen extraktion före RNA-isolering. Det bör noteras att många nya RNA-extraktions-kit inte kräver detta förfarande. Exempelvis har vi framgångsrikt profilerad plasma miRNA med hjälp av de miRCURY RNA-isoleringskit biofluids för RNA-extraktion direkt från 200 | il plasma (data visas inte), utan fenol / kloroform-extraktion.

_content "> I allmänhet är det viktigt att utforma experiment i förväg för att bestämma den rätta antalet replikat som behövs för att erhålla statistiskt signifikanta resultat. Antalet replikat kan bero på det antal prov som skall analyseras, och kan bero på den variationer inom de prover eller grupp av prover. För vår studie, som vi använde ett relativt lågt antal prover, 20 totalt, bestämde vi oss för att ställa in cDNA syntes reaktion i tre exemplar. Consulting med biostatistiker innan inrätta experimenten kan vara ett klokt val och rekommenderas starkt.

Definiera C t avskurna värde är viktigt och beror på vilken typ av prov, för högt uttryckta miRNA den kan ställas in mellan 25-35, men för lågt uttryckta miRNA, till exempel våra CSF-prover, kan sättas högre. Ett annat viktigt steg när det gäller dataanalys är valet av referens gen (er). För några tillförlitliga uppgifter (t.ex. miRNA profilering i odlade celler) aglobal normalisering, vilket motsvarar den genomsnittliga C t för alla prover, får användas. Detta är dock inte ett alternativ för prover som CSF som presenterar variationer. På samma sätt kunde vi inte använda som referens gener de miRNA som i allmänhet anses oförändrad i kroppsvätskor. I stället valde vi alla miRNA som visade liknande C-t i alla prover, inklusive repliker, och sprang geNorm analys tillgänglig i Genex (Figur 1). Resultat indikerade miR-1266 och miR-622 som de minst variabelt uttryckta miRNA och de användes som referensgener. Jämförelse av uttryck av miRNA mellan grupperna kan bestämmas med hjälp av relativ kvantifiering verktyg i Genex, vilket följer standardformeln 2 - (Ct-Ctrel). Slutligen kan resultaten visualiseras som värme kartdiagram, grafiska barer eller andra typer av tomter, som lådagram i figur 2. Andra typer av visualisering finns i Genex inkluderar hierarkisk klustring,Self-Organized karta (SOM), och Principal Component Analysis (PCA). Förutom miRNA kan Genex mjukvara användas för analys av andra typer av matriser, såsom långa icke-kodande RNA (lncRNAs) profilering. Plattan layout kan importeras i Excel-format och data kan hanteras som beskrivits för miRNA analys. I själva verket har vi profilerade lncRNAs från primära embryonala mus kortikala neuroner som använder Mirvana miRNA isolering kit som beskrivs i stegen ovan och vi analyserade data med Genex (opublicerade resultat).

Sammanfattningsvis har vi beskrivit ett protokoll för att profilera microRNAs i cerebrospinalvätskan. Med vissa modifieringar relaterade till RNA-extraktion kan förfarandet anpassas till profilen miRNA i andra kroppsvätskor och / eller andra typer av vävnader. Notera att i det förfarande som beskrivs här, är ett steg för organisk extraktion utförs före RNA-isolering. I allmänhet är detta inte nödvändigt vid användning av kommersiellt tillgängliga kit, såsom Mirvana Paris extdiffraktion sats. Dessutom, när utvinna RNA från kroppsvätskor och en bärar-RNA tillsätts till proverna finns det inget behov av att kvantifiera RNA och 2-8 | il RNA utsattes för cDNA-syntes. Från vår erfarenhet och med tanke på de höga kostnaderna för denna typ av experiment, rekommenderar vi att testa några prover först, och därefter samråda med en statistiker för antalet prover / kopior som ska profilerade för att få statistiskt signifikanta resultat.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har ingenting att lämna ut.

Acknowledgments

Projektet beskrivs stöddes av utmärkelsen Number R01MH079751 (PI: F. Peruzzi) från National Institute of Mental Health. Innehållet är ensamt ansvarig för författare och inte nödvändigtvis representerar officiella ståndpunkter National Institute of Mental Health och National Institute of Health.

Materials

Name Company Catalog Number Comments

Table 3. List of equipment.

Finnpipette Novus Multichannel Pipetter

Thermo Scientific

HH05279

Finntip Pipette Tips

Thermo Scientific

9400613

Thermal Cycler C1000

Biorad

0.2 ml Low Profile, Clear PCR tubes

Biorad

TLS0801

Flat Cap Strips

Biorad

TLS0803

LightCycler 480 Real-Time PCR System

Roche

LightCycler 480 Sealing Foil

Roche

04 729 757 001

Refrigerated Centrifuge 5804R

Eppendorf

Swing-bucket Rotor, 4-place

Eppendorf

A-4-44

Bench-Top Mini Centrifuge

Fisher

05-090-100

Bench-Top Vortex

Fisher

1.5 ml Microcentrifuge Tubes, Sterilized

Fisher

02-681-5

Matrix Reagent Reservoir, 25 ml

Thermo Scientific

8093

Thermomixer Confort

Eppendorf

Bench-Top Mini Centrifuge Sigma 1-15

Sigma

Bench-Top Vortex

Velp Scientifica

F202A0173

Table 4. List of reagents.

Universal c-DNA synthesis kit, 16-32 rxns

Exiqon

203300

SYBR Green master mix, Universal RT, 25 ml

Exiqon

203400

Ultrapure Distilled Water Dnase, Rnase free

Invitrogen

10977-015

MicroRNA Ready to use PCR Human Panels (I+II) V2.R

Exiqon

203608

mirVana miRNA isolation Kit, 40 isolations

Ambion

AM1556

MS2 RNA carrier

Roche Applied Science

10165948001

2-mercaptoethanol 98%

Sigma Aldrich

M3148-25ml

Ethanol 100%

Carlo Erba

64-17-5

Nuclease free water

Qiagen

1039480

RNAse Zap

Ambion

AM9780

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Pacifici, M., et al. Cerebrospinal fluid miRNA profile in HIV-encephalitis. J. Cell. Physiol. 10, (2012).
  2. Krol, J., Loedige, I., Filipowicz, W. The widespread regulation of microRNA biogenesis, function and decay. Nat. Rev. Genet.. 11, 597-610 (2010).
  3. Calin, G. A., Croce, C. M. MicroRNA signatures in human cancers. Nat. Rev. Cancer. 6, 857-866 (2006).
  4. Chen, X., et al. Characterization of microRNAs in serum: a novel class of biomarkers for diagnosis of cancer and other diseases. Cell Res. 18, 997-1006 (2008).
  5. De Smaele, E., Ferretti, E., Gulino, A. MicroRNAs as biomarkers for CNS cancer and other disorders. Brain Res. 1338, 100-111 (2010).
  6. Heneghan, H. M., Miller, N., Kerin, M. J. MiRNAs as biomarkers and therapeutic targets in cancer. Curr. Opin. Pharmacol. 10, 543-550 (2010).
  7. Kosaka, N., Iguchi, H., Ochiya, T. Circulating microRNA in body fluid: a new potential biomarker for cancer diagnosis and prognosis. Cancer Sci. 101, 2087-2092 (2010).
  8. Lu, J., et al. MicroRNA expression profiles classify human cancers. Nature. 435, 834-838 (2005).
  9. Shah, A. A., Leidinger, P., Blin, N., Meese, E. miRNA: small molecules as potential novel biomarkers in cancer. Curr. Med. Chem. 17, 4427-4432 (2010).
  10. Blondal, T., et al. Assessing sample and miRNA profile quality in serum and plasma or other biofluids. Methods. 59, 1-6 (2013).
  11. Jensen, S. G., et al. Evaluation of two commercial global miRNA expression profiling platforms for detection of less abundant miRNAs. BMC Genomics. 12, 435 (2011).
Cerebrospinalvätska MikroRNA Profilering Med kvantitativa realtid-PCR
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Pacifici, M., Delbue, S., Kadri, F., Peruzzi, F. Cerebrospinal Fluid MicroRNA Profiling Using Quantitative Real Time PCR. J. Vis. Exp. (83), e51172, doi:10.3791/51172 (2014).More

Pacifici, M., Delbue, S., Kadri, F., Peruzzi, F. Cerebrospinal Fluid MicroRNA Profiling Using Quantitative Real Time PCR. J. Vis. Exp. (83), e51172, doi:10.3791/51172 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter