Cerebrospinalvätska MikroRNA Profilering Med kvantitativa realtid-PCR

Summary

Vi beskriver ett protokoll för realtids-PCR för att profilera mikroRNA i cerebrospinalvätskan (CSF). Med undantag för RNA-extraktion protokoll kan förfarandet utökas till RNA extraherat från andra kroppsvätskor, odlade celler eller vävnadsprover.

Abstract

MikroRNA (miRNA) utgör en potent skikt av genreglering genom att styra RISC till målställen belägna på mRNA och följaktligen genom att modulera deras translations repression. Förändringar i miRNA uttryck har visat sig vara involverad i utvecklingen av alla större komplexa sjukdomar. Dessutom visade nya rön att miRNA kan utsöndras till den extracellulära miljön och in i blodomloppet och andra kroppsvätskor där de kan cirkulera med hög stabilitet. Funktionen för sådana cirkulerande miRNA är i stort sett svårfångade, men systematiska hög genomströmning metoder, till exempel miRNA profilering arrayer, har lett till identifiering av miRNA signaturer i flera sjukdomstillstånd, bland annat neurodegenerativa sjukdomar och flera typer av cancer. I detta sammanhang, såsom rapporteras i vår nyligen genomförd studie, som gör identifiering av miRNA expressionsprofil i cerebrospinalvätskan miRNA attraktiva kandidater för biomarkör analys.

_content "> Det finns flera verktyg för profilering mikroRNA, som microarrays, kvantitativ realtids-PCR (qPCR), och djupa sekvensering. Här beskriver vi en känslig metod för att profilera mikroRNA i cerebrospinal vätska genom kvantitativ realtids-PCR. Vi använde Exiqon mikroRNA färdiga att använda PCR mänskliga paneler I och II V2.R, vilket möjliggör detektion av 742 unika mänskliga mikroRNA. Vi utförde arrayer i trippel körningar och vi bearbetat och analyserat data med hjälp av Genex Professional 5 programvara.

Med användning av detta protokoll har vi framgångsrikt profilerad microRNAs i olika typer av cellinjer och primära celler, CSF, plasma och formalinfixerade paraffininbäddade vävnader.

Introduction

MicroRNAs tillhör familjen av små (21 till 23 nt i längd) icke-kodande RNA-molekyler, som reglerar genuttryck posttranskriptionellt. microRNAs kan utsöndras i det extracellulära utrymmet där de verkar vara relativt stabil. Medan bestämma förändringar i miRNA uttryck kan vara ett viktigt steg mot att identifiera biomarkörer, utföra miRNA profiler och hantera en stor mängd data kan vara skrämmande.

Här beskriver vi ett protokoll för att fastställa förändringar i miRNA uttryck i cerebrospinalvätskan (gäller för andra kroppsvätskor) med en känslig realtids-PCR. Vi beskriver också användningen av mjukvara för dataanalys, inklusive statistisk analys och grafisk presentation av resultaten. Hela förfarandet är relativt enkel och okomplicerad och, beroende på antalet prover som skall profilerade och antalet realtid PCR maskiner tillgängliga, också relativt snabbt. Den experimentella delen kräver noggrannhet vid hanteringRNA och pipett överförs till 384-hålsplattor, medan avsnittet dataanalys med hjälp Genex kräver vissa grundläggande kunskaper i informatik och statistik.

Protocol

Följande protokoll beskriver standardförfarande för att isolera RNA från CSF och profil mikroRNA som använder färdiga PCR-plattor. Observera att den organiska extraktion fasen är frivilligt, och att en bärare RNA till provet under extraktion garanterar maximal återvinning av RNA. Följaktligen finns det inget behov av att kvantifiera RNA. Generellt, kan köras i genomsnitt 6-8 plattor i en dag om cDNA syntetiseras dagen före (ca 2 h). Analys av data som utförs när alla prov har p…

Representative Results

Resultat från denna studie har tidigare offentliggjorts 1. Figur 1 visar resultat från analysen av kandidatreferens microRNAsna använder geNorm ansökan. Följaktligen två microRNAs, miR-622 och miR-1266, identifierades som referens gener och användes för att normalisera miRNA värden. För CSF studien hade vi tre grupper av prov: HIV-(n = 10), HIVE (n = 4), och HIV + utan encefalit (HIV +, n = 5). De två grupperna, bikupor och HI…

Discussion

MikroRNA är små icke-kodande RNA som reglerar genuttryck genom att hämma översättning och / eller främja mRNA nedbrytning ^2. På grund av deras höga stabilitet i cellfria betingelser har microRNAs påvisats i många kroppsvätskor. Vidare har distinkta uttrycksprofilen för microRNAs korrelerats med scenen och / eller progression i ett flertal humana cancrar ^3-9.

Det finns flera verktyg för att profilera mikroRNA, inklusive klassiska chip kedjor eller den senast…

Materials

Table III. List of equipment

Equipment	Company	Catalog Number
Finnpipette Novus Multichannel Pipetter	Thermo Scientific	HH05279
Finntip Pipette Tips	Thermo Scientific	9400613
Thermal Cycler C1000	Biorad
0.2 ml Low Profile, Clear PCR tubes	Biorad	TLS0801
Flat Cap Strips	Biorad	TLS0803
LightCycler® 480 Real-Time PCR System	Roche
LightCycler® 480 Sealing Foil	Roche	04 729 757 001
Refrigerated Centrifuge 5804R	Eppendorf
Swing-bucket Rotor, 4-place	Eppendorf	A-4-44
Bench-Top Mini Centrifuge	Fisher	05-090-100
Bench-Top Vortex	Fisher
1.5 ml Microcentrifuge Tubes, Sterilized	Fisher	02-681-5
Matrix Reagent Reservoir, 25 ml	Thermo Scientific	8093
Thermomixer Confort	Eppendorf
Bench-To Mini Centrifuge Sigma 1-15	Sigma
Bench-Top Vortex	Velp Scientifica	F202A0173

Table IV. List of reagents

Reagents	Company	Catalog Number
Universal c-DNA synthesis kit, 16-32 rxns	Exiqon	203300
SYBR Green master mix, Universal RT, 25 ml	Exiqon	203400
Ultrapure Distilled Water Dnase, Rnase free	Invitrogen	10977-015
MicroRNA Ready to use PCR Human Panels (I+II) V2.R	Exiqon	203608
mirVana™ miRNA isolation Kit, 40 isolations	Ambion	AM1556
MS2 RNA carrier	Roche Applied Science	10165948001
2Betamercaptoethanol 98%	Sigma Aldrich	M3148-25ml
Ethanol 100%	Carlo Erba	64-17-5
Nuclease free water	Qiagen	1039480
RNAse Zap®	Ambion	AM9780